V. 免疫学应用 (Chap16、17).

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1 V. 免疫学应用 (Chap16、17)

2 V. 免疫学应用 预防  检测  治疗 

3 一、免疫学诊断（chap16） （一）血清学检测（抗原抗体检测） 抗原抗体反应，又称血清学反应 （二）细胞免疫测定法

4 （一）抗原抗体检测 用已知Ag检测Ab 用已知Ab检测Ag

5 1、抗原抗体反应的特点 1）特异性和交叉反应 2）可逆性(分子表面的结合):非共价键 高亲和力抗体，低亲和力抗体 3）比例性和可见性
比例不合适——出现游离的抗原或抗体，小分子的免疫复合物形成，加电解质也不可见； 比例合适——出现网格状的大复合物，游离的抗原或抗体少，加电解质，可见。 4）阶段性 抗原抗体特异性结合阶段:短，无肉眼可见现象 可见反应阶段:长，形成肉眼可见现象（凝集、沉淀、溶解等）

6 Ag、Ab比例性和可见性 因此，在抗原抗体反应中，为得到肉眼可见的反应现象，需要调整抗原、抗体的比例。

7 2、抗原抗体反应的主要影响因素 抗原和抗体浓度、比例 电解质：在可见反应阶段发挥作用，0.85%NaCl 温度：常选用37度，也有4度
pH：一般在pH6~8

8 3、常见的抗原抗体反应 凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术：酶、同位素、荧光素等标记Ag或Ab 其他：溶菌反应、溶血反应等
颗粒性抗原与相应抗体结合，在适量电解质存在的条件下，形成肉眼可见凝集块的反应。 不溶性颗粒Ag + Ab 电解质存在 凝集成团块 （凝集原） （凝集素） 沉淀反应 可溶性抗原与相应抗体结合，在适量电解质存在的条件下，形成沉淀的反应 可溶性Ag Ab 电解质存在 沉淀（絮状等） （沉淀原） （沉淀素） 免疫标记技术：酶、同位素、荧光素等标记Ag或Ab 其他：溶菌反应、溶血反应等

9 （1）凝集反应 直接凝集反应：颗粒状Ag + Ab 间接凝集反应：可溶性抗原或抗体包被颗粒性载体，再反应
正向间接凝集反应 反向间接凝集反应

10 ABO血型鉴定 典型的直接凝集反应 ——玻片法

11 （2）沉淀反应 液体内的沉淀实验 环状沉淀试验 絮状沉淀试验
凝胶内的沉淀反应：琼脂扩散试验（常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等） 单向琼脂扩散 双向琼脂扩散 和电泳结合：火箭电泳、对流电泳等

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13 双向琼脂扩散 沉淀线的位置和Ag、Ab浓度有关。沉淀线的数量和对应Ag-Ab对数有关

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15 常用此法进行血清的蛋白种类分析。对于免疫球蛋白缺损或增多的疾病的诊断或鉴别诊断有重要意义。

16 （3）免疫标记技术 用酶、同位素、荧光素、胶体金等标记Ag或Ab 标记物的敏感性显色性等 +抗原抗体反应特异性 常用方法：
酶联免疫吸附试验（ELISA） 原理：抗原抗体反应特异性+酶催化反应高效性 常用酶：辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷酸酶（AP）

17 ELISA 双抗体夹心法(测Ag) 间接法(测Ab) 加Ab,清洗 加Ag，清洗 加Ab形成复合物，洗涤 加Ag形成复合物，洗涤
聚苯乙烯微量反应板 加Ab,清洗 加Ag，清洗 加Ab形成复合物，洗涤 加Ag形成复合物，洗涤 加该Ag的另一Ab（酶标），洗涤 加酶标二抗 加底物，读数 加底物，读数

18 ELISA原理示意图

19 免疫荧光技术

20 （二）免疫细胞的检测 1、免疫细胞的分离、鉴定、计数 目前最先进的方法：流式细胞仪分离

21 2、免疫细胞功能测定 E花结实验 T细胞表面CD2分子+绵羊血红细胞→玫瑰花结

22 E花结

23 二、免疫预防 在人类与疾病的斗争中建立预防方法

24 天花 天花病毒 (Smallpox virus)
出疹的木乃伊（疑为天花） 躯干皮肤天花损伤

25 患天花的小儿 （Infant with smallpox） 

26 患脊髓灰质炎的儿童 WHO 宣称将在2003年在全球消灭脊髓灰质炎

27 中毒 黑寡妇蜘蛛 黑寡妇症候群（影响神经）

28 抗蛇毒血清 上海赛伦生物技术有限公司：抗蛇毒血清为国内独家生产 抗蝮蛇毒血清、抗五步蛇毒血清、抗银环蛇毒血清、抗眼镜蛇毒血清
生产的流程是将蛇毒注射到马匹上，定期反复注射，待马对蛇毒有了免疫力，再把马血抽出来，提取抗蛇毒血清。

29 疫苗的起源和发展 疫苗的起源可以追溯到我国古代。 早在4世纪初，东晋葛洪所著《肘后方》中，已有关于防治狂犬病的记载：“杀所咬犬，取脑敷之，后不复发”。 在宋真宗时代（公元1000年左右）宰相王达之子患天花四处请医无效，最后请来了峨眉山的道人，取其患处的结痂，处理后进行自体接种而治愈，这是最早的自身免疫治疗（self-Vaccine） 逐渐发展成了预防天花的人痘接种法，即从感染天花后的恢复期病人或症状比较轻的病人身上，挑取水泡、脓疱和痘痂内容物并保存1个月左右待其干燥，然后将其研磨成粉末，给健康人的鼻腔吸入，以预防天花，取得了很好的保护效果。这是人类史上最早使用疫苗来预防疾病的记录，较英国医生琴纳（Jenner）发明牛痘苗早了几百年。

30 15世纪中期我国人痘苗接种法传至中东，经改革进行皮下接种。
 1721年英驻土耳其的大使夫人，将此法又传至英与欧洲各国。 人痘的发明是中国人民对世界医学的一大贡献。2000年，美国疾 控中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）出 版了《疫苗可预防疾病的流行病学与预防学》第6版，在这本被 誉为疫苗学权威手册首页的“疫苗接种的里程碑”中，第一项就 是“12世纪中国开始用人痘接种预防天花” 。这是对中国首先 开始使用人痘接种预防天花是最早的免疫接种形式的肯定。  1796英国乡村医生爱德华·琴纳（Edward Jenner）进行了人类历 史上的第一次疫苗接种试验。Jenner从一位感染了牛痘的年轻挤 奶农妇的手上挑取了痘苗接种到一名8岁男孩的手臂上。经过几 个月的观察，发现小男孩获得了免疫保护，一直没有感染天花。  1798年9月，Jenner发表了接种“牛痘”预防天花的论文，虽然 当时不知天花是由天花病毒感染所致，但这一划时代的发明开创 了人工自动免疫的先河。

31 随后，种痘技术传遍了欧洲，后又传到北美和亚洲。
为纪念Jenner的这一伟大贡献，巴斯德（Pasteur）将疫苗称为 Vaccine（拉丁文vacc是“牛”的意思）。 由于长期和广泛地使用牛痘苗，全世界从1977年后再也没有发现 过天花病人。 世界卫生组织（World Health Organization，WHO）于1979年10 月26日庄严宣布，天花已在全球绝迹。这是人类历史上第一个使 用疫苗消灭的传染病。 19世纪70年代，法国科学家路易斯·巴斯德（Louis Pasteur）有 关减毒鸡霍乱菌的研究，是继琴纳之后的重大进步。巴斯德建立 了现代意义上的预防接种，即通过实验室内研制的疫苗来预防传 染病。 1885年首次在人体使用减毒狂犬病疫苗的成功，标志人类进入了 一个预防接种的科学新纪元。 到19世纪末，人类在疫苗学领域里已经取得了辉煌的成就，包括 2个人用病毒减毒活疫苗（牛痘，狂犬病），3个人用细菌灭活疫 苗（伤寒、霍乱和鼠疫）。

32 Jenner 和 Pasteur , 著名的免疫学家，公认为免疫接种和主动免疫的先驱。
Louis Pasteur Jenner 和 Pasteur , 著名的免疫学家，公认为免疫接种和主动免疫的先驱。

33 疫苗发展史上的里程碑事件 时间 事件 12世纪 中国开始用人痘接种预防天花 1721年 人逗接种传入英国 1796年
E. Jenner为James Phipps接种牛痘，疫苗接种正式开始 1870 L. Pasteur发明了第一个细菌减毒活疫苗——鸡霍乱疫苗 1884年 L. Pasteur发明了第一个病毒减毒活疫苗——狂犬病疫苗 1885年 L. Pasteu第一次把狂犬病疫苗接种于人体 1901年 Von Behring发现了白喉抗毒素，获得第一个医学诺贝尔奖 1909年 Smith发明了灭活白喉毒素的方法 Calmette和Guerin发明了第一个用于人的细菌减毒活疫苗BCG 1933年 Good Pasture发明了鸡胚病毒培养法 1949年 Enders及其同事从人细胞系中分离出脊髓灰质炎Ⅱ型Lancing株 1954年 Enders分离出麻疹病毒 1955年 脊髓灰质炎灭活疫苗获准生产 1961年 人二倍体细胞株建立

34 麻疹疫苗获准生产，三价脊髓灰质炎疫苗获准生产 第一个重组疫苗——重组乙型肝炎疫苗获准生产 第一个多糖结合疫苗——B型流感嗜血杆菌疫苗获准生产
时间 事件 1963年 麻疹疫苗获准生产，三价脊髓灰质炎疫苗获准生产 1966年 世界卫生联盟呼吁全球消灭天花 1977年 索马里发现最后一例本土天花 1979年 美国报道最后一例野毒传播型脊髓灰质炎 1986年 第一个重组疫苗——重组乙型肝炎疫苗获准生产 1989年 推荐使用二剂型麻疹疫苗 1990年 第一个多糖结合疫苗——B型流感嗜血杆菌疫苗获准生产 1991年 西半球报道最后一例野毒株脊髓灰质炎病例 乙型肝炎免疫纳入全球计划免疫 1994年 美国消灭脊髓灰质炎得到证实 1995年 水痘疫苗获准生产 1996年 用于婴儿的无细胞型百日咳疫苗获准生产 1997年 推荐进行扫荡式脊髓灰质炎免疫 1999年 推荐单一使用脊髓灰质炎灭活疫苗 2000年 用于婴儿的结合肺炎球菌疫苗获准生产 引自：CDC：Epidemiology and Prevention of Vaccine-preventable Disease. 6 Edition，2000

35 疫苗接种实际效果 报道的病例数 Number of reported cases 0 例
美国报道的几种病在高峰年 和1996年 的病例数相比 风疹 Rubella 1969 脊髓灰质炎 Polio (paralytic) 1952 0 例 百日咳 pertussis 1934 腮腺炎 Mumps 1968 麻疹 Measles 1941 白喉 Diphtheria 1921 , , , ,000000 报道的病例数 Number of reported cases

36 人用疫苗发展年表 应用年份 疾病名称 疫苗类型 1721 天花 “人痘”活天花病毒 1796 “天然减毒”痘苗病毒 1885 狂犬病
“不同程度”减毒的灭活病毒 1936 黄热病 活减毒病毒 流感 灭活全病毒 1943 灭活完整（whole）病毒 1955 小儿麻痹 灭活病毒 1957 灭活病毒、鸭胚培养 1961 1963 麻疹 灭活病毒和减毒活病毒 1967 腮腺炎 1969 风疹

37 应用年份 疾病名称 疫苗类型 1972 流脑 纯化多糖A和C型 1974 日本脑炎（乙脑） 灭活病毒 1976 狂犬病
灭活病毒、人二倍体细胞培养 1981 乙型肝炎 灭活、血源苗 1982 脑膜炎球菌脑膜炎 纯化A、C、Y、W135型多糖 1983 活减毒病毒 水痘 1986 基因重组蛋白质疫苗 1991 甲型肝炎 活减毒病毒和灭活病毒 1998 轮状病毒腹泻 回归热 纯化蛋白质疫苗

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39 我国计划免疫接种表

40 免疫预防 免疫预防：根据特异性免疫应答的原理，采用人工方法将Ag/Ab制成各种制剂，接种于人体，使其产生/获得特异性免疫力，达到预防某些疾病的目的。 人工免疫： 人工自动免疫：用疫苗或类毒素等Ag接种机体，使之产生特异免疫，从而预防感染的措施 人工被动免疫：用Ab（抗毒素、免疫球蛋白）、细胞因子等制剂，使之获得特异免疫，达到治疗或紧急预防感染的措施。

41 人工主动免疫与被动免疫区别 人工主动免疫 人工被动免疫 接种物 抗原 抗体、细胞因子等 免疫力出现时间 慢，要经过1-4周 诱导期
快，即刻产生 免疫力维持时间 长（数月-数年） 较短（2周-数周） 用途 预防 治疗或紧急预防

42 （一）人工主动免疫生物制剂 国际上一般将细菌性制剂、病毒性制剂以及类毒素统称为疫苗 （vaccine）。
传统疫苗：完整的病原体为主制成的疫苗 新型疫苗：基因工程疫苗主要包括基因工程亚单位疫苗、基因工程载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、蛋白工程疫苗等等，广义的还包括遗传重组疫苗、合成肽疫苗、抗独特型抗体疫苗以及微胶囊可控缓释疫苗等

43 1、传统疫苗 种类 死疫苗 活疫苗 制剂性状 杀死病原体 毒力减弱或无毒的活病原体 接种次数及量 2-3次，用量大 1次，用量小 稳定性
稳定，易保存 稳定性差，不易保存 优点 免疫力短暂 免疫力持久，易于诱发全面免疫反应 副作用 无毒力回复突变 有毒力回复突变 举 例 狂犬病疫苗 小儿麻痹症疫苗

44 2、类毒素 类毒素：外毒素经0.3~0.4%甲醛处理后失去毒性，保留免疫原性 加入氢氧化铝作为佐剂 常用类毒素：白喉类毒素，破伤风类毒素
混合制剂如：百-白-破三联疫苗（百日咳菌苗，白喉类毒素，破伤风类毒素）

45 3、新型疫苗 包括基因工程亚单位疫苗、基因工程载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、蛋白工程疫苗、遗传重组疫苗、合成肽疫苗、抗独特型抗体疫苗以及微胶囊可控缓释疫苗等 对于免疫保护机制不明确，有潜在致癌性或免疫病理作用，及病原不能或难于培养的疫苗，使用传统疫苗技术很难研制成功 目前新型疫苗的研究主要集中在改进传统疫苗和研制传统技术不能解决的新疫苗两个方面，包括肿瘤疫苗、避孕疫苗及其它非感染性疾病疫苗的研究，其中发展治疗性疫苗已成为新型疫苗研究的重要组成部分

46 治疗性疫苗 2010年4月，美国食品与药品管理局（FDA）批准了首个治疗性疫苗——Provenge,这种疫苗可以激发免疫应答，对抗存在于大多数前列腺癌细胞中的一个特定的抗原或识别分子,对于某种特定类型的转移性前列腺癌男性患者，可以延长大约4个月的生命。 目前正在开发研究的治疗性疫苗：ICT-107， 治疗胶质母细胞瘤；VGX-3100，治疗宫颈癌；MAGE-A3，治疗转移性黑色素瘤和非小细胞肺癌；NeuVax，治疗乳腺癌；CRS-207，治疗胰腺癌；PEV7，治疗复发性外阴阴道念珠菌病，等等。

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48 （二）人工被动免疫生物制剂 多用于治疗或紧急预防 抗毒素(antitoxin)：外/类毒素→马→Ab
丙种球蛋白：人特异性Ig（含高价特异性抗体且超敏反应发生率低） ①来源于恢复期病人/含高效价特异性抗体供血者 ②来源于接种疫苗/类毒素的免疫者血浆 ③应用范围——易感人群、患者，不滥用 细胞因子

49 三、免疫治疗 主动免疫治疗和被动免疫治疗 特异性免疫治疗和非特异性免疫治疗 免疫增强治疗和免疫抑制疗法 如：人工特异性免疫生物制品
抗毒素；抗菌血清、抗病毒血清；胎盘球蛋白、丙种球蛋白；治疗性疫苗； 免疫增强治疗和免疫抑制疗法 免疫增强剂：IL-2,胸腺素，卡介苗、多糖等 免疫抑制剂：环磷酰胺

50 课后复习题 1、名词解释：ELISA 2、人工获得性免疫分哪两种？其主要区别是什么？结合实际举出一两个例子。 3、常见的人工主动免疫制剂和人工被动免疫制剂有哪些？ 4、 Ag、Ab反应有何特点？常见的Ag、Ab检测方法有哪些类型？ 5、ELISA的主要原理是什么？