细胞凋亡 与 免疫.

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1 细胞凋亡 与 免疫

2 ☆正常凋亡过程受阻或某种原因所致不正常的细胞凋亡，都会使机体出现病症。因此对细胞凋亡的研究有助于某些疾病的阐明与治疗。
引言 ☆细胞凋亡是一种普遍存在的生物学过程 ，它与细胞增殖、细胞分化都是最重要的生命现象，正是由于细胞增殖、细胞分化、细胞调亡的相互联系、相互制约的关系，才保证了生物体的正常发育。 ☆正常凋亡过程受阻或某种原因所致不正常的细胞凋亡，都会使机体出现病症。因此对细胞凋亡的研究有助于某些疾病的阐明与治疗。 ☆ 细胞凋亡的研究是近年来生命科学中发展起来的热点课题。早期基于形态学和生物化学，近期则是基于分子生物学技术从基因调控、信号转导等方面研究。

3 主要内容 细胞凋亡概述（基本概念、意义、 生物学特征、调节、信号传递等） 细胞凋亡与免疫生理 细胞凋亡与免疫病理 细胞凋亡的检测方法
　　　生物学特征、调节、信号传递等） 细胞凋亡与免疫生理 细胞凋亡与免疫病理 细胞凋亡的检测方法 细胞凋亡研究相关展望

4 一　细胞凋亡概述 1. 基本概念及生物学意义： 　凋亡（apoptosis）一词于1972年Kerr（英国阿伯丁大学病理学教授）引入，是一个希腊语合成词,原意指花瓣或树叶的自然脱落（Apo脱落＋ptosis飘零=Apoptosis）。 　基本概念：细胞凋亡是一个“形态学”概念，是对细胞超微结构观察的基础上得出的特指一种由基因控制、形态学特征与坏死截然不同的自主性细胞死亡方式。

5 1972年，Kerr,Wylle和Curry在许多正常组织中观察到一种与经典的细胞坏死形态特征不同的现象：细胞收缩、细胞碎片、散在不完整细胞等，据此，他们首次提出apoptosis一词。国内常译为细胞凋亡、细胞凋落、细胞凋谢、细胞衰亡等，多数学者倾向于“细胞凋亡”。强调这一过程是一种自然的生理学过程。

6 细胞凋亡与细胞程序性死亡 细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）
细胞凋亡和程序性死亡具有非常密切地关系。大多数情况下程序性细胞死亡是以凋亡的方式进行，但并不是所有的程序性死亡都采取凋亡的方式。

7 细胞凋亡与细胞程序性死亡 如烟草蛾节间肌肉细胞、哺乳动物某些神经元和红细胞，它们的程序性死亡是以非凋亡的方式进行。
　　　如烟草蛾节间肌肉细胞、哺乳动物某些神经元和红细胞，它们的程序性死亡是以非凋亡的方式进行。 　　　有时由外源性理化因子刺激诱发的细胞死亡，形态上似凋亡，但并不是由细胞内原装程序所引发，也不能称为程序性细胞死亡（如放疗后肿瘤组织坏死等）。 　　　因此细胞凋亡只是程序性死亡的特殊方式。

8 细胞凋亡的生物学意义： 1. 确保正常的生长发育(development )：清除无用、多余的细胞。
近年来对细胞凋亡的研究日渐重视，现代研究结果表明：细胞凋亡不仅是认识细胞死亡过程的基础，而且在胚胎发育、造血、免疫、乃至肿瘤形成中都有极为重要的作用。 1. 确保正常的生长发育(development )：清除无用、多余的细胞。 2. 维持内环境稳定(maintenance of homeostasis) ：清除受损、突变或衰老的细胞。 3. 发挥积极的防御功能(defense reaction)：清除病毒感染细胞等对机体有害的细胞。

9 Tissue remodeling. Sculpting the digits in the developing mouse paw by apoptosis.

10 Elimination of transitory organs and tissues.
The resorption of the tadpole tail at the time of its metamorphosis into a frog occurs by apoptosis.

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12 细胞凋亡参与皮肤更新

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14 2. 细胞凋亡的生物学特征 形态学变化 生物化学变化 胞内Ca++浓度增高 DNA片段化 大分子的合成(凋亡相关蛋白质及RNA合成）
　　　tTG（组织转谷氨酰胺酶）的积累并达到较高的水平。 一种依赖钙离子的酶，当凋亡起始时，Ca++浓度上升，从而使tTG活化。其作用是保持凋亡小体的完整性，防止有害物质的逸出。

15 Morphological Changes (细胞生物学详讲)
第一阶段：胞体缩小与周围细胞失去联系，细胞器变致密，核体积缩小，核仁消失，染色质浓集于核膜内表面下，形成新月形致密小块。 第二阶段：染色体断裂，核膜与细胞膜均内陷，包裹胞内成分(胞浆、细胞器、碎裂的染色质及核膜)形成“泡”样结构，此为“凋亡小体”。最后，整个细胞均裂解成这种“小体”。 第三阶段：凋亡小体被邻近的巨噬、上皮细胞等识别、吞噬、消化。上述三个阶段维持时间很短，通常在几分钟、十几分钟内即可完成。

16 细胞凋亡时的形态学变化

17 细胞凋亡与细胞坏死 特征 细胞凋亡 细胞坏死 诱导因素 生理及弱刺激 强烈刺激 受累范围 单个细胞丢失 成群细胞死亡
特征 细胞凋亡 细胞坏死 诱导因素 生理及弱刺激 强烈刺激 受累范围 单个细胞丢失 成群细胞死亡 膜完整性 保持到晚期 早期即丧失 细胞体积 减少、固缩 增大肿胀 染色质 凝聚成半月形 稀疏成网状 细胞器 无明显变化 肿涨破坏 溶酶体 保持完整 破坏外溢 细胞形状 形成凋亡小体 破裂成碎片 基因组DNA 有控降解 随机降解 大分子合成 一般需要 不需要 基因调控 有 无 后果 不引起炎症反应 引起炎症反应 意义 生理死亡方式 病理死亡方式 17

18 18

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20 DNA 'ladder DNA 180bp endonucleolytic DNA fragmentation nucleosome
core histone DNA 180bp chromatin

21 3. 细胞凋亡的诱导和抑制因素 物理性因子，包括射线（紫外线， 射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等；
　　　物理性因子，包括射线（紫外线， 射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等； 　　　化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子（TNF）等。 　　　DNA和蛋白质合成的抑制剂等。

22 4.免疫相关的凋亡信号转导 接受凋亡信号 凋亡调控分子间的相互作用 蛋白水解酶（caspases）的活化　　 凋亡的级联反应

23 免疫相关的凋亡信号途径 死亡受体介导的信号途径 线粒体途径 颗粒酶B途径(CTL特有)

24 　死亡受体通路、线粒体通路

25 细胞凋亡涉及的共同通路 其中膜受体和线粒体途径均通过激活含半胱氨酸的天冬氨酸酶（Caspase）剪切胞内底物（ Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程），导致凋亡特有的生化和形态学改变。

26 细胞凋亡涉及的共同通路 Caspase：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶，水解底物天冬氨酸C端肽键，因此又称之为Caspases(取英文Cysteine C，aspartic acid ，Asp ，proteases的词头)

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28 Caspase家族的结构与分类 ICE亚类Caspase蛋白酶：ICE是单核细胞来源的参与成熟的一种蛋白酶，参与凋亡但不起主要作用；
　　Caspase1，Caspase4， Caspase5， Caspase11 　　 　　Caspase12，Caspase13， Caspase14。 凋亡启动亚类Caspase蛋白酶（上游Caspase）：　　 　　Caspase8， Caspase2， Caspase 9，Caspase10。 凋亡效应亚类Caspase蛋白酶（下游Caspase）： 　　Caspase3， Caspase6， Caspase7

29 Caspase家族的特点： 以酶原的形式存在，需要活化： 同源活化和异源活化,活化后形成四聚体的蛋白水解酶，发挥生物学作用
　　　同源活化和异源活化,活化后形成四聚体的蛋白水解酶，发挥生物学作用 C端同源区存在半胱氨酸激活位点

30 Caspase活化机制： Caspase的活化是有顺序的多步水解的过程，虽然分子各异，但是它们活化的过程相似。
首先在caspase前体的N-端前肽和大亚基之间的特定位点被水解去除N-端前肽，然后再在大小亚基之间切割释放大小亚基，并进而形成两两组成的有活性的四聚体,

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32 Caspase的效应机制 破坏细胞结构 影响核酸的结构与功能
凋亡细胞的特征性表现：包括DNA裂解为200bp左右的片段，染色质浓缩，细胞膜活化，细胞皱缩，最后形成由细胞膜包裹的凋亡小体，然后，这些凋亡小体被其他细胞所吞噬。 破坏细胞抗凋亡因素 破坏细胞结构 影响核酸的结构与功能

33 破坏细胞抗凋亡因素 正常活细胞内核酸酶处于无活性状态。这是由于核酸酶和抑制物结合在一起（如抑制物被破坏，核酸酶即可激活，引起DNA片段化）。
现知caspase可以剪切裂解这种抑制物而激活核酸酶，因而把这种酶称为Caspase激活的脱氧核糖核酸酶（caspase-activated deoxyribonulease CAD），而把它的抑制物称为ICAD。 有意义的是CAD只在ICAD存在时才能合成并显示活性，因而ICAD对CAD的活化与抑制是必需的。

34 破坏细胞结构 Caspase可直接破坏细胞结构：如裂解核纤层
　　　核纤层（Lamin）是由核纤层蛋白通过聚合作用而连成头尾相接的多聚体，由此形成核膜的骨架结构，使染色质（chromatin）得以形成并进行正常的排列。 　　　在细胞发生凋亡时，核纤层蛋白作为底物被Caspase裂解，从而使核纤层蛋白崩解，导致细胞染色质的固缩。

35 影响核酸的结构与功能 Caspase可作用于多种与DNA、RNA功能有关的蛋白：
　　　如灭活或下调与DNA修复有关的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交联蛋白。 　　　由于DNA的作用，这些蛋白功能被抑制，使细胞的增殖与复制受阻并发生凋亡。

36 4.1 死亡受体的信号转导 (1).参与死亡受体信号转导的接头蛋白： （死亡结构域蛋白death domain protein）
TRADD：TNF受体相关死亡结构域蛋白 　　TNF+TNFRI（死亡结构域）+ TRADD　　细胞凋亡 FADD：Fas相关死亡结构域蛋白 　　FasL+Fas （死亡结构域） +FADD 　　细胞凋亡 RIP：受体相互作用蛋白 CRADD：含有死亡结构域的caspase和RIP接头蛋白 MADD：活化MAP激酶的死亡结构域蛋白

37 死亡受体/配体/FADD/Caspase8或10
(2).死亡受体通路 受体多聚化和构像改变 FASL+FAS +FADD 死亡受体/配体/FADD/Caspase8或10 凋亡诱导复合物（DISC） 胞质中游离的caspase8聚集到这个复合物上 细胞有足够caspase8 细胞caspase8浓度不够 切割Bid tBid从胞质到线粒体 死亡受体活化， 细胞凋亡 线粒体途径 CtyC 释放

38 FasL/ /Fas

39 (3).死亡受体途径的调控机制 FLIP　[FADD-like-IL-1β-converting-enzyme(FLICE) inhibitory protein] 　近年发现的含DED的凋亡抑制蛋白 　广泛存在于真核生物、哺乳动物细胞和病毒中 　包括：病毒基因编码的FLIP(v-FLIP) 　细胞FLIP(c-FLIP):c-FLIPS或c-FLIPL 　功能：抑制Caspase8结合到DISC上，从而抑制　　 　　　起始Caspase激活。

40 4.2 线粒体途径 (1).基本环节： Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子 释放caspase活化因子
细胞色素C：细胞色素C+Apaf-1+ caspase9　　凋亡体 AIF（凋亡诱导因子） Caspase3 Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子

41 (2).线粒体通路

42 (3).线粒体通路的调控机制 Bcl-2家族（B cell lymphoma/leukemia-2）
　　　Bcl-2家族已发现15个成员，所有Bcl-2家族成员均含有1个或多个BH结构域。

43 抗凋亡/促增殖成员：包括 Bcl-2、 Bcl-xl 等。 机制：可阻止线粒体外膜通透化，从而阻止细胞色素C的释放，抑制细胞凋亡。
根据结构和功能分为两类： 抗凋亡/促增殖成员：包括 Bcl-2、 Bcl-xl 等。 　　　机制：可阻止线粒体外膜通透化，从而阻止细胞色素C的释放，抑制细胞凋亡。 促凋亡成员：包括Bid、Bim、Bad等“BH3only”蛋白质和Bax、Bak、Bok等“多BH”蛋白质 　　　机制：影响APAF1的功能 影响线粒体的结构与功能

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46 IAP（inhibitor of apoptosis，细胞凋亡抑制因子）
IAP超家族的成员较多，共同的特征是含有一个或多个７０个氨基酸的重复序列（BIR），类似于zinc指状的结构。 　　　BIR功能域和之间的连接区域介导对caspase的抑制作用，而环指状结构则具有泛素化蛋白连接酶的作用，介导caspase-３和-７的泛素化降解作用。

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48 (3) Smac/Dablo 在细胞凋亡过程中它可以从线粒体释放进入细胞质。 成熟的Smac蛋白产生一个新的N基端,这个N基端的前面4个氨基酸可以与lAP的BIR结构域结合。 Smac的功能就是拮抗活化胱解酶9与lAP的结合。Smac 与BIR2的结合可以中和XlAP对胱解酶9的抑制，促进凋亡。

49 (4) AIF(apoptosis-inducing factor)
Endo G 两者均由线粒体释放，可以非Caspase依赖方式介导染色质的浓集和DNA片段化，促进凋亡。

50 颗粒酶B途径凋亡 颗粒酶B属丝氨酸蛋白酶 可作用于底物的天冬氨酸残基位点 是CTL杀伤靶细胞的主要效应分子。
机制:(1)颗粒酶B直接剪切并激活Caspase-3,后者作用于胞内底物介导凋亡 　 　(2)颗粒酶B剪切Bid而产生tBid,后者与Bax转位于线粒体，介导细胞色素C释放，激活Caspase级联反应。

51 二 细胞凋亡与免疫生理 细胞凋亡发生于在淋巴细胞分化、发育成熟及增殖和行使免疫学效应的全过程中；
二　细胞凋亡与免疫生理 细胞凋亡发生于在淋巴细胞分化、发育成熟及增殖和行使免疫学效应的全过程中； 细胞凋亡在免疫系统成熟、受体多样性选择以及免疫自稳等方面均有重要作用； 研究免疫系统凋亡机制将为探讨包括肿瘤、自身免疫病、艾滋病等免疫相关疾病的发生机理进而发展有效的防治方案提供依据。

52 二　细胞凋亡与免疫生理 1.细胞凋亡与T细胞 （1）凋亡与T细胞在胸腺的分化发育：

53 1.细胞凋亡与T细胞 （2）凋亡与成熟T细胞：活化T细胞表面高表达fas及fasL。AICD

54 2.细胞凋亡与B细胞 （1）凋亡与骨髓中B细胞发育： （2）凋亡与成熟B细胞

55 3.细胞凋亡与淋巴细胞的细胞毒作用： 　有胞毒作用的淋巴细胞主要有CTL、NK、LAK细胞等。它们产生效应的机制相似： Ca+内流→释放穿孔素→6-16nm孔→靶细胞死亡 　　　　　靶细胞凋亡 　　　　　　↑ 颗粒酶（丝氨酸酶）→激活caspase←TNF相关蛋白 　　　　　　　　　　 Tc高表达FasL

56 三 细胞凋亡与免疫病理 细胞凋亡不足及细胞凋亡过度都会造成疾病 proliferation apoptosis homeostasis
三　细胞凋亡与免疫病理 细胞凋亡不足及细胞凋亡过度都会造成疾病 proliferation apoptosis disorders of cell accumulation homeostasis disorders of cell loss time

57 与凋亡不足有关的疾病 与凋亡过度有关的疾病
与凋亡不足有关的疾病 与凋亡过度有关的疾病 1 肿瘤 AIDS 滤泡型淋巴瘤 神经变性疾病 激素依赖性肿瘤（乳瘤） 巴金森氏病 2 自身免疫病 色素性视网膜炎 系统性红斑狼疮 再生障碍性贫血 免疫介导的肾小球肾炎 缺血性损伤 3 病毒感染 心肌梗死，中风 疱疹病毒，腺病毒 酒精中毒性肝病 57 凋亡不足与过度并存：动脉粥样硬化（内皮细胞 凋亡过度，血管平滑肌细胞凋亡不足）

58 针对疾病种类的不同，可以通过抑制或者增强细胞凋亡的措施治疗有关的疾病：
1 诱导细胞凋亡治疗因凋亡受抑而致的疾病 　放疗和化疗能激活肿瘤自杀程序，导致瘤细胞凋亡。 2 抑制细胞凋亡治疗因凋亡过量而致的疾病 　神经生长因子治疗神经系统退行性病变，可以延缓神经元凋亡。 改变细胞凋亡状态用于疾病治疗的许多措施尚属试用阶段。一个十分诱人的设想是基因治疗——通过载体导入凋亡相关基因干预细胞的凋亡调控来实现。

59 四　细胞凋亡研究方法 形态学方法 生物化学方法 免疫学方法 组织化学方法 分子生物学方法

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61 1.形态学方法 1）　光学显微镜观察 　　样品涂片或组织切片经常规处理、HE 染色后,即可放在油镜下观察。 　　该方法简便,缺点是只有在发现了具有特征性的凋亡小体时才能确定为荧光结果阳性,因而不易检出早期的凋亡细胞,而且某些类型的细胞坏死(如凝固性坏死) 与细胞凋亡形态相似,两者不易区分。因此,该方法只能作为细胞凋亡初步推测的手段。

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63 1.形态学方法 2）荧光显微镜观察： 　　荧光染料吖啶橙(AO) 、碘化丙啶(PI) 、溴化乙锭(EB) 等染色,在荧光显微镜下可观察到凋亡细胞的细胞核改变和凋亡小体的形成。 　　这种方法适用于对体外培养细胞悬液的检测,组织脱蜡切片经RNA 酶作用后也可用此法染色观察。 　　荧光显微镜检查法方便易行,现已成为细胞凋亡检查的常用手段。

64 　　On this slide the easiest and historically first way of identifying apoptotic cells is shown. In this assay the blue fluorescent dye DAPI(4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride) has been used, which specifically stains DNA.

65  1.形态学方法 3）透射电子显微镜观察： 　凋亡细胞在电子显微镜下可见细胞体积变小,细胞质浓缩,内质网、线粒体增多,细胞膜微绒毛消失、起泡、出芽、形成凋亡小体。超微结构观察是诊断细胞凋亡最可靠的方法。 　但该法只能定性,不能定量,而且观察到凋亡小体的几率也不高,在体内试验时,凋亡小体可能很快被巨噬细胞吞噬清除,而不易观察到;此外,用电子显微镜检测细胞凋亡,样品制备步骤繁琐、耗时、昂贵。

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67 1.形态学方法 4）共聚焦激光扫描显微镜检测： 　共聚焦激光扫描显微镜是20 世纪80 年代发展起来的一种新型仪器,是在荧光显微镜的基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,使紫外光和可见光激发荧光探针,从而得到清晰的细胞内部结构。 　　该方法能用于细胞的形态学分析,而且还能对凋亡细胞内的大分子进行定位。

68 2.生物化学方法： （1）典型的细胞凋亡显示出DNA梯形电泳图谱： 　　　细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA 在核小体单位之间的连接处断裂,形成180～200 bp 长的DNA片段或整数倍的寡核苷酸片段。 　　　凋亡细胞经处理后,采用常规方法分离提纯DNA ,进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色,在凋亡细胞群中可观察到典型的梯形电泳图谱,而坏死细胞电泳后呈模糊的涂片状

69 细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图 1．细胞色素c诱导0 h 2．细胞色素c诱导1 h 3．细胞色素c诱导2 h 4．细胞色素c诱导3 h 5．细胞色素c诱导4 h 6．阴性对照 7．Marker （ 自赵允、翟中和）

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71 2.生物化学方法： （2）原位末端转移酶标记技术： 　　凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活，核DNA被切割成许多双链DNA片段以及高分子量DNA单链断裂点(缺口)，暴露出大量3’末端，如用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将标记的-dUTP进行缺口末端标记，则可原位特异地显示出凋亡细胞。

72  2.生物化学方法： 　由DNA 片段末端标记技术发展而成的TUNEL 法[ termina deoxy nucleotibyl transferase( TdT )-mediated dUTP-biotin nick end labelling ,TUNEL] 及试剂盒化,使细胞凋亡的原位检测在诸多领域的研究中得到广泛应用。

73 TUNEL法原理 　　1.细胞凋亡其断裂DNA断端3′-OH 暴露(坏死细胞DNA 断裂是无规则的,其中也有少数可出现3′-OH 的暴露,但数量极微弱,不易检测出来) ; 　　2.在末端DNA 转移酶(TdT) 的作用下,在无需模板的情况下,可进行3′端的DNA 合成; 　　3.如果在反应体系中加入标记的DNA ,则在3′端出现一段带有标记物的寡核苷酸,通过荧光显示或其他显色反应,可以原位地较特异地显示发生凋亡的细胞。

74 TUNEL法优点: ①特异性:该法用生化方法特异地标记凋亡细胞,可以将凋亡细胞、坏死细胞和活细胞区分开来。凋亡细胞显示增强的荧光,而坏死细胞和活细胞均不着染荧光。 ②敏感性:TUNEL 法可用于只有极少细胞发生凋亡的情况。 ③可定量检测细胞凋亡。

75 TUNEL法优点: ④适用于形态研究:用TUNEL 法标记细胞可动态观察凋亡细胞的超微结构变化。 ⑤适用性较广:可用于石蜡包埋的组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离细胞的凋亡情况检测。 ⑥TUNEL法检测快速,其反应过程仅需3h。

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78 缺点: ①只能标记中期及晚期的凋亡细胞。 ②不能检测只发生DNA 大片段( bp) 断裂的凋亡细胞。 ③不能检测DNA 断裂末端的准确数量,因为每个末端结合的标记分子的数量可因反应动力学而不同。 ④若样品处理不当,易形成假阳性,影响结果判断。

79 3.免疫学方法(ELISA法) 利用“夹心酶标免疫测定法”的原理,核小体DNA由于与组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸内切酶裂解，用抗组蛋白（或抗DNA）-过氧化物酶（或生物素化的抗体） 结合到核小体，通过酶标仪分析,可定量反映细胞凋亡水平。

80 核小体 酶 底物

81 ELISA方法的优点是:灵敏度高,操作快捷,无放射性同位素污染,可定量测定细胞凋亡,无需预先标记细胞,所用抗体不具有种属特异性, 酶标记的抗DNA 抗体可与单链和双链的DNA 起反应。
夹心法可以测定核小体单体和寡聚核小体，因而可以用于许多不同的培养细胞株或动物组织细胞的凋亡检测 。

82 4.组织化学方法： 　 细胞凋亡的相关蛋白分析:如p53 蛋白、c-myc 、Fas 、Bcl-2 家族蛋白等。测定方法主要有流式细胞仪检测法、蛋白印迹法及免疫组织化学染色法等。

83 5.分子生物学方法： PCR 是检测凋亡特异性基因的常用方法。 PCR 被用来扩增凋亡细胞产生的DNA 片段,当琼脂糖凝胶电泳呈现的DNA 梯形条带不明显时,用PCR 扩增后再电泳可见明显的梯形图谱； RT-PCR 被用来检测Bcl-2和caspase表达； 荧光定量PCR 检测基因表达水平更快更准确。此外,将PCR 技术和核酸分子杂交技术相结合,能显著提高检测的特异性和灵敏度。

84 6.流式细胞分析术 (flow cytometry，FCM)

85 6.流式细胞分析术 (flow cytometry，FCM)
亚“G1”峰检测法:处于增殖周期中的细胞，根据其所处不同周期时相(G0／Gl、S、G2／M)，其DNA含量分布在2n—4n之间。发生凋亡的细胞由于核内DNA裂解成许多小片段，在酒精固定后用细胞膜通透剂使小分子量的DNA片段穿过胞膜而丢失，仅剩下大片段DNA，这些失去部分DNA含量的细胞，在DNA染色后，形成一个DNA含量<2n(即< G 1期细胞)的分布区，称为“亚G1峰”。

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87 7.细胞凋亡的其它检测: PS（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测: 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。 Annexin-V(Ca2+依赖性磷脂结合蛋白)能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、R-PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。 细胞内氧化还原状态改变的检测： CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通过荧光染料monochlorobimane（MCB）体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡早期细胞内氧化还原状态的变化。

88 7.细胞凋亡的其它检测: 细胞色素C的定位检测：通过Western杂交用细胞色素C抗体和COX4抗体标示细胞色素C和COX4的存在位置，从而判断凋亡的发生。 线粒体膜电位变化的检测： 端粒酶检测： mRNA水平的检测： 蛋白印迹法:检测细胞凋亡的相关蛋白分析:如caspase 、Fas 家族蛋白等.

89 细胞凋亡检测技术存在的问题 （1）细胞凋亡的判断标准:目前,检测细胞凋亡的许多方法的结果判断标准不一。
形态学检查是其他各种检测方法的基础,任何方法的检查结果必须结合形态学检查来判断。 梯带状图像并不必然与细胞凋亡相关; TUNEL 法在坏死细胞群中也可出现阳性细胞。

90 细胞凋亡检测技术存在的问题 （2）细胞凋亡检测结果分析:
在一个检测体系中检出了发生凋亡的细胞, 生理性还是病理性，需进行致病因素的相关性分析.

91 细胞凋亡检测技术存在的问题 （3）细胞凋亡的定量分析： 定量分析包括2 个方面,一是群体细胞凋亡的定量,二是细胞凋亡程度的定量。
目前,流式细胞仪常用作群体细胞凋亡的定量分析,但在检测中的漏检率和错检率都很高。TUNEL 法虽可进行群体定量,但工作量大,同时易出现坏死细胞的假阳性。

92 展 望

93 ☆ 现代生命科学的发展动态 　（细胞凋亡研究所处的地位） 细胞生物学与分子生物学(包括分子遗传学与生物化学) 相互渗透与交融是总的发展趋势。

94 生命科学的研究从宏观上可以分为 三个层次：
生命科学的研究从宏观上可以分为 三个层次： 　　　核心层次（包括分子生物学和细胞生物学学科）　　 　　　个体生物学层次（对多个物种及种群的结构及功能研究） 　　　生物圈层次。 　　　无论是对细胞结构和功能的深入研究，还是对细胞重大生命活动规律的探索，都需要用分子生物学的新概念与新方法，在分子水平上进行研究，换句话说，细胞分子生物学或分子细胞生物学将是今后相当一段时间的主流。

95 2007年《美国科学院院报》（PNAS）的一篇文章中，通过数学方法，对科学杂志的引用关系进行了分析，对当前的88个研究领域进行了排序。
分子与细胞生物学当之无愧成为最大热门。

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97 对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈
突变体分析 突变体分析 蛋白修饰分析 基因表达 生物信息学 多肽定性分析 序列测定 双向电泳分析 DNA分离与克隆 机器人技术 (robotics) 蛋白质分离与制备 功能基因组学 蛋白质组学

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99 重点研究领域： 染色体DNA与蛋白质相互作用关系 —主要是非组蛋白对基因组的作用 细胞增殖、分化、凋亡的相互关系及其调控
　　　—主要是非组蛋白对基因组的作用 　细胞增殖、分化、凋亡的相互关系及其调控 　　 　　细胞增殖、分化、凋亡与衰老是细胞最重要的生命活动现象，它们既相互联系又相互制约并受到一系列基因的调控。一切动植物的生长发育都是依靠细胞增殖、分化与凋亡来实现的。 　细胞信号转导的研究 包括细胞间信号传递、受体与信号跨膜传导、细胞内信号传递途径 　细胞结构体系的组装 生物大分子如何逐级装配并最终形成生物赖以进行生命活动的细胞结构体系的问题

100 美国科学情报研究所（ISI）1997年以来SCI（Science Citation Index）收录及引用论文检索，全世界自然科学研究中论文发表最集中的几个领域分别是：
细胞信号转导（signal transduction）； 细胞凋亡（cell apoptosis）； 基因组与后基因组学研究（genome and post-genomic analysis）。

101 Summary Apoptosis is a multi-step, multi-pathway cell-death programme that is inherent in every cell of the body. Apoptosis can be initiated either through the death-receptor or the mitochondrial pathway. Caspases that cleave cellular substrates leading to characteristic biochemical and morphological changes are activated in both pathways. The apoptotic process is tightly controlled by various proteins. Immune cells (T cells & natural killer cells) can kill tumour cells using the granule exocytosis pathway or the death-receptor pathway. Cancer treatment by chemotherapy and -irradiation kills target cells primarily by inducing apoptosis. Therefore, modulation of the key elements of apoptosis signalling directly influences therapy-induced tumour-cell death.

102 谢谢！