第一节 什么是青霉素.

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1 第一节 什么是青霉素

2 青霉素 青霉素（Benzylpenicillin /Penicillin）又被称为青霉素G、peillin G、 盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称。 青霉素的结构式

3 化学式 青霉素 化学本质：盐酸巴氨西林。其化学名为1-乙氧甲酰乙氧6-〔D(-)-2-氨基-2-乙酰氨基〕青霉烷酸盐酸盐。
分子式：C16H18N3O4S·HCl 分子量：384.5 青霉素它不能耐受耐药菌株(如耐药金葡)所产生的酶，易被其破坏，且其抗菌谱较窄，主要对革兰氏阳性菌有效。青霉素G有钾盐、钠盐之分，钾盐不仅不能直接静注，静脉滴注时，也要仔细计算钾离子量，以免注入人体形成高血钾而抑制心脏功能，造成死亡。

4 药理学 内服易被胃酸和消化酶破坏。肌注或皮下注射后吸收较快，15～30min达血药峰浓度。青霉素在体内半衰期较短，主要以原形从尿中排出。
　　青霉素药理作用是干扰细菌细胞壁的合成。青霉素的结构与细胞壁的成分粘肽结构中的D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可与后者竞争转肽酶，阻碍粘肽的形成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。 　　对革兰阳性球菌及革兰阳性杆菌、螺旋体、梭状芽孢杆菌、放线菌以及部分拟杆菌有抗菌作用。 　　青霉素对溶血性链球菌等链球菌属，肺炎链球菌和不产青霉素酶的葡萄球菌具有良好抗菌作用。对肠球菌有中等度抗菌作用，淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、白喉棒状杆菌、炭疽芽孢杆菌、牛型放线菌、念珠状链杆菌、李斯特菌、钩端螺旋体和梅毒螺旋体对本品敏感。本品对流感嗜血杆菌和百日咳鲍特氏菌亦具一定抗菌活性，其他革兰阴性需氧或兼性厌氧菌对本品敏感性差.本品对梭状芽孢杆菌属、消化链球菌、厌氧菌以及产黑色素拟杆菌等具良好抗菌作用，对脆弱拟杆菌的抗菌作用差。青霉素通过抑制细菌细胞壁四肽侧链和五肽交连桥的结合而阻碍细胞壁合成而发挥杀菌作用。对革兰阳性菌有效，由于革兰阴性菌缺乏五肽交连桥而青霉素对其作用不大。

5 可以用青霉素的疾病 1．流行性脑脊髓膜炎 2．放线菌病 3．淋病 4．奋森咽峡炎 5．莱姆病 6．多杀巴斯德菌感染 7．鼠咬热
8．李斯特菌感染 9．除脆弱拟杆菌以外的许多厌氧菌感染

6 青霉素生产工艺过程 菌种→孢子制备→种子→发酵→提取→精制→成品检验→包装→分装→（应用→跟踪→质量分析） 1．菌种的选育技术：
（1）杂交育种（2）原生质体融合 （3）基因工程（4）新抗生素产生菌获得 2．菌种保藏： （1）定期移植保存法 （2）液体石蜡封藏法 （3）真空冷冻干燥保藏法 （4）液氮超低温保藏法 （5）沙土管保藏法 （6）麦皮保藏法

7 3培养基种类：（1）固体培养基（2）液体培养基
4影响培养液的因素：（1）原材料质量的影响 (2)水质的影响 (3)灭菌操作 (4)培养基粘度的影响 5发酵设备灭菌： (1)实罐灭菌：{1．预热（80～90℃） 2．直热（蒸汽）（120℃、30min）（全进全出原则） 3．待空气压力高于罐内压力时，通入空气。} (2)空罐灭菌：130℃，45～60min，直接蒸汽法 (3)连续灭菌：配料（预热）。冷却系统水应排净（夹套与盘管）→连消塔→维持罐→冷却管→无菌培养基。 (4)空气过滤除菌

8 6.发酵过程控制： 7.发酵液的预处理和液固分离：
(1)碳源浓度变化及其控制(2)氮源浓度变化及其控制(3)补无机盐、前体 (4)溶氧浓度的变化和控制 (5)温度控制 (6)pH控制 (7)泡沫控制 (8)发酵终点的判断 (9)发酵异常处理 7.发酵液的预处理和液固分离： (1)稳定性{1． 对pH的稳定性，如：青霉素酸性不稳定；多粘菌素酸性稳定；红霉素酸性不稳定，但碱性稳定。 对温度的稳定性，如：杆菌肽、灰黄霉素可在90~100℃下加热过滤；而四环素、青霉素则需低温处理（15~18℃）} (2)提取工艺对滤液质量的要求{1．离子交换法 2．溶酶萃取法 3．沉淀法 }

9 (3)发酵液预处理方法: A.菌体和蛋白质处理{1．等电点沉淀 2．变性沉淀（热变性沉淀）3．加各种沉淀剂沉淀：重金属离子（Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Pb2+等）和阴离子（三氯乙酸、水杨酸、钨酸等） 4．加入凝聚剂：Al2(SO4)3•18H2O、AlCl3•6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等 5．加入絮凝剂，如酰胺类 6.吸附法：加入黄血盐和硫酸锌生成亚铁氰化锌钾 7.酶解法去除不溶性多糖：酶解不溶性多糖和蛋白质。} B.高价金属离子的去除{1.离子交换法：土霉素、四环素，用122＃树脂除Fe3＋和色素头孢菌素C滤液用S×14，除去部分阳离子，同时释放出H＋，除去破头N ．沉淀法：加草酸除Ca2+加黄血盐除铁4Fe3++3K4Fe(CN)6→Fe4[Fe(CN)6] 3 ↓+12K+.} C.发酵液的液固分离 设备：1．压滤设备：板框 2．吸滤设备：真空鼓式吸滤机（自动化） 3．离心过滤设备：框式离心机

10 (4)影响液固分离的因素 1.微生物的种类：细菌、放线菌、霉菌、酵母 2.发酵液的特性（粘度） 3.pH、温度等

11 青霉素提炼工艺流程图 发酵液 → 预处理液 → 板框过滤 → 滤液 → 储罐 → BA提取 → 脱色 → 过滤 → BA脱色液 → 结晶 → 离心分离 → 含１％水重液回收溶媒的异丙醇洗涤 → 甩滤 → 无水异丙醇洗涤 → 甩干 → 摇摆机粉碎 → 烘干 → 工业钾盐成品

12 第三部分 青霉素菌种发酵工艺的原理 更多PPT模板免费下载，敬请登陆→管理资源吧（

13 一、总述 青霉素发酵——将青霉菌接种到固体培养基上培养一段时间，得到青霉菌孢子培养物。用无菌水将孢子制成悬浮液接种到种子罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气搅拌，培养。然后将种子培养液接种到发酵罐已灭菌的含有苯乙酸前体的培养基中，通入无菌空气搅拌，培养。

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15 二、工艺流程图 （1）丝状菌三级发酵工艺流程 冷冻管（25°C，孢子培养，7天）——斜面母瓶（25°C，孢子培养，7天）——大米孢子（26°C，种子培养56h）——一级种子培养液（27°C，种子培养，24h）——二级种子培养液（27~26°C,发酵,7天）——发酵液。 （2）球状菌二级发酵工艺流程 冷冻管（25°C，孢子培养，6~8天）——亲米（25°C，孢子培养，8~10天）——生产米（28°C，孢子培养，56~60h）——种子培养液（26~25-24°C，发酵，7天）——发酵液。

16 三、青霉素发酵过程 青霉素发酵时，青霉素生产菌在合适的培养基、PH、温度和通气搅拌等发酵条件下进行生长并合成青霉素。
发酵开始前，有关设备和培养基（主要是碳源、氮源、前体和无机盐等）必须先经过灭菌，后接入种子。 在整个过程中，需要不断通气和搅拌，维持一定的罐温和罐压，在发酵过程中往往要加入泡沫剂，假如酸碱控制发酵液的PH，还需要间歇或连续的加入葡萄糖及铵盐等化合物以补充碳源及氮源，或补进其他料液和前体等以促进青霉素的生产。

17 青霉素发酵过程中的代谢变化分为菌体生长、青霉素合成和菌体自溶三个阶段。
菌体生长阶段：发酵培养基接种后生产菌在合适的环境中经过短时间的适应，即开始发育、生长和繁殖，直至达到菌体的临界浓度。 青霉素合成阶段：这个阶段主要合成青霉素，青霉素的生产速率达到最大，并一直维持到青霉素合成能力衰退。在这个阶段，菌体重量有所增加，但产生菌的呼吸强度一般无显著变化。 菌体自溶阶段：这个阶段菌体衰老，细胞开始自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生产速率下降，氨基氮增加，PH上升。

18 四、生产原理

19 （1）发酵过程的工艺控制

20 基质浓度：在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，后期基质浓度低，对生物合成酶系产生阻遏或对菌丝生长产生抑制。为了避免这一现象,在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法,即对容易产生抑制和限制作用的基质维持一定的最适浓度。 温度：青霉素发酵的最适温度一般认为应在25 °C 左右。温度过高将明显降低发酵产率,同时增加葡萄糖的维持消耗, 降低葡萄糖至青霉素的转化率。

21 pH值：青霉素发酵的最适pH 值一般认为在6.5左右, 应尽量避免 pH 值超过7.0。因为青霉素在碱性条件下不稳定,容易加速其水解。
溶氧:对于好氧的青霉素发酵来说,溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到30%饱和度以下时,青霉素产率急剧下降,低于10%饱和度时,则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高,说明菌丝生长不良或加糖率过低,造成呼吸强度下降,同样影响生产能力的发挥。

22 菌丝浓度：发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度, 从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。
菌丝生长速度：在葡萄糖限制生长的条件下，当比生长速率低于0.015h-1时，比生产速率与比生长速率成正比。因此, 要在发酵过程中达到并维持最大比生产速率,必须使比生长速率不低0.015h-1。 菌丝形态：青霉素产生菌分化主要呈丝状生长和结球生长两种形态。在丝状菌发酵中, 控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度, 并避免结球 , 是获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中, 使菌丝球保持适当大小和松紧,并尽量减少游离菌丝的含量, 也是充分发挥其生产能力的关键素之一。

23 （2）发酵培养基介绍 碳源：为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的碳成分；为合成目的产物提供所需的碳成分。
氮源：是供应菌体合成氨基酸和三肽的原料，以进一步合成青霉素。有机氮源还可以提供一部分有机磷，供菌体生长。无机氮等可适量使用。

24 碳酸钙：用来中和发酵过程中产生的杂酸，并控制发酵液的pH值。
苯乙酸/苯乙酰胺：可以借酰基转移的作用，将苯乙酸转入青霉素分子，提高青霉素的生产强度。 P和S：为菌体提供营养的无机磷源一般采用磷酸二氢钾。另外加入硫代硫酸钠或硫酸钠以提供青霉素分子中所需的硫。

25 另外，由于在发酵过程中二氧化碳的不断产生，加上培养基中有很多有机氮源含有蛋白质，因此在发酵罐内会产生大量泡沫，如不严加控制，就会产生发酵液逃液，导致染菌的后果。采用植物油消沫是个好方法，一方面作为消沫剂，另一方面还可以起到碳源作用。 由于现在还有一些工厂采用铁罐发酵，在发酵过程中铁离子便逐渐进入发酵液。发酵时间愈长，则铁离子愈多。铁离子过多会影响青霉素的合成。采用铁络合剂以抑制铁离子的影响，但实际对青霉素产量并无改进。所以青霉素的发酵罐采用不锈钢制造为宜。

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27 第二节 氨基酸生产工艺

28 氨基酸是构成蛋白成分 目前世界上可用发酵法生产氨基酸有20多种。

29 氨基酸 α 碳原子分别以共价键连接氢原子、羧基和氨基及侧链。侧链不同，氨基酸的性质不同。

30 氨基酸的用途 1.食品工业： 强化食品(赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小麦中) 增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸
苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜味剂(α-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此产品1981年获FDA批准,现在每年产量已达数万吨。

31 2.饲料工业： 甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料 3.医药工业： 多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调 苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。 4.化学工业：谷氨基钠作洗涤剂,丙氨酸制造丙氨酸纤维。

32 氨基酸的生产方法 发酵法： 直接发酵法：野生菌株发酵、营养缺陷型突变发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、抗氨基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株发酵和营养缺陷型回复突变株发酵。 添加前体法

33 酶法：利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸。
提取法：蛋白质水解，从水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。 传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成本高,工艺复杂,难以达到工业化生产的目的。

34 生产氨基酸的大国为日本和德国。 日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。 日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。

35 国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。
在80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品,1991年销售量为二千万瓶,1996年达六千万瓶,主要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯,昆明康普莱特,但生产原料都依赖进口。 据专家估计,到2000年,世界氨基酸产值可达45亿美元,占生物技术市场的7%,国内的氨基酸产值可达40亿元,占全国发酵产业总产值的12%。

36 氨基酸发酵生产发展的历史回顾 所谓氨基酸发酵,就是以糖类和铵盐为主要原料的培养基中培养微生物,积累特定的氨基酸。
这些方法成立的一个重要原因是使用选育成的氨基酸生物合成高能力的菌株。

37 菌株的育种 从自然界中筛选有产酸能力的菌株,并建立其培养条件.
在确立突变技术和阐明氨基酸生物合成系统调节机制的基础上发展为营养缺陷变异株、抗药性菌株的育种。 随着重组DNA技术的发展,接合、转导、转染、细胞融合等手段首先用于体内基因重组,是早期用基因重组方法构建生产菌株的尝试。 随着载体、受体系统的构建及体外基因重组技术的日益完善,氨基酸生物工程菌的构建有了长足的发展。 苏氨酸等的生产菌株被成功地构建并应用于工业化生产。

38 2.1 用野生株的方法 这是从自然界获得的分离菌株进行发酵生产的一种方法。 典型的例子就是谷氨酸发酵。
2.1　用野生株的方法 这是从自然界获得的分离菌株进行发酵生产的一种方法。 典型的例子就是谷氨酸发酵。 改变培养条件的发酵转换法中,有变化铵离子浓度、磷酸浓度，使谷氨酸转向谷氨酰胺和缬氨酸发酵

39 2.2　用营养缺陷变异株的方法 这一方法是诱变出菌体内氨基酸生物合成某步反应阻遏的营养缺陷型变异体，使生物合成在中途停止，不让最终产物起控制作用。 这种方法中有用高丝氨酸缺陷株的赖氨酸发酵，有用精氨酸缺陷株的鸟氨酸发酵，还有用异亮氨酸缺陷株的脯氨酸发酵。

40 2.3　类似物抗性变异株的方法 用一种与自己想获得的氨基酸结构相类似的化合物加入培养基内，使其发生控制作用，从而抑制微生物的生长。这样，就可以得到在这种培养基中能够生长的变异株，而这种变异株正是解除了调控机制的，能够生成过量的氨基酸。 利用此方法发酵的有:苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、组氨酸和精氨酸。

41 2.4 体内及体外基因重组的方法 基因工程包括细胞内基因重组方法和试管内的体外基因重组方法。
2.4 体内及体外基因重组的方法 基因工程包括细胞内基因重组方法和试管内的体外基因重组方法。 体内基因重组在应用上又称为杂交育种，主要方法包括：转化、转染、接合转移、转导和细胞融合等，这都是在细胞内暂时地产生染色体的局部二倍体，在两条DNA链之间引起两次以上的交叉，是遗传性重组现象。 细胞内基因重组技术的缺点是，现在只在同种或有近缘关系的微生物之间进行并较难成功。

42 代谢工程在阐明代谢途径及其调控规律的基础上，应用重组DNA技术可以改变代谢途径分支点上的流量或引入新的代谢步骤与构建新的代谢网络。
其主要步骤为: 鉴定目标代谢途径涉及的酶(特别是限速酶); 取得酶基因，必要时可用蛋白质工程技术，如定点诱变，基因剪接等，使蛋白具有新的特点(增强活性或稳定性、解除反馈抑制等); 将一种或多种异源的或改造后的酶基因与调节元件一起克隆进目标生物; 使调节元件的作用及培育条件最优化。

43 3.1 载体-受体系统及克隆表达的研究 3.1.1 受体的获得
3.1　载体-受体系统及克隆表达的研究 3.1.1　受体的获得 目前使用的氨基酸工程菌受体主要是大肠杆菌K-12及棒状杆菌家族，通常是通过诱变选育出的基础产率较高的菌株。 大肠杆菌遗传背景研究得清楚，载体系统完善，利于工程菌的构建，但它含有内毒素且不能将蛋白产物分泌至胞外，为应用带来困难。 棒状杆菌能克服这两个缺点，但载体受体系统研究较晚且有限制修饰系统的障碍，所以获得利于外源基因导入及表达且能稳定遗传的受体菌是尚待解决的问题。

44 3.1.2 载体的构建 有效的载体需要有在受体菌中可启动的复制起始位点，这可从棒状杆菌家族内源小质粒中获得;
3.1.2　载体的构建 有效的载体需要有在受体菌中可启动的复制起始位点，这可从棒状杆菌家族内源小质粒中获得; 载体所需的筛选标记及外源基因插入的多克隆位点，可从常用的克隆载体中获得。

45 3.1.3 基因转移手段 由于棒状杆菌是革兰氏阳性菌，CaCl2转化法对它不适用。 通常采用的方法有:原生质体转化、转导，电转化，接合转移。
3.1.3　基因转移手段 由于棒状杆菌是革兰氏阳性菌，CaCl2转化法对它不适用。 通常采用的方法有:原生质体转化、转导，电转化，接合转移。 原生质体转化的方法是较早采用的方法，由于受到原生质体再生条件的局限，效率不高; 电转化方法由于高效，快速被广泛使用，目前它的转化效率可达到原生质体转化法的100～1000倍。 接合转移可用于基因在亲缘关系远的物种之间的转移，并且可将外源基因整合于染色体上，易于稳定遗传。

46 氨基酸发酵的代谢控制 控制发酵的条件 控制细胞渗透性 控制旁路代谢 降低反馈作用物的浓度 消除终产物的反馈抑制与阻遏作用
促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成

47 控制发酵的条件 专性需氧菌，控制环境条件可改变代谢途径和产物。

48 控制细胞渗透性 生物素、油酸和表面活性剂，引起细胞膜的脂肪酸成分的改变。 青霉素：抑制细胞壁的合成，由于细胞面内外的渗透压而泄露出来。

49 控制旁路代谢

50 降低反馈作用物的浓度 利用营养缺陷型突变株进行氨基酸发酵必须限制所要求的氨基酸的量。 限制精氨酸的浓度可解除反馈抑制，实现鸟氨酸的生物合成。

51 消除终产物的反馈抑制与阻遏作用 使用抗氨基酸结构类似物突变株的方法。

52 促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成 ATP的积累可促进氨基酸的生物合成

53 氨基酸发酵的工艺控制 培养基 pH 温度 氧

54 培养基 1、碳源：淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烃 碳源浓度过高时，对菌体生长不利，氨基酸的转化率降低。
菌种性质、生产氨基酸种类和所采用的发酵操作决定碳源种类

55 2、氮源：铵盐、尿素、氨水； 同时调整pH值。 营养缺陷型添加适量氨基酸主要以添加有机氮源水解液。 需生物素和氨基酸，以玉米浆作氮源。 尿素灭菌时形成磷酸铵镁盐，须单独灭菌。可分批流加。 氨水用pH自动控制连续流加

56 3、合适C/N 氮源用于调整pH。 合成菌体 生成氨基酸，因此比一般微生物发酵的C/N高。

57 4、磷酸盐：对发酵有显著影响。不足时糖代谢受抑制。
5、镁：是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶和羧化酶的激活剂，并促进葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力。 6、钾：促进糖代谢。谷氨酸产酸期钾多利于产酸，钾少利于菌体生长。

58 7、钠：调节渗透压作用，一般在调节pH值时加入。
8、锰：是许多酶的激活剂。 9、铁：是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的活性基的组成分，可促进谷氨酸产生菌的生长。 10、铜离子：对氨基酸发酵有明显毒害作用。

59 生长因子：生物素 作用：影响细胞膜透性和代谢途径。 浓度：过多促进菌体生长，氨基酸产量低。过少菌体生长缓慢，发酵周期长。 与其它培养条件的关系：氧供给不足，生物素过量时，发酵向其它途径转化。 种类：玉米浆、麸皮水解液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜为来源。

60 pH对氨基酸发酵的影响及其控制 作用机理：主要影响酶的活性和菌的代谢。 控制pH方法：流加尿素和氨水

61 控制： （1）菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素，避免pH过高 （2）菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些，以抑制菌体生长。 （3）发酵后期，残糖少，接近放罐时，少加或不加尿素，以免造成氨基酸提取困难。 （4）氨水对pH影响大，应采取连续流加。

62 温度对氨基酸发酵的影响及其控制 菌体生长达一定程度后再开始产生氨基酸，因此菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度是不同的。
菌体生长温度过高，则菌体易衰老，pH高，糖耗慢，周期长，酸产量低。 采取措施：少量多次流加尿素，维持最适生长温度，减少风量等，促进菌体生长。

63 氧对氨基酸发酵的影响及其控制 要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵：生物合成与TCA循环有关。
适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸发酵：菌体呼吸受阻时产量最大。 供氧不足时产酸受轻微影响的天冬氨酸族氨基酸发酵

64 谷氨酸生产工艺 工业化生产开始于由水解小麦面筋或大豆蛋白质而制取。
1957年，日本率先采用微生物发酵法生产，并投入大规模工业化生产，这是被誉为现代发酵工业的重大创举，使发酵工业进入调节代谢的调控阶段。 目前世界产谷氨酸钠30吨/年，占氨基酸总量的2/3。 我国现已有200余家生产，年产量达15万吨，居世界首位。

65 产生菌株特点： 革兰氏阳性 不形成芽胞 没有鞭毛，不能运动 需要生物素作为生长因子 在通气条件下才能产生谷氨酸。

66 谷氨酸生物合成机理： 由三羧酸循环中产生的a-酮戊二酸，在谷氨酸脱氢酶和氢供体存在下进行还原性氨化作用而得到。

67 一、淀粉水解糖的制备：酸水解或酶水解 1、调浆：干淀粉用水调成10-11Bx的淀粉乳，加盐酸 ％至pH1.5。 2、糖化：蒸汽加热，加压糖化25min。冷却至80℃下中和。 3、中和：烧碱中和，至pH 4、脱色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用量为 ％，在70度及酸性条件下搅拌后过滤。

68 酶法糖化：以大米或碎米为原料时采用 大米进行浸泡磨浆，再调成15Bx，调pH6.0，加细菌a-淀粉酶进行液化，85 ℃30min，加糖化酶60 ℃糖化24h，过滤后可供配制培养基。

69 糖蜜原料：不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源，因含丰富的生物素。
预处理方法：活性碳或树脂吸附法和亚硝酸法吸附或破坏生物素。也可以在发酵液中加入表面活性剂吐温60或添加中青霉素。

70 二、菌种扩大培养 1、斜面培养：主要产生菌是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属、节杆菌属。 我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿棒杆菌和北京棒杆菌及各种诱变株。 生长特点：适用于糖质原料，需氧，以生物素为生长因子。 斜面培养基：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成的pH 琼脂培养基，32℃培养18-24h。

71 2、一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH6. 5-6
2、一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH 。1000ml装 ml振荡，32℃ 培养12h。 3、二级种子培养：用种子罐培养，料液量为发酵罐投料体积的1％，用水解糖代替葡萄糖，于32℃ 进行通气搅拌7-10h。种子质量要求：二级种子培养结束时，无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字排列。活菌数为 /ml。

72 三、谷氨酸发酵 1、适应期：尿素分解出氨使pH上升。糖不利用。2-4h。 措施：接种量和发酵条件控制使期缩短。
2、对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降。溶氧急剧下降后维持在一定水平。菌体浓度迅速增大，菌体形态为排列整齐的八字形。不产酸。12h。 措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH，在pH 时流加尿素；维持温度30- 32℃

73 3、菌体生长停止期：谷氨酸合成。 措施：提供必须的氨及pH维持在 。大量通气，控制温度34-37 ℃。 4、发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。 措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐。 发酵周期一般为30h。

74 谷氨酸发酵控制 （1）生物素：作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合在，进而影响磷酯的合成。
当磷酯含量减少到正常时的一半左右时，细胞发生变形，谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发酵液中。 生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸，你谢产物中乳酸和琥珀酸明显增多。

75 （2）种龄和种量的控制 一级种子控制在11-12h，二级控制在7-8h。 种量为1％。过多，菌体娇嫩，不强壮，提前衰老自溶，后期产酸量不高。 （3）pH。 发酵前期，幼龄细胞对pH较敏感，pH过低，菌体生长旺盛，营养成分消耗大，转入正常发酵慢，长菌不长酸。 谷氨酸脱氢酶最适pH为 ，转氨酶最适pH 。在发酵中后期，保持pH不变。过高转为谷氨酰胺，过低氨离子不足。

76 （4）通风：不同种龄、种量，培养基成分，发酵阶段及发酵罐大小要求通风量不同。
在长菌体阶段，通风量过大，生物素缺乏，抑制菌体生长。 在发酵产酸阶段，需要大量通风供氧，以防过量生成乳酸和琥珀酸，但过大通风，则大量积累a-酮戊二酸。

77 防止噬菌体和杂菌的污染 从空气过滤、培养基、设备、环境等环节严格把关。

78 四、谷氨酸的提取 1、等电点法：操作简单，收率60％。周期长，占地面积大。

79 2、离子交换法：用阳离子交换树脂提取吸附谷氨酸形成的阳离子，再用热碱洗脱，收集相应流分，再加盐酸结晶。

80 谷氨酸发酵研究新进展 继续选育各种生化突变菌株：转化率提高，或可在富含生物素的培养基中保持较高产酸水平。提高原料利用率，拓宽原料来源或简化操作工艺。 生物工程新技术的应用：体外DNA重组的基因工程和原生质体融合技术和固定化细胞技术使产量提高近1倍。 改进发酵工艺：开拓原料，改进流加工艺，通过电子计算机控制发酵条件。

81 非糖质原料的谷氨酸发酵 醋酸发酵谷氨酸 机理：醋酸形成乙酰CoA，再进入TCA，因此凡能利用葡萄糖原料的菌种也可作为醋酸发酵谷氨酸的菌株。
以醋酸钠或醋酸铵与醋酸的混合液为原料，且浓度不超过4％。发酵过程中也需流加以保持pH。

82 第三节 啤酒 啤酒是以大麦芽﹑酒花﹑水为主要原料﹐经酵母发酵作用酿制而成的饱含二氧化碳的低酒精度酒。
啤酒这个古老的酒种，却是微生物工程的起源，啤酒工艺对古典微生物学和生物化学的发展做出了很大的贡献。著名科学家巴斯德和汉森等，都曾长期从事啤酒生产的实践，微生物的纯种培养技术，就是汉森在卡尔斯伯啤酒厂的实验室研究成功的。

83 啤酒发酵 啤酒发酵过程是啤酒酵母在一定的条件下，利用麦汁中的可发酵性物质而进行的正常生命活动，其代谢的产物就是所要的产品--啤酒。由于酵母类型的不同，发酵的条件和产品要求、风味不同，发酵的方式也不相同。一般可以把啤酒发酵技术分为传统发酵技术和现代发酵技术。

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86 制麦工序 啤酒的制作工艺 糖化工序 发酵工序 包装工序

87 制麦工序 生产麦芽汁的原料有大麦芽，大米，酒花和水。
原料投产前，都要经过一般理化分析，检验是否符合要求。大麦发芽后要经过干燥，并除去根，贮存八周左右才能使用，大米的淀粉含量高，约为76%-80%，蛋白质含量低，为7%-8%，用大米代替部分麦芽，不仅成本低，出酒率高，而且可以改善啤酒的风味和色泽。 为了得到干净、一致的优良麦芽，制麦前，大麦需先经风选或筛选除杂，永磁筒去铁，比重去石机除石，精选机分级。

88 大麦的要求 适于啤酒酿造用的大麦为二棱或六棱大麦。二棱大麦的浸出率高，溶解度较好；六棱大麦的农业单产高，活力强，但浸出率较低，麦芽溶解度不太稳定。啤酒用大麦的品质要求为﹕壳皮成分少﹐淀粉含量高﹐蛋白质含量适中（9～12%）﹔淡黄色﹐有光泽﹔水分含量低于13%﹔发芽率在95%以上。

89 酒花，又称忽布，《本草纲目》上称为蛇麻花，是一种多年生草本蔓性植物，古人取为药材。雌雄异株，酿造上所用的均为雌花。它能赋予啤酒香味和爽口的苦味，增进啤酒的泡特性和稳定性。与麦汁一起煮沸时，能促进蛋白质凝固，有利于麦汁澄清，增加麦汁和啤酒的防腐能力。

90 啤酒生产用水，以糖化用水为最重要，除应符合饮用水标准外，还要求碳酸盐硬度低，非碳酸盐硬度适当，可以控制糖化醪和麦汁的pH值，使其偏酸，利于麦芽中的各种酶酶促反应，提高麦汁质量。

91 糖化工序 糖化工艺包括糊化，糖化，糖化醪的过滤，麦汁的煮沸，沉淀，冷却，充氧等过程。 主要过程为：麦芽、大米等原料由投料口或立仓经斗式提升机、螺旋输送机等输送到糖化楼顶部，经过去石、除铁、定量、粉碎后，进入糊化锅、糖化锅糖化分解成醪液，经过滤槽/压滤机过滤，然后加入酒花煮沸，去热凝固物，冷却分离。

92 糊化： 糊化是将大米和部分麦 芽粉碎、精选，增湿后按1:4.5 左右的料水比加水调成米浆， 加入糊化锅内，利用麦芽中
的a-淀粉酶将大米内的淀粉糊化，液化，降低糊醪粘度，防止淀粉粘锅，加速糊化过程，糊化锅外形为椭圆体，桶身与顶风头装有夹套，以便于通蒸汽加热，顶风头上有加料，加水管口，另有拉门，中部有排气烟筒，以便二次蒸汽排出，锅内有温度计接管，底部装有搅拌器，可使固液料均匀混合。

93 糖化：将煮沸后的糊化醪泵入糖化锅内进行糖化反应，糖化锅的结构与糊化锅的相似，仅体积较大而已，糖化过程要注意各阶段的温度和时间，使麦芽中的各种酶协同作用，将淀粉糊化成麦芽糖和低分子糊精等糖类，使糖和非糖类物质形成一定的比例，并利用麦芽内的蛋白酶将原料中蛋白质适度分解产生中低分子肽和氨基酸，使制成的麦汁作为适合酵母发酵的氮源，这对成品啤酒产生泡沫有良好的作用。 过滤：糖化完毕后，将糖化醪泵入过滤槽内进行澄清过滤，过滤槽内装有筛板，过滤后的滤液清亮透明，这就是麦芽汁 。

94 煮沸：过滤后的麦汁，加上洗糟后的淡麦汁，浓度低于规定的工艺指标，所以要煮沸一定时间，将多余的水分蒸发掉，煮沸还可以起到消毒灭菌作用，并可促进蛋白质凝固、析出，增加啤酒的稳定性。煮沸时添加酒花粉，可增加麦汁的香气，苦味和防腐能力。

95 沉淀：煮沸后的麦汁，迅速泵入漩涡沉淀槽，麦汁沿切线进入槽内，在离心力的作用下，酒花粉末和蛋白质便沉淀到槽底。
冷却：澄清的麦汁温度较高，可通过板式换热器，使麦汁温度降到7-8摄氏度，以适合发酵需要。 充氧：冷却后的麦汁，通过充氧气，加入无菌空气，增加溶氧，使麦汁中的多酚物质氧化，色泽变深，当含氧量达到十到十一毫克每升时，即可送到发酵车间，供培养酵母用。

96 发酵工序 传统发酵工艺采用两段发酵，前发酵采用开放式的池，发酵时间为7-8天，温度为8摄氏度左右，前酵结束后，将上层酒输入密闭的储槽内，保持低温，贮藏60-90天左右，称为后酵。这种生产方式设备周转慢，要使用庞大的冷库，耗能很大。

97 现代发酵将传统的两段发 酵改为露天大罐发酵，前 后酵集中在一个罐内进行， 罐壁设有换热管，以便控 制发酵过程中各阶段的温 度，既取消了庞大的冷库建筑，降低了能耗，又便于控制不同阶段罐内发酵液所需的温度，所以酒龄缩短，设备利用率提高，而酒质与传统发酵相似。啤酒生产过程中要排出大量的废水，废水在排放到环境中之前要先通过污水处理池进行处理，以保持环境卫生。

98 啤酒酵母的主要特性要求 啤酒酵母呈圆形或椭圆形，为单个或成对，细胞大小为4-5或7-9微米，一端出芽，子囊孢子呈圆球形，啤酒酵母的死灭温度为53摄氏度，发酵温度为10摄氏度左右，生长条件为好氧或嫌氧。 对啤酒酵母的基本要求是：发酵力高，凝聚力强、沉降缓慢而彻底，繁殖能力适当，生理性能稳定，酿制出的啤酒风味好。

99 发酵： 在发酵的过程中，人工培养的酵母将麦芽汁中可发酵的糖份转化为酒精和二氧化碳，生产出啤酒。发酵在八个小时内发生并以加快的速度进行，积聚一种被称作"皱沫"的高密度泡沫。这种泡沫在第3或第4天达到它的最高阶段。从第5天开始，发酵的速度有所减慢，皱沫开始散布在麦芽汁表面，必须将它撇掉。酵母在发酵完麦芽汁中所有可供发酵的物质后，就开始在容器底部形成一层稠状的沉淀物。随之温度逐渐降低，在8~10天后发酵就完全结束了。

100 整个过程中，需要对温度和压力做严格的控制。当然啤酒的不同、生产工艺的不同，导致发酵的时间也不同。通常，贮藏啤酒的发酵过程需要大约6天，淡色啤酒为5天左右。发酵结束以后，绝大部分酵母沉淀于罐底。酿酒师们将这部分酵母回收起来以供下一罐使用。除去酵母后，生成物"嫩啤酒"被泵入后发酵罐（或者被称为熟化罐中）。在此，剩余的酵母和不溶性蛋白质进一步沉淀下来，使啤酒的风格逐渐成熟。成熟的时间随啤酒品种的不同而异，一般在7~21天。经过后发酵而成熟的啤酒在过滤机中将所有剩余的酵母和不溶性蛋白质滤去，就成为待包装的清酒。

101 成品啤酒的检验 成品啤酒应进行如下项目的检验，符合要求才能灌装出厂。一般12度啤酒的乙醇含量为总重量的3%-3. 5%，CO2含量为0

102 酒花苦味值在啤酒中的含量，不仅是衡量酒花用量的指标，也是提高酒花利用率的可比数据，酒花苦味值可用薄层法测定，一般a酸为2
酒花苦味值在啤酒中的含量，不仅是衡量酒花用量的指标，也是提高酒花利用率的可比数据，酒花苦味值可用薄层法测定，一般a酸为2.9ppm,异a酸为20.7ppm。啤酒的营养价值很高，每100毫升啤酒内含有维生素B 微克，维生素B 微克，烟酸 微克。

103 包装工序 空瓶必须经过加有洗涤剂的热水浸泡，再用高压水冲洗后才能使用。干净的空瓶由带式输送机运到回转装酒机进行灌装，装入量一般为每瓶640ml，然后经压盖机压盖。压盖后的瓶装啤酒通过带式输送机进入巴氏杀菌机进行一分钟杀菌，杀菌温度为68摄氏度，将啤酒内的酵母和其它非孢子类细菌杀死，以增加啤酒的生物稳定性，利于成品的储藏，经过杀菌的瓶装啤酒，再经带式输送机送到贴标机，贴好商标装箱入库，然后装车出厂，以满足人们的生活需要。

104 啤酒酿造工艺流程图