血清LDH及其同工酶测定 刘湘帆.

Presentation on theme: "血清LDH及其同工酶测定 刘湘帆."— Presentation transcript:

1 血清LDH及其同工酶测定 刘湘帆

2 LDH作用： 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LD或LDH）在辅酶I（NAD+）为氢受体时，催化L-乳酸为丙酮酸。
L-乳酸 丙酮酸 NAD NADH+H+ LDH

3 分布：特异性差 心肌、骨骼肌、肾脏 、肝、脾、胰、肺、肿瘤、 红细胞 肾 ＞ 心肌 ＞ 骨骼肌 ＞ 肝 ＞ 脾 ＞ 胰 ＞ 肺
分布：特异性差 心肌、骨骼肌、肾脏 、肝、脾、胰、肺、肿瘤、 红细胞 肾 ＞ 心肌 ＞ 骨骼肌 ＞ 肝 ＞ 脾 ＞ 胰 ＞ 肺

4 1 方法 (1) 分光光度法 1）利用顺向反应（pH 8.8-9.8）：340nm处连续观察NADH的产生速度。
分光光度法能利用顺、逆双相反应，线性范围较广。但要求保持测定体系于最适温度下，否则会影响测定的准确性。

5 (2)比色法测定LD总活性 1） 原理： 乳酸脱氢酶（LD） 乳酸 丙酮酸 丙酮酸 2,4-二硝基苯肼 丙酮酸-二硝基苯腙
乳酸 丙酮酸 丙酮酸 2,4-二硝基苯肼 丙酮酸-二硝基苯腙 碱性溶液中呈棕红色颜色的深浅与丙酮酸的浓度呈正比。

6 2） 试剂： 基质缓冲液（pH 8.8） NAD+溶液（11.3mmol/L） 丙酮酸标准液（0.5mmol/L） 2,4-二硝基苯肼溶液（1mmol/L） 氢氧化钠溶液（0.4mmol/L）

7 单位定义： 以100ml血清，37℃与基质作用15min，生成1umol丙酮酸为一个金氏单位。 参考值： 血清LD： 金氏单位。

8 3)操作步骤 1 LD活性测定 加入物 对照管 测定管 血清 - 0.05 基质缓冲液 0.5 0.5 混匀，放37°C水浴5min
加入物 对照管 测定管 血清 基质缓冲液 混匀，放37°C水浴5min NAD+溶液 混匀，放37°C水浴15min 2，4-二硝基苯肼溶液 NAD+溶液 0.4mol/LNaOH ※室温放置5min进行比色，波长440nm

9 2 LD校正曲线制作 加入物（ml） B 1 2 3 4 丙酮酸标准液 0 0.05 0.1 0.15 0.20
丙酮酸标准液 基质缓冲液 蒸馏水 2,4二硝基苯肼 混匀，放37°C水浴15min 0.4mol/LNaOH LD活性单位

10 临床意义 ①心肌损害： 心肌梗塞、充血性心衰、心肌炎 ②肝脏疾病:病毒性肝炎、肝硬化、原发性肝癌
③其它:骨骼肌的损伤、恶性肿瘤（白血病、淋巴瘤等）、肺梗塞等

11 注意事项： ①标本不能溶血，也不能用草酸盐抗凝血。 ②由于LD4，LD5对冷不稳定，不宜冰箱存放，血清标本在室温下可稳定2-3天。

12 LD同工酶的测定

13 LD同工酶 H亚单位 心肌 M亚单位 肌肉 LD1 （H4） 心肌 LD2 （H3M） 心肌 LD3 （H2M2） 肺、脾 LD4 （HM3） 肝、骨骼肌 LD5 （M4） 肝、骨骼肌 正常成人：LD2>LD1>LD3>LD4>LD5

14 人体某些组织中LDH同工酶电泳图谱 LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5
心肌 红细胞 肾上腺 骨骼肌 肝 总之：复基因位点同工酶在生物体内可以各个同工酶独自存在，也可以以杂化体形式存在。

15 LD1 LD2 LD3 LD4 LD5 H M

16 二、测定方法： 柱层析法 免疫化学法 热稳定性和抑制法 *电泳法： 醋酸纤维素薄膜 聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖

17 原理： 根据LD同工酶一级结构和等电点的差异，在一定电泳条件下，使LD在支持物上被分离。 乳酸脱氢酶（LD） 乳酸 丙酮酸

18 当有LD活性的区带存在即显紫红色，颜色深浅与酶活性成正比，借助于扫描仪或光密度仪，可进一步求出相对含量。
NADH + 氧化型PMS 还原型PMS + NAD+ 还原型PMS + 四氮唑盐类 氧化型PMS + 甲臢 当有LD活性的区带存在即显紫红色，颜色深浅与酶活性成正比，借助于扫描仪或光密度仪，可进一步求出相对含量。

19 （-） （+） 例如，LDH同工酶 LDH2、LDH3、LDH4、LDH5都比LDH1有较多的碱性氨基酸，在pH8.6的巴比妥缓冲液中LDH1带有更多的负电荷，因而向阳性泳动最快。

20 试剂： 巴比妥缓冲液（pH 8.6） 巴比妥盐酸缓冲液（0.082mol/L， pH 8.2） EDTA-Na2溶液（10mmol/L） 缓冲琼脂糖凝胶（8g/L和 5g/L） 底物显色液和固定漂洗液

21 （3）操作 ①凝胶板制备 ②加样 ③电泳 ④显色 ⑤固定和漂洗

22 （4）计算： A总（吸光度总和）= A1 + A2 + A3 + A4 + A5 （A1~A5 相应为LD同工酶LD1~LD5的吸光度。）
LD1 = A 1/ A总 × 100% LD2 = A 2/ A总 × 100% LD3 = A 3/ A总 × 100% LD4 = A 4/ A总 × 100% LD5 = A5 / A总 × 100%

23 临床意义 ①心脏疾病 心肌梗塞 LD1 ＞ LD2 充血性心衰，心肌炎 LD1 ＞ LD2 ②肝脏疾病 病毒性肝炎 LD5 ＞LD4
③恶性肿瘤 白血病、结肠癌等 LD3↑，LD3＞LD1 ④肌肉疾病 肌肉损伤、肌萎缩 LD5↑

24 注意事项 ①不宜用溶血标本。 ②严格控制温度（LD4和LD5，特别是LD5对热敏感，如底物显色液温度超过50℃，LD5易失活）。
③底物显色液需避光保存，因PMS对光敏感，否则显色后的凝胶板背景颜色深而影响结果。 ④LD同工酶对冷的敏感性不同，尤其是LD5对冷不稳定。因此血清标本应该放室温保存

25

26 CK及其同工酶的检测

27

28 分布 骨骼肌 心肌 脑组织 平滑肌（胃肠道、子宫） 在肝及红细胞中测不到CK的活性。

29 原理 Creatine Kinase （CK, EC ， ATP:肌酸磷酸转移酶） pH9.0 ATP 肌酸　 ←──→ 磷酸肌酸 ADP pH CK: MM, MB, BB, Mt MW

30 ADP + 磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸激酶 丙酮酸 + ATP 丙酮酸-2，4-二硝基苯腙

31 肌酸、ATP、丙酮酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸
实验操作 加入物 B S U 血清 标准 （1mmol/L;200U/L） H2O 酶试剂 37℃ 15min DNP O NaOH 室温 5min nm比色 肌酸、ATP、丙酮酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸

32 临床意义 （1）引起血清CK活性升高的疾病 1）心脏疾病： 急性心肌梗塞 （病毒性）心肌炎 心外膜炎

33 2）肌性疾病： 进行性肌营养不良、多发性肌炎、皮肌炎 肌萎缩 3）中枢神经系统疾病 脑血管意外、脑膜炎、颅脑外伤 4）肺疾病 肺栓塞等

34 （2）引起血清CK活性降低的疾病（较少） 甲状腺功能亢进 全身性红斑狼疮 严重感染、败血症等

35 7、注意事项 （1）本实验的许多试剂都易失效，故最好在每次实验前临时配制。 （2）肌酸呈色不稳定，振荡充分与否直接影响呈色的深浅及过程，用旋涡混合器充分振荡15s，37℃水浴5min后，颜色可达最高点，并持续30min以上。

36 CK同工酶

37 CK同工酶测定原理 磷酸肌酸 ＋ ADP CK 肌酸 ＋ ATP ATP ＋ 葡萄糖 己糖激酶 葡萄糖-6-磷酸 ＋ ADP 葡萄糖-6-磷酸 ＋ NADP 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 6-磷酸葡萄糖酸 ＋ NADPH ＋ H+

38 CK-MB测定 1. 电泳法测定CK-MB  琼脂糖介质，醋酸纤维素薄膜 酶定位: CK-BB ─ 白蛋白区 CK-MB ─α2 ～β区 CK-MM ─ γ区 CK-Mt ─γ后 参考值： CK-BB % CK-MB ～ 3% CK-MM ～ 100% CK-Mt % CK-MB 阳性决定水平为5%

39 试剂 （1）50mmol/L Tis-巴比妥缓冲液（pH 8.0） （2）30mmol/L Tis-巴比妥缓冲液（pH 8.6） （3）5g/L 琼脂糖 （4）400mmol/L Bis-Tis缓冲液（pH 7.0） （5）辅酶溶液 （6）底物显色液 （7）混合底物显色液

40 操作 （1）制备凝胶玻片 （2）加样 （3）电泳 （4）显色 （5）固定和漂洗 （6）观察结果

41 参考值 （1）CK-BB： 0% （2）CK-MB： 0% ~ 3% （3）CK-MM： 97% ~100% （4）CK-Mt： 0%

42 引起CK-BB升高的疾病 急性颅脑外伤 脑血管疾病 急性细菌性脑膜炎 引起CK-BM升高的疾病 急性心肌梗塞 心肌炎 进行性肌营养不良

43 注意事项 （1）电泳需较高的pH值，酶反应需较低pH。
（2）CK不稳定，对光、热及高pH敏感，最好将及时分出的血清充CO2后塞紧管口，置冰室或-30℃保存，至少可稳定半个月，及时测定效果更好。 （3）血清CK活性随温度升高而升高，直至45℃，更高温度时CK活性迅速下降，56℃很快失活，琼脂糖电泳法测CK同工酶时，决不能像作LD同工酶用温度较高的琼脂糖底物显色液，否则CK活性丧失，而非脱氢酶（NDH）反应显著。

44 CK-MM亚型 CK-MM亚型: MM3─基因型、组织型 M2M MM2─ -Lys M1M MM1─ -2 Lys M1M1 CK-MB亚型: CK-MB1－ -2Lys, CK-MB2（组织型）

45 CK-MM亚型电泳法测定原理 在电泳缓冲液中加入Polybuffer, 通电后形成一pH梯度，进行等电聚胶电泳，自阳极至阴极依次为CK-MM1、CK-MM2和CK-MM3。然后以常规CK同工酶电泳法原理进一步定量。 参考值　CK-MM ±4.7% CK-MM ±5.3% CK-MM ±2.5% CK-MM3/CK-MM ±0.05（ ）

46 心肌酶谱测定的临床意义 1．诊断心肌坏死和损伤 （1）早期诊断心肌梗死 心肌酶 初次升高的 峰值时间 回复正常 通常采样 时间范围(h) (非溶栓) 时间 时间表 CK ～5d CK-MB 3～ h 48～72h 每12h*一次×3 CK-MM3 1～ h h 胸痛后60min～90min CK-MB2 2～ h 未知 同上 LDH ～ d 7～14d LDH ～ ～48h 10～14d 胸痛后24h一次 AST ～ ～ ～5d ASTm h d 胸痛后12h一次×3

47 心肌梗死诊断的实验室指标的特性 －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
实验室 分子量 生理半衰期 升高时间 峰值时间 恢复正常时间 指标 (KD) (h) (h) (h) (d) CK ~ ~ ~4 CK-MB活性 ~ ~ ~3 CK-MB质量 ~ ~ 心肌梗死诊断的实验室指标的特性

48 指 标 -----------------------------
早期急性心肌梗死的诊断灵敏度 －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ 胸痛后时间(h) 指 标 0～ ～ ～6 CK CK-MB活性 CK-MB质量

49 1．诊断心肌坏死和损伤 （1）早期诊断心肌梗塞 （2）有助于非Q波急性心肌梗死的诊断 （3）诊断梗塞延展或再梗死 （4）估计心肌梗死面积 （5）围手术期和围产期心肌损伤的诊断 （6）监护心肌损害或药物对心肌的损害

50 2．判断心肌再灌注 心肌酶 建议标准 敏感性（%） 特异性（%） CK 达峰值时间<4h 达峰值时间<16h CK-MM亚型 CK-MM3下降率>3.1%/h ～ min内CK-MM3/CK-MM1> CK-MM3升高率>0.18%/min CK-MB 1h升高率>0.04UL-1min 下壁心梗90min后增加2.2倍 前壁心梗90min后增加2.5倍 CK-MB亚型 2h CK-MB2/CK-MB1峰值>