基因诊断 与基因治疗 Gene Diagnosis and Gene Therapy 主讲：李志红.

Presentation on theme: "基因诊断 与基因治疗 Gene Diagnosis and Gene Therapy 主讲：李志红."— Presentation transcript:

1

2 基因诊断 与基因治疗 Gene Diagnosis and Gene Therapy 主讲：李志红

3 第 一 节 基 因 诊 断 Gene Diagnosis

4 基因诊断 性状 基因 蛋白质 基因诊断 生化诊断 临床诊断

5 基因诊断的概念和特点 定义 利用现代分子生物学技术，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 特点
1．以基因做检查材料和检查目标，针对性强 2．分子杂交选用特定基因序列作探针，故特异性强 3．分子杂交和PCR具有放大效应，故灵敏度高 4．适用性强，诊断范围广

6 、基因诊断的主要对象和样品来源 对象： 主要是DNA分子，涉及到功能分析时，还可定量检测RNA（主要是mRNA）和蛋白质等分子。 样品来源：
临床上可用于基因诊断的样品有血液、组织块、羊水和绒毛、精液、毛发、唾液和尿液等。

7 二、基因诊断技术 定性分析 分类 定量分析 基本流程： 核酸抽提 目的序列的扩增 分子杂交 信号检测 基因分型 检测基因突变 测定基因拷贝数
测定基因表达产物量 基本流程： 核酸抽提 目的序列的扩增 分子杂交 信号检测

8 基因诊断常用技术方法 （一）核酸分子杂交技术 （二）聚合酶链式反应 （三）基因测序 （四）基因芯片

9 GAG——GTG Glu——Val （一）核酸分子杂交技术
限制性片断长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP)： 这种方法对于点突变非常有效。由于基因突变，引起酶切部位的改变，导致限制性片断数目、每个片断长度不同。 e.g. 镰形细胞贫血的Gene诊断 β珠蛋白链基因第6位密码子发生突变 GAG——GTG Glu——Val

10 已知限制酶Mst 1识别序列 （CCTNAGG）
CCTGAGG CCTGTGG 突变后不能识别 酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。

11 Southern blot

12 （二）PCR技术 巢式PCR 多重PCR RT-PCR 实时PCR 联合PCR

13 PCR-单链构象多态性 single strand conformation polymorphism( SSCP)分析
PCR-SSCP是在PCR技术基础上发展起来的一种简单、快速、经济的显示PCR反应产物中点突变的手段。 原理：PCR产物经变性后可以产生2条互补的单链，不同的单链构象不同，如果存在基因突变，哪怕是只要有一个碱基发生改变，单链的构象也发生变化; 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常与基因突变的DNA单链将在凝胶上显现出不同的带型，从而确定野生型和突变型。 优点：简单，较高的敏感性，可同时分析多个样本。

14

15 （三）基因测序 是最直接、最准确的基因诊断技术
病例SOX9基因HMG box内发生单碱基置换突变R178L(G→T)，左侧正常对照第225位碱基为C，而该患儿为A（反义链中）。

16 三、基因诊断的应用 遗传疾病 肿瘤 感染性疾病，传染性流行病 判断个体疾病易感性 器官移植组织配型 法医学中个体识别、亲子鉴定

17 我国部分代表性常见单基因遗传病基因诊断 疾病 致病基因 突变类型 诊断方法 α地中海贫血 α珠蛋白 缺失为主
Gap-PCR、DNA杂交、DHPLC β地中海贫血 β珠蛋白 点突变为主 反向点杂交、DHPLC 甲型血友病 凝血因子Ⅷ PCR-RFLP 乙型血友病 凝血因子Ⅸ 点突变、缺失等 PCR-STR连锁分析 苯丙酮尿症 苯丙氨酸羟化酶 点突变 PCR-STR连锁分析、ASO分子杂交 马凡综合症 原纤蛋白 点突变、缺失 PCR-VNTR连锁分析、DHPLC

18 未病先防，既病防变

19 基因检测的现状 目前可以用基因检测进行检测的疾病数1767种，其中1492种检测应用于临床，275种仅用于研究。
美国早在1996年就开始了基因检测，2004年接受检测的人次数递增至400万，占人口比例1.57﹪，至2007年已有700多万人次。 国内目前已经开展的基因检测项目包括： 遗传病基因检测数十种，如遗传病的染色体检测，地中海贫血基因检测，G-6PD基因检测等； 易感基因型检测400多种，如白细胞抗原（HLA）分型检测、多种癌症、糖尿病、冠心病、心肌梗死、动脉粥样硬化、高血压病、老年性痴呆等；

20 疾病易感基因检测适合于…... 家族中有某种疾病的遗传病史者。 某类疾病的高风险人群，如近亲或个人罹患慢性疾病，或者常处于污染环境者。
有正确健康意识者。

21 第 二 节 基 因 治 疗 Gene Therapy

22 一、基因治疗的概念 定义 早期是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。
目前广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病的目的。

23 二、基因治疗历史 20世纪60年代 Edward Tatum提出基因水平上纠正缺陷基因的设想。以病毒为截体，体细胞为靶细胞的技术路线，从根本上解决遗传病的治疗问题。 1966年 美国国立实验室的Rogers发现，接触兔乳头状病毒的实验工作人员中相当部分的血精氨酸降低。推测病毒核酸进入细胞使精氨酸酶活性升高。 1973年 Rogers用shope兔乳头状瘤病毒感染一个患有精氨酸血症女孩的皮肤成纤维细胞，使细胞精氨酸酶活性上升，且可持续7个月。 1990年11月，美国NIH的Blease,Culver和Anderson进行了首例人体基因治疗临床试验。患ADA缺失症的4岁小女孩，利用反转录病毒将ADA基因转移到T淋巴细胞中，再回输。患者免疫力明显提高，取得了巨大成功。

24 基因治疗的三要素：(NIH提出） 合适的目的基因 合适的基因转移方式 合适的基因表达与调控 要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解
发病机制在DNA水平上已经清楚 要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解 合适的基因转移方式 合适的基因表达与调控

25 三、基因治疗的基本策略 （一）缺陷基因精确的原位修复 基因矫正 gene correction 致病基因的突变碱基进行纠正 基因置换
gene replacement 用正常基因通过重组原位替换致病基因 这两种方法属于对缺陷基因精确的原位修复，既不破坏整个基因组的结构，又可达到治疗疾病的目的，是最为理想的治疗方法。

26 （二）基因增补 不删除突变的致病基因，而在基因组的某一位点额外插入正常基因，在体内表达出功能正常的蛋白质，达到治疗疾病的目的。
这种对基因进行异位替代的方法称为基因添加（gene augmentation）或称基因增补，是目前临床上使用的主要基因治疗策略。

27 （三）基因沉默或失活 有些疾病是由于某一或某些基因的过度表达引起的，向患者体内导入有抑制基因表达作用的核酸，如反义RNA、核酶、干扰小RNA等，可降解相应的mRNA或抑制其翻译，阻断致病基因的异常表达，从而达到治疗疾病的目的。这一策略称为基因失活（gene inactivation）或基因沉默（gene silencing）。

28 反义RNA 定义：与mRNA或其它RNA互补的RNA分子。 由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合即抑制了该mRNA的翻译，是原核生物基因表达调控的一种方式，在真核生物中也存在反义RNA。

29 特点 （l）安全性高，专一性强，效率高。反义RNA只作用于特异的mRNA分子，不改变所调节基因的结构。反义RNA分子无论怎样修饰，最终将在细胞内部被降解，不留“残渣” （2）设计和制备方便 （3）具有剂量调节效应 （4）在治疗RNA病毒感染性疾病时有更大的优势。能直接作用于一些RNA病毒，阻断RNA病毒的繁殖

30 （四）自杀基因治疗 将“自杀基因”导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀效应”，从而清除肿瘤细胞。为恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。

31 胸苷激酶基因thymidine kinase(TK) 胞嘧啶脱氨酶基因cytosine deaminase(CD)
自杀基因的类型 胸苷激酶基因thymidine kinase(TK) 胞嘧啶脱氨酶基因cytosine deaminase(CD) Ganciclovir,GCV 丙氧鸟苷 TK GCV-ATP 丙氧鸟苷三磷酸 5-FC 5氟胞嘧啶 5-FU 5氟尿嘧啶 CD GCV变成磷酸化GCV后可结合于延长的DNA链，阻止DNA的合成，杀死分裂细胞.

32 自杀基因的旁观者效应 “自杀基因”治疗不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。

33 （五）基因免疫治疗(基因疫苗) 定义 通过将抗癌免疫增强细胞因子（TNF,干扰素，IL-2)或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。

34 三、基因治疗的基本程序 治疗性基因的选择 病毒载体 非病毒载体 基因载体的选择 体细胞 生殖细胞 靶细胞的选择 间接体内疗法 直接体内疗法
基因转移 外源基因表达的筛选 利用在体中的标记基因 回输体内

35 （一）选择治疗基因 许多分泌性蛋白质如生长因子、多肽类激素、细胞因子、可溶性受体（人工构建的去除膜结合特征的受体），以及非分泌性蛋白质如受体、酶、转录因子的正常基因都可作为治疗基因。 简言之，只要清楚引起某种疾病的突变基因是什么，就可用其对应的正常基因或经改造的基因作为治疗基因。

36 （二）基因载体的选择 基因治疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。
病毒载体：逆转录病毒(RV)、腺病毒(AV)、腺相关的病毒(AAV)等。 非病毒载体：这类载体的发展较快，目前主要是脂质体。

37 （三）靶细胞的选择 ---- 分为生殖细胞和体细胞两大类,现阶段只限于应用体细胞 靶细胞选择的原则: 1.易操作; 2.易培养;
3.易接受外源基因; 4.在体内能持久高效表达 目前常用的靶细胞包括：成纤维细胞、淋巴细胞、上皮细胞、造血细胞、肝细胞、肌细胞等

38 （四）基因转移方法 化学方法——磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法 物理方法——电穿孔法、粒子轰击法（基因枪）
病毒法——主要通过携带有外源基因的病毒载体感染靶细胞来实现基因的转移。 膜融合法——细胞融合法、脂质体介导法、原生质体融合法、微细胞核介导法等

39 将治疗基因导入人体 间接体内疗法 直接体内疗法 目的基因转移到体外培养的靶细胞内高效表达，然后将靶细胞回输体内
将目的基因在体内直接转移到靶细胞 载体：需要有特异导向性和高转移效率

40 ex vivo 靶细胞 载体 目的基因 in vivo

41 （五）治疗基因表达的检测 无论以何种方法导入基因，都需要检测这些基因是否能被正确表达。被导入基因的表达状态可以用PCR、RNA印迹、蛋白印迹及ELISA等方法去检测。对于导入基因是否整合到基因组以及整合的部位，可以用DNA印迹技术进行分析。

42 （六）回输体内 方式：静脉注射、肌注、皮下注射、滴鼻等 基因修饰的淋巴细胞以静脉注射的方式回输到血液中；
将皮肤成纤维细胞以细胞胶原悬液注射至患者皮下组织； 采用自体骨髓移植的方法输入造血细胞； 或以导管技术将血管内皮细胞定位输入血管等。

43 (bubble-baby syndrome;
腺苷脱氨酶(ADA, Adenosine Deaminase) )缺乏的 严重联合免疫缺陷(SCID, severe combined immunodeficiency syndrome) 病因 淋巴细胞缺乏ADA酶 腺苷、dATP堆积 破坏免疫功能 患儿很少活到成年 (bubble-baby syndrome; very low T cell counts)

44 治疗基本步骤: ADA基因+逆转录病毒载体 导入患者淋巴细胞 体外扩增 回输病人体内 淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10% 维持免疫系统功能,改善病人症状

45 基因治疗成功范例 ADA缺乏症基因治疗 1990年9月 , 一位四岁的ADA缺乏症女孩接受了首例基因治疗
患者注入10亿个遗传修饰的T淋巴细胞, 约每月1次, 连续1年, ADA水平从1%上升到20%, 淋巴细胞数量正常, 免疫功能正常 1991年,另一位9岁患者基因治疗也取得成功, 他们从隔离病房走向了美好生活.

46 肿瘤的细胞疗法 CIK细胞：细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokines-induced killer cells）；
CIK细胞是人体内正常的具有很强杀伤肿瘤细胞作用的免疫T淋巴细胞，但数量很少，在患肿瘤后略有所增加； 体外增殖培养CIK细胞到9-10亿数量后，回输人体，以快速识别并杀伤体内各部位肿瘤细胞，并诱导体内CIK细胞的增殖，从而达到治疗肿瘤的目的。肿瘤的靶向治疗

47 四、基因治疗的应用与展望 应用 展望 遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、感染性疾病、神经系统疾病 进一步寻找切实有效的基因
精密调控外源基因在人体内的表达 体细胞移植和重建的生物学研究 减少外源基因对机体的不利影响

48 基因治疗展望 将来我们我们每个人都有一个属于自己的遗传档案: 基因图, 基因图可以预测：你将会长多高？你会不会发胖？将来会不会秃顶，你最终会不会死于糖尿病或癌症, ──算命先生、预言大师的话可以不信，但是基因图说的却是科学预言。 　 当人们发现了某种致病基因后，可以设法预防它的发作，也可以设法修饰或改变这个基因的表达，现代医学无法根治的病，都可采用基因治疗。 安全性问题与伦理问题

49 基因治疗展望 展望21世纪, 各种遗传病, 肿瘤外, 传染病，神经系统, 心血管系统和各种常见疾病均可以获得治疗.
基因治疗象吃药和打针一样方便; 按照人和疾病治疗的需要定量表达或关闭基因. 基因治疗可以让人类告别传染病, 肿瘤, 使人长得更高,寿命更长,使人更聪明，更漂亮，使人看得更远，听得更清楚, 生活更加美好.

50 关于考试 时间，地点： 见课程网站通知 考试方式： 闭卷 授课ppt，复习题： 见课程网站

51 成绩评定 平时成绩 网上作业（3次）+平时点名 占40% 课程考试成绩 占60%

52 谢谢！