艾滋病实验室检测技术.

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1 艾滋病实验室检测技术

2 2005艾滋病实验室检测主要工作 健全艾滋病检测实验室网络
完善艾滋病检测实验室网络管理体制，把国家CDC《全国艾滋病检测技术规范》（2004年版）的学习、理解、落实作为我省检测工作的重中之重。

3 《全国艾滋病检测技术规范》（2004年版） 宣 贯

4 样品的采集和处理

5 样品的采集和处理 艾滋病检测最常用的样品是血液，包括血清、血浆和全血。唾液或尿液有时也可作为测试样品。 血清样品采集和处理
用一次性注射器（或真空采血管）抽取一定量静脉血，室温下自然放置12h，待血液凝固、血块收缩后再用3000r/min离心15min，吸出血清备用。

6 滤纸片采样 手指或耳垂局部严格按常规进行消毒，在刺破皮肤后，迅速把滤纸片沾上，切勿让血液滴落在其它物体表面造成污染。采血后要待血样干燥后再包装送检。

7 抗凝血样品采集和处理 用加有抗凝剂的真空采血管（或一次性注射器抽取静脉血，转移至加有抗凝剂的试管），反复轻摇，分离血浆和血细胞备用。
应根据实验要求选用适当的抗凝剂，如CD4+/CD8+T淋巴细胞测定可选用K3EDTA或枸橼酸钠或肝素，HIV病毒分离、核酸定性/定量检测可选用K3EDTA或枸橼酸钠。

8 用于核酸定性检测时，采集的抗凝全血应在48h内分离PBMC和血浆，否则应在2448h内分离血浆和血细胞。
病毒载量测定不同方法对样品的要求。 CD4+/CD8+T淋巴细胞测定样品采集要。

9 采集样品注意事项 1 采集样品原则上应按临床采血技术规范操作（试剂盒说明书有特殊要求除外）。
1 采集样品原则上应按临床采血技术规范操作（试剂盒说明书有特殊要求除外）。 2 采集样品时应注意安全，建议采用真空采血管及蝶形针具，以避免直接接触血液； 直接接触HIV感染者/艾滋病（AIDS）病人血液/体液的操作,应戴双层手套。

10 样品的保存 1 用于抗体检测的血清或血浆样品，应存放于-20℃以下，短期（1周）内进行检测的样品)可存放于2-8℃。
1 用于抗体检测的血清或血浆样品，应存放于-20℃以下，短期（1周）内进行检测的样品)可存放于2-8℃。 2 用于抗原和核酸检测的血浆和血细胞样品应冻存于-20℃以下，进行病毒RNA检测的样品如需保存3个月以上应置于-80℃。 3 用于CD4+/CD8+T淋巴细胞测定的样品不能长期保存，样品采集时间超过48h则不可检测。

11 样品的运送 1 实验室间传递的样品应为血清或血浆，除特殊情况外一般不运送全血。 2 应采用三级包装系统（WHO提出）
1 实验室间传递的样品应为血清或血浆，除特殊情况外一般不运送全血。 2 应采用三级包装系统（WHO提出） 第一层容器：装样品，要求防渗漏。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。随样品应附有送检单，送检单应与样品分开放置。

12 第二层容器：要求耐受性好、防渗漏、容纳并保护第一层容器，可以装若干个第一层容器。将试管装入专用带盖的容器内，容器的材料要易于消毒处理。
第三层容器：放在一个运输用外层包装内，应易于消毒。在第三层容器外面要贴标签（标本的数量，收、发件人）。

13 3 血清和血浆样品应在28℃条件下由专人运送。用于CD4+/CD8+T淋巴细胞测定的样品应在室温下1823℃运送。每一包装的体积以不超过50ml为宜。
4 运送感染性材料必须有记录。

14 5 如分离血浆仍有困难，可直接将抗凝血-20℃以下冻存，采用冰壶冷藏运输，避免冻融。
6 特殊情况下如需对个别样品进行复测，可以用特快专递形式投寄，但必须按三级包装系统将盛样品的试管包扎好，避免使用玻璃容器，以保证不会破碎和溢漏。

15 样品的接收 1 含有感染性样品的包裹必须在具有处理感染源设备的实验室内由经过培训的、穿戴防护衣的工作人员打开，用后的包裹应进行消毒。
1 含有感染性样品的包裹必须在具有处理感染源设备的实验室内由经过培训的、穿戴防护衣的工作人员打开，用后的包裹应进行消毒。 2 核对样品与送检单，检查样品管有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出，对样品管和盛器消毒，同时报告有关领导和专家。

16 3 检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。如果污染过重或者认为样品不能被接受，则应将样品安全废弃。并要将样品情况立即通知送样人。
4 打开标本容器时要小心，以防内容物泼溅。样品处理时若内容物有可能溅出，则应在生物安全柜中戴手套进行。同时应戴口罩、防护眼镜，以防皮肤或粘膜污染。

17 5 因特殊临床治疗导致自发荧光的样品不可用于荧光方法测试。
6 接收样品时应填写样品接收单。

18 HIV抗体检测

19 HIV抗体检测实验室 应符合《全国艾滋病检测工作规范（1997年版）》中对检测实验室人员、建筑设施和设备等条件的要求。
应符合《实验室 生物安全通用要求》（GB ）对II级生物安全实验室（BSL-2）的各项要求。

20 HIV抗体检测的目的 HIV抗体检测的目的 1 HIV抗体检测可用于监测、诊断、血液筛查。

21 HIV抗体检测的要点 筛查试验阳性不能出阳性报告 严格遵守实验室标准操作程序（SOP） 严格按照试剂盒说明书操作 注意防止样品间交叉污染

22 常规HIV抗体检测的方法 HIV抗体检测分为筛查试验（包括初筛和复检）和确认试验。 HIV抗体检测筛查试验 筛查试剂
必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、批批检合格、在有效期内的试剂。推荐使用经临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。

23 酶联免疫试验（ELISA） 目前国内外主要使用第三代（双抗原夹心法）试剂，少数使用第二代试剂。血源筛查仍以第三代ELISA为主；
国际上有些国家和地区已将线性免疫酶测定（第四代ELISA试剂）用于血源筛查。第四代ELISA试剂是最近发展起来的HIV抗原抗体联合测定试剂，可同时检测P24抗原和抗HIV-1/2抗体。与第三代抗HIV-1/2试剂相比，检出时间提前了4~9.1d。其优点在于能同时检测抗原、抗体，降低血源筛查的残余危险度。

24 快速检测（RT） 随着对HIV感染者和AIDS病人抗逆转录病毒治疗的进展，及对无症状HIV感染者提供自愿咨询检测（VCT）的迫切需求，简便、快速的HIV检测方法被广泛应用 常用的主要有以下几种：

25 明胶颗粒凝集试验（PA） PA是HIV血清抗体检测的一种简便方法，是将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后保温（一般为室温）。当待检样品含有HIV抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。 PA试剂有两种，HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA试剂（AFD HIV-1/2 PA），已经我国食品药品监督管理局（SFDA）注册批准； HIV-1、HIV-2抗原分别致敏的PA试剂（SERODIA-HIV-1/2）可初步区分HIV-1型和HIV-2型，目前我国尚未引进。

26 斑点EIA或称斑点ELISA（dot-EIA）
以硝酸纤维膜为载体，将HIV抗原滴在膜上成点状，即为固相抗原。加血清样品作用，以后步骤同ELISA。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10 min以内，使用抗原量少。

27 斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验 与斑点EIA相似，也是以硝酸纤维膜为载体。区别在于不用酶标记抗体，而代之以红色的胶体金（或胶体硒）A蛋白，用渗滤法作为洗涤方法。试剂稳定，可室温长期保存。试验时不需任何设备，迅速、简便、特异性较好，敏感性约相当于中度敏感的ELISA，适用于应急检测、门诊急诊个体检测。目前已有在国内被SFDA批准注册的国外进口试剂和国内产品。一般可在10(30min内判读结果。

28 艾滋病唾液检测卡 在硝酸纤维膜上包被人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，可同时检测含在唾液中的HIV-1/HIV-2抗体，原理为酶免疫间接法。主要检测唾液中的HIV IgA与IgG抗体，敏感性特异性与ELISA相近，可避免静脉穿刺。但样品预处理时间长且售价较高。以唾液为样品测定HIV抗体的ELISA、免疫印迹法（WB）试剂已经美国FDA批准。

29 其它快速筛查试验方法 家庭HIV检测（Home Access System）等。

30 尿液HIV抗体检测 1996年美国FDA首次批准HIV-1尿液ELISA试剂，我国也正在研制尿液HIV抗体检测试剂。主要适用于静脉注射毒品（IDUs）人群和其它高危人群的大面积流行病学调查、监测。筛查阳性者仍需采血做确认试验才能确定。

31 筛查试验 根据检测目的选用符合要求的筛查试剂对样品进行初筛和重复检测（复检）。 1 初筛试验：以第三代ELISA（双抗原夹心法）为例。

32 试验开始前将试剂和样品放置在室温(18~23℃), 按实验室SOP做好试剂准备。
实验准备 试验开始前将试剂和样品放置在室温(18~23℃), 按实验室SOP做好试剂准备。 磷酸盐缓冲液：若液体内有结晶,应放置在37℃直至溶解，用蒸馏水1：25稀释浓缩液，4℃保存2周。 TMB底物液：使用前配制，TMB液和过氧化脲液等量混匀。 1M硫酸终止液：85 ml蒸馏水中加入5 ml浓硫酸。 备好试剂盒、待检样品和外部对照质控血清后，按试剂盒说明书以及质控和安全防护要求进行筛查检测。

33 实验操作 ①装好所需使用数目的孔条,每孔均加入100μl样品稀释液。设3个阴性对照孔，1个HIV-1阳性对照孔，若需要可再设1个HIV-2阳性对照孔。 ②每孔加入50μl待检样品及对照（对照要后加），未用孔用样品稀释液加满以溶解结合物球，以免堵塞洗板机孔。可震摇15S，37±2℃孵育60±5min。 ③置洗板机上洗涤6遍（用洗液将反应孔完全加满,静置3060S,共洗涤6遍，洗完后孔上方及底部不应残存液体,禁止在滤纸上拍干）。 ④每孔加入100μl底物液，勿搅动，室温避光孵育30±2min。 ⑤每孔加入100μl 1M硫酸终止反应，充分混匀。 ⑥在2h内置于酶标仪读数，单波长450nm，或双波长450/630nm测OD值。

34 实验结果 ①阴性对照（NC），HIV-1阳性对照（PC1），HIV-2阳性对照（PC2）
NC 必须＜0.25方可用，排除NC≥0.25的值，计算NC平均值。 NC界限范围：0.6倍NC均值＜NC＜1.4倍NC均值。 ②符合以下条件的实验成立： 两个以上的NC可用。 PC1-NC均值 ≥ 0.4，PC2-NC均值 ≥ 0.4 ③Cut off值 = 阴性对照均值 小于Cut off为阴性，大于或等于Cut off为阳性

35 报告 对呈阴性反应的样品，可由实施检测的实验室出具HIV抗体阴性报告；对呈阳性反应的样品，须进行复检，不能出阳性报告。

36 复检试验 对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的筛查试剂重复检测。如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室进行确认（见图1）。

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38 初筛试验结果的报告 对HIV抗体筛查试验，呈阴性反应者可出具“HIV抗体阴性”报告（可用附表1）；对初筛试验呈阳性反应者不能出阳性报告，可出具“HIV抗体待复查”报告（附表1）。

39 初筛试验呈阳性反应样品的转送 如需送上级实验室进行复测或确认，需要填写“HIV抗体复测送检单”，经1名检验人员和1名具有中级以上技术职称的人员审核签字。送当地艾滋病筛查中心实验室，再转送艾滋病确认实验室，或在本实验室复检后直接送确认实验室。

40 对筛查阴性和阳性者，均需做好检测后咨询。

41 HIV抗体确认试验 1 确认试验的试剂 2 确认试验方法 必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。
1 确认试验的试剂 必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。 2 确认试验方法 包括免疫印迹试验（WB）、条带免疫试验（LIATEK HIVⅢ）、放射免疫沉淀试验（RIPA）及免疫荧光试验（IFA）。国内常用的确认试验方法是WB。

42 确认检测流程 有HIV-1/2混合型和单一的HIV-1或HIV-2型。先用HIV-1/2混合型试剂进行检测，如果呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性；如果呈阳性反应，则报告HIV-1抗体阳性；如果不满足阳性标准，则判为HIV抗体检测结果不确定。如果出现HIV-2型的特异性指示条带，需用HIV-2型免疫印迹试剂再做HIV-2的抗体确认试验，呈阴性反应，报告HIV-2抗体阴性；呈阳性反应则报告HIV-2抗体血清学阳性,并将样品送国家参比实验室进行核酸序列分析，见图2。 图2 HIV抗体确认检测流程

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44 检测程序及结果报告 先用一种筛查试剂检测，出现阴性反应则报告“HIV抗体阴性（-）”。出现阳性反应则用两种不同原理或不同厂家的试剂复测（其中包括进口第三代ELISA试剂）。 两种试剂复测均为阳性，且其中第三代ELISA试剂复测样品OD值与临界值（Cutoff）的比值（S/CO）≥6.0者可作阳性考虑，上报疫情（附表4）。两种试剂复测结果均为阳性，但第三代ELISA试剂复测S/CO比值在1.0~5.9之间，或两种试剂复测结果呈一阴一阳，应进一步作确认试验。

45 艾滋病实验室安全防护 和职业暴露预防

46 规范性引用文件 《医务人员艾滋病病毒职业暴露防护工作指导原则（试行）》中华人民共和国卫生部，2004年5月31日颁布，2004年6月1日起实施。 《实验室生物安全通用要求》GB ，2004年10月1日起实施。 《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则（WS ）》中华人民共和国卫生行业标准， 发布， 实施。

47 实验室生物安全级别 艾滋病血清学检测 艾滋病血清学检测（包括筛查和确认实验室）、免疫学和核酸检测应在符合Ⅱ级生物安全实验室（BSL-2）要求的艾滋病检测实验室中进行。

48 HIV分离、研究 HIV分离、细胞培养及研究工作应在Ⅲ级生物安全实验室（BSL-3）中进行。

49 实验室安全防护 个人防护及保健 艾滋病实验室所用的个人防护装备均应符合国家有关标准的要求。

50 防护服 艾滋病实验室应为每个工作人员配备足够的防护服，包括白大衣、隔离衣或一次性工作服。平时应将清洁的防护服置于实验室清洁区内专用存放处。
离开实验室时，应脱去防护服。每次穿过的污染的防护服应及时放入污衣袋中，待消毒后方可洗涤或废弃。 当含有HIV的液体（样品或病毒培养液）及有可能溅到工作人员时，应使用防渗透性的（如塑料）围裙。

51 当发现防护服已被污染时，应立即更换。 艾滋病实验室应配备一次性手套、一次性口罩、安全防护眼镜及冲洗眼睛的装置。
艾滋病实验室应配备实验室专用的工作鞋，鞋面覆盖足背，鞋底防滑。

52 个人保健 高标准的个人保健对于减少感染的危险性很重要。皮肤受损、患病都会增加感染的危险。皮肤的任何伤口和擦伤都应以防水敷料覆盖。
进实验室前要摘除首饰，修剪长的带刺的指甲，以免刺破手套。 进入实验室应穿隔离衣，戴手套。如果接触物传染危险性大，则应戴双层手套和防护眼镜。 离开实验室前必须脱去隔离衣，并洗手。 严禁在艾滋病实验室内进食、饮水、吸烟和化妆。

53 建立安全制度 实验室的仪器设备、建筑和设施的安全性应符合《实验室生物安全通用要求》GB 19489-2004和本《规范》要求。
根据本《规范》制订本实验室的安全工作制度或安全标准操作程序（S-SOP），该制度或程序应适用于现有的实验条件，并与实验室其它规定相一致。 无论是否发生意外事故，每年都要对安全工作制度或安全标准操作程序及其实施情况进行检查和修订，并有记录。 制定意外事故处理预案。建立意外事故的登记和报告制度。 实验室主任负责组织对突发事件和职业暴露事故进行调查、登记、处理和报告。

54 人员培训和管理 向管理人员和所有检测人员提供并完成与工作相关的充足有效的技术培训。强化全员安全培训和“普遍性防护原则”安全意识。所有工作人员必须经过HIV检测技术和省级以上艾滋病实验室安全培训，包括上岗培训和复训，并接受实验室管理人员的监督。实验室的安全责任人要对工作和环境的安全负责，所有工作人员都有责任保护自己和他人的安全。

55 必须告知新上岗人员实验室工作的潜在危险，进行安全教育，直至有能力后方可单独工作。
实验室主任应了解所有工作人员。在安排工作区域时，要根据人员的工作种类和所涉及的生物材料，对实验室环境做好安全检查。 新调入人员、外来合作、进修和学习的人员在进入实验室之前必须经过实验室主任的批准。非实验室人员和非实验室物品不得进入实验室。 严格执行实验室工作人员年度采血检测HIV抗体和备案制度，工作人员血清应长期保留。实验室工作人员从事工作前必须进行HIV抗体和乙肝、丙肝等肝炎病毒标记物的检测；注射乙肝疫苗；每半年至1年进行1次HIV抗体检测，并保留血清样品。

56 建立严格的保密制度并定期检查 与HIV/AIDS相关检测项目的所有资料均应严格保密，包括送检单与检测记录的保管、报告单的发放和工作人员年度采血检测等。 艾滋病检测实验室所有人员应具有高度的保密意识。不可对无关人员透露检测结果。 保密制度纳入年度考核，发现问题及时处理并根据情况修订保密制度。

57 严格质量管理 按要求做好安全操作的管理以及检测试剂的选择、检测工作的室内质控和室间质评。 对所有检测报告严格把关，杜绝漏报、误报现象的发生。

58 对存放试剂和有毒物区域的监控 冷藏柜、冰箱、培养箱和存放生物试剂、化学危险品、放射性物质的容器置于工作人员视线之外的地点时应上锁。
应设有专门储存阳性血清、质控品的低温冰柜和/或血清库毒种库，并应上锁，专人管理。 各级实验室血清库/毒种库的设置按有关规定执行。

59 建立应付突发事件的措施 在紧急预案中要包括在紧急事件发生时通知实验室主任、设备管理员、实验室工作人员和设备安全员。
实验室主任和设备安全员要遵循有关规定，报告、调查和处理突发事件以及可能发生的意外职业暴露。

60 实验室的安全操作 在安排工作人员的实验室区域时，要根据其工作的种类和所涉及的生物试剂，对实验室环境做好安全检查。
进入实验室应穿隔离衣、戴手套，必要时（如对初筛阳性标本进行复测或确认时，或直接对HIV毒种进行操作时）戴防护眼镜，以防污染暴露的皮肤和衣物。不用戴手套的手触摸暴露的皮肤、口唇、眼睛、耳朵和头发等。 如接触物传染性危险大，可戴双层（两付）手套以增加保护。操作时手套破损，应立即丢弃、洗手并戴上新手套。

61 禁止采用口腔吸液管，必须使用移液器来操作实验室的所有液体。
操作中有标本、检测试剂外溅时应及时消毒。对大量溅出的浓度高的传染物在清洁之前应先用1%次氯酸钠溶液浸泡，然后戴上手套擦净。 工作完毕，要对工作台面消毒。工作台面应当用0.1%(0.2%次氯酸溶液消毒；用消毒液清洗后要干燥20min以上； 工作完毕，脱去手套后洗手，再脱去工作衣，用肥皂和流动水洗手。 血清及其它体液样品均应严格按要求妥善保存，HIV抗体阳性样品应做好标记单独保存。

62 避免利器的使用 尽量避免在实验室使用针头、刀片、玻璃器皿等利器，以防刺伤。如果必须使用，在处理或清洗时应采取措施防止刺伤或划伤，并应对用过的物品进行消毒处理。 尽量使用安全针具采血，如蝶形真空针，自毁性针具等，以降低直接接触血液和刺伤的危险性。 应将用过的锐器直接放入耐刺、防渗漏的利器盒，针头直接放入坚固的容器内，消毒后废弃。禁止将使用后的一次性针头重新套上针头套。禁止用手直接接触使用后的针头、刀片等锐器。

63 样品的采集 所有的血液、血清、未固定的组织和组织液样品，均应视为有潜在传染性，都应以安全的方式进行操作。
1 应象操作未知传染风险样品一样，小心存放、拿取和使用所有可能有传染性的质量控制和参考物质。用后的包裹应进行消毒。 2 采血时一定要注意安全，采血用一次性注射器，谨慎操作，防止发生刺伤皮肤和造成外界污染。 3 如用滤纸采样，则手指或耳垂局部消毒严格按常规进行。在刺破皮肤后，迅速把滤纸沾上，切勿让血液滴落在其它物体表面造成污染。采血后要待血样干燥后再包装送检。 4 离心机要使用密闭的罐和密封头，以防液体溢出或在超/高速离心时形成气溶胶。

64 带入和带出实验室的物品 1 对所有带入实验室的物品都应进行检查。含有测试样品的包裹应在安全柜或送到合适的实验室方可打开，不能在收发地点和仓库等地点打开，应有合适的包装（见第一章）并有醒目的标记。包裹必须在下列情况下才能打开：人员在处理感染源方面受过训练；具有处理感染源设备的实验室；穿戴防护衣的工作人员；用后置可消毒的容器中。 2 打开标本容器时要小心，以防内容物泼溅。核对样品与送检单，检查样品管有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出，对样品管和盛器消毒，同时要报告有关领导和专家。

65 3 检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。如果污染过重或者认为样品不能被接受，则应将样品安全废弃。要将情况立即通知送样人。
4 对血液和体液常规操作要在工作台上进行。样品处理时若内容物有可能溅出，则应在生物安全柜中戴手套进行。同时应戴口罩、防护眼镜，以防皮肤或粘膜污染。

66 5 在将HIV/AIDS样本转到其它实验室时，运送样本时应防止对工作人员、患者或环境造成污染。护送样品的人应明确接收地点和接收人，实验室负责人或其指定的人员应及时确认样品已送达指定的实验室，被转入安全位置并得到妥善处理。 6 污染或可能造成污染的材料在带出实验室前应进行消毒。 7 用于国际空运的样品要按照国际空运协会（IATA）的规则进行包装和标记，并提交相应的资料。

67 废弃物处置和消毒 废弃物处置 1 废弃物处置应符合《实验室生物安全通用要求》（GB ）和《消毒技术规范（2002年版）》。 2 从艾滋病实验室出来的所有废弃物，包括不再需要的样品、培养物和其它物品，均应视为感染性废弃物，应置于专用的密封防漏容器中，安全运至消毒室，并在高压消毒后再进行处理或废弃。

68 HIV常用的消毒方法 物理消毒方法 1 高压蒸汽消毒，121℃，保持15(20min;

69 HIV常用的化学消毒方法 HIV最常用的化学消毒剂是含氯消毒剂（次氯酸钠，含有效氯 mg/L）、75%乙醇和2%戊二醛，保持10(30 min。 1 废弃物缸：5000mg/L 次氯酸钠。 2 生物安全柜工作台面和仪器表面：75%乙醇。 3 溢出物：5000mg/L次氯酸钠。 4 污染的台面和器具：2000mg/L 次氯酸钠,也可以用过氧化氢或过氧乙酸。器械可用2%戊二醛消毒。

70 实验室意外和事故处理

71 意外和事故 意外是指发生了未导致个人伤害偶然发生的危险，但也可能已经发生了伤害。
事故是指发生了人身伤害。意外和事故都可被分为小型的和重大的。 小型意外：少量潜在传染性物质漏到椅子上，常用于这种情况的有效处理措施是消毒污染处。 重大意外：任何情况下，如果怀疑有严重性的意外，都将被视为重要的，实验室必须被清空，锁上，并且实验室管理者要请教安全专家，听从他们的意见。

72 意外和事故的紧急处理措施 发生意外事故时，应立即进行紧急处理，并报告实验室负责人。
1 皮肤针刺伤或切割伤：立即用肥皂和大量流水冲洗，尽可能挤出损伤处的血液，用70%乙醇或其它消毒剂消毒伤口。

73 2 皮肤污染：用水和肥皂冲洗污染部位，并用适当的消毒剂浸泡，如70%乙醇或其它皮肤消毒剂。
3 粘膜污染：用大量流水或生理盐水彻底冲洗污染部位。 4 衣物污染：尽快脱掉污染的衣物，进行消毒处理。 5 污染物泼溅：发生小范围污染物泼溅事故时，应立即进行消毒处理。发生大范围污染物泼溅事故时，应立即通知实验室主管领导和安全负责人到达事故现场查清情况，确定消毒的程序。

74 低温蒸汽甲醛气体消毒 由于甲醛有致癌作用，不宜用于生物安全柜和实验室的常规空气消毒。

75 如果实验室一旦发生了重大泼溅事故，应按严重情况处理，并采取以下措施：
（1）从污染处疏散人员，但要防止污染扩散； （2）控制污染--锁门并防止进一步进入； （3）通知实验室主管领导、安全负责人等，以便查清情况，确定消毒处理的程序； （4）发生溢出后应离开房间约30分钟。 穿防护服，被溅的地方用经消毒剂浸泡的吸水物质覆盖；消毒剂起作用10－15分钟后清理该地方。移走吸水性物质，用消毒剂冲洗该地方。

76 （5）如果认为合适，可进行生物安全柜和/或实验室的低温蒸汽甲醛气体消毒，但生物安全柜和/或实验室必须有可靠的密闭性能，人员必须完全离开。【生物安全柜：25ml福尔马林和等量水混合后放在一个蒸发皿中使其在密封的生物安全柜中蒸发，保持至少6h，最好过夜。实验室：福尔马林和水的体积根据实验室大小而定】。具体操作可按说明书执行。

77 意外和事故登记、报告和检测 重大意外和事故必须进行登记，内容包括： 1 意外和，事故发生的时间、地点及详细经过。
1 意外和，事故发生的时间、地点及详细经过。 2 处理方法和经过，包括专家或领导赴现场指导和处理的情况。 3 随访检测的日期、项目和结果。

78 意外和事故的报告和检测 发生重大事故时，在紧急处理的同时要立即向主管领导和专家报告。同时抽血检测HIV抗体，暴露后4周、8周、12周、6个月要定期检测。 发生小型事故时可在紧急处理后立即将事故情况和处理方法报告主管领导和专家。

79 艾滋病的职业暴露后预防 职业暴露 艾滋病的职业暴露是指医务工作者、实验室工作人员及有关监管人员在从事HIV/AIDS诊断、治疗、护理、预防、检验、管理工作过程中，暴露于含有HIV的血液、体液和实验室培养液，即暴露于含有HIV的液体等引起的危害。

80 HIV/AIDS的职业暴露后预防 HIV/AIDS的职业暴露后预防（Post exposure Prophylaxis，PEP）应包括急救、对暴露级别的评估、暴露源严重程度的评估、预防性用药的推荐处理方案、报告与保密。

81 急救处理 刺激出血：职业暴露的紧急处理，只要情况允许，应实行急救。如皮肤有伤口，应当反复轻轻挤压，尽可能挤出损伤处的血液。
肥皂和清水冲洗伤口或沾污的皮肤。如果是粘膜暴露，应用生理盐水（或清水）反复冲洗。 受伤部位的消毒与包扎：伤口应用消毒液（如75%酒精、2000mg/L 次氯酸钠、0.2%(0.5%过氧乙酸、0.5%碘伏等）浸泡或涂抹消毒，并包扎伤口。 由于暴露后有无采取急救措施对职业暴露后HIV感染有一定影响，故应尽量为受伤者寻找医疗机构，以求正确护理伤口和暴露后急救处理。 可介绍已发生职业暴露的人员到艾滋病防治机构进一步咨询和处理。

82 暴露物是否是传染性物质，如血液、含血体液、其它传染性物质或被其污染的器械
暴露级别的评估，分为1、2、3级 暴露物是否是传染性物质，如血液、含血体液、其它传染性物质或被其污染的器械 是 否 其它潜在传染性物质 血液或含血液体 暴 露 的 类 型 不需预防性治疗 粘膜或可能有损伤的皮肤 暴露量 量小 暴露时间短 1 级暴露 量大 暴露时间长 2 级暴露 只沾染完整的皮肤 刺、割伤皮肤 不需PEP 危险度 低危 如：表皮 擦伤、针刺等 高危 如：伤口较深、仪器上可见血液等 3 级暴露

83 暴露源的HIV滴度低（无症状、CD4计数高） 暴露源的HIV滴度高（有症状、CD4计数低）
无需PEP 暴露源不明 HIV暴露源级别1（轻度） 暴露源的HIV滴度低（无症状、CD4计数高） 暴露源的HIV滴度高（有症状、CD4计数低） HIV暴露源级别2（重度） HIV暴露源级别不明

84 不一定使用ＰＥＰ，可由职业暴露者本人根据利害比较作出决定
职业暴露后预防性用药的处理方案 暴露级别 暴露源级别 预防性用药推荐处理方案 1 １ 不一定使用ＰＥＰ，可由职业暴露者本人根据利害比较作出决定 2 使用基本用药程序（1） 使用基本用药程序 使用强化用药程序（2） 3 1或2 使用强化用药程序 不明 暴露源级别不明

85 基本用药程序 两种逆转录酶制剂，使用常规治疗剂量，AZT（每次200mg，每日3次，或每次300mg，每日2次）+拉米夫定（每次150mg每日2次），连续使用28d。或双汰芝（AZT与3TC联合制剂）300mg/次，每日2次。

86 强化用药程序 基本用药程序加一种蛋白酶抑制剂，茚地那韦（800mg，tid，饭前1h及饭后2h服用），均使用常规治疗剂量。

87 用药注意事项 在暴露后预防性用药应立即开始，最好在暴露后1(2h之内。虽然动物研究显示24(36h之后再进行预防性用药可能已无效，但是还不确定对人类无效。对于感染危险性很高的暴露者，即使间隔时间很长（比如1(2周），也应考虑使用预防性治疗；因为即使不能防止感染，早期治疗对HIV急性感染也有好处。由于服用4周AZT才有一定保护作用，如果无很大的副作用，预防性治疗用药时间应持续4周。 如果出现主观的或客观的毒副作用，应在专家的指导下，减少剂量或换用药物，并详细记录药物毒副作用情况。 育龄妇女使用AZT作为预防用药期间，应避免或终止妊娠。

88 HIV暴露后预防的具体建议 （1）如果存在用药指征，则应当在暴露后尽快开始PEP。

89 登记、监测、报告与保密 建立职业暴露登记和监测制度
（1）职业暴露登记制度：职业暴露事故的事故发生单位应建立“艾滋病职业暴露人员个案登记表”（附表7），对职业暴露情况进行登记、保存和上报。详细记录职业暴露发生的时间、地点及经过；暴露方式；损伤的具体部位、程度；暴露物种类（培养液、血液或其它体液）和含有HIV的情况；处理方法及处理经过（包括赴现场专家或领导活动）；是否采用暴露后预防药物，并详细记录用药情况、首次用药时间（暴露后几小时或几天）、药物毒副作用情况（包括肝肾功能化验结果）、用药的依从性状况。

90 （2）当地疾病控制部门为职业暴露处理单位，重大职业暴露发生单位应及时与当地疾控中心取得联系。当地疾控中心应与当地有关专家联系根据情况共同进行风险的评估，确定用药的必要性、确定预防药物和用药程序，并将处理情况向主管行政部门报告。 （3）监测暴露源：如果暴露源没有阳性或阴性的血清学化验结果应立即检测，最好做快速试验，因其结果可在几十分钟内得到。如果暴露源有急性HIV综合征的症状，应同时检测病毒载量。

91 （4）监测职业暴露者：由本省HIV监测（或确认）中心抽血检测职业暴露者的HIV-1/2抗体（包括做快速试验），该血清留样备用。如果职业暴露者以前已有HIV抗体的化验结果，则应加以记录。暴露后1年内要定期监测HIV抗体，即分别在暴露后4周、8周、12周、6个月监测。结果填写在报来的“艾滋病职业暴露人员个案登记表”（附表7）内。 （5）使用预防性用药，应注意监测药物的毒副作用，包括使用预防性治疗时和服药两周后的全血检测、肾功能和肝功检测。小型事故可在紧急处理后，立即将事故情况和处理措施报告主管领导和有关专家，以及时发现处理中的疏漏之处，使处理尽量完善妥当。不采取暴露后预防用药者，也要定期检测HIV抗体，检测时间同前。

92 保密和报告制度 保密：无论职业暴露、重大事故或小型事故，对涉及的职业暴露者，均应注意做好保密工作。每一个得到信息的机构或个人均应做好保密工作。 报告制度：各职业暴露处理单位及时将填报的“艾滋病职业暴露人员个案登记表”（附表7）报至本省疾病预防控制中心（简称省疾控中心）。每年1月10日和7月10日前，省疾控中心汇总本省职业暴露情况，填写“艾滋病防治工作人员职业暴露事故汇总表”（附表8），汇总后报至本省（直辖市、自治区）卫生厅（局），抄报中国疾控中心性艾中心。

93 安全药品储备点的建立及管理机制 各省应将职业暴露安全药物储备点（下称储备点）的工作纳入省卫生行政部门的艾滋病防治工作规划，尽快筹建贮备点，组建由疾病预防控制专家和临床专家组成的专家组，根据本省需求储备适量的职业暴露预防药品。

94 各省药物贮备点可设在省疾控中心，或卫生行政及其它系统的主管部门指定的单位。
各省和各系统筹建的贮备点，需在中国疾控中心性艾中心备案。 职业暴露安全药品由国家免费抗病毒治疗药品库统一调配。

95 各省和各系统的安全药品贮备点负责本辖区内或本系统职业暴露事故预防性用药，包括对暴露级别、暴露源头严重程度进行评估，确定用药方案，并负责事故后的咨询、技术指导、分析总结等工作。
各省药物储备点应严格按照本规范的要求做好药品的使用、发放、更新和管理以及事故的登记、处理和跟踪检测等工作。

96 艾滋病实验室质量管理

97 规范性引用文件 《全国艾滋病检测工作规范》，卫生部，1997。
ISO 15189, Medical Laboratories-Particular requirements for quality and competence (formerly Qualily Management in the Medical Laboratory). NCCLS C24-A2. Statistical Quality Control for Quantitatire Measurements; Principles and Definitions; Approved Guideline-Second Edition.

98 质量保证（QA） 行政支持 实验室规范化建设
行政部门和领导要关心艾滋病实验室的建设和发展，保证实验室负责人和主要技术人员队伍的稳定，保证实验室建筑和设备需要，给予充足的经费支持，并进行经常性监督检查。 实验室规范化建设 艾滋病实验室的设置及其建筑、设施、设备必须符合《全国艾滋病检测工作规范》的要求。

99 人员培训及其评价 实验室工作人员上岗前必须接受技术培训并获得合格证书。在工作中要定期或不定期接受复训。实验室主管领导应定期对工作人员进行评价，包括工作的准确性、效率、执行安全条例和规章制度情况、职业道德、出勤率以及上岗资格等。 标本采集、运送和处理

100 检测方法和试剂的选择 应使用可靠的检测方法和敏感性高、特异性好的试剂，并定期进行质量评价。

101 设备维护与校准 设立常用仪器的维护及校准制度，以保证正常运转。 1 酶标读数仪、洗板机
1 酶标读数仪、洗板机 每天：核对滤光片波长，检查洗板机管道是否通畅，是否有漏液现象。 每周：清洁仪器表面，保护光学零件不沾灰尘。 每月：检查洗涤时各孔是否与相应的冲洗头对位良好，负压是否符合规定要求。 每年：检查、清洗滤光片，如果出现破裂或霉点则要更换。根据仪器内具有的校准程序或使用校准板，对滤光片的精密度进行校准并保留记录。 实验过程中发现异常情况，应随时进行处理，可根据使用情况更换必要的部件。

102 移液器 1年至少应该标定1次，发现异常情况应随时进行校准。
标定方法包括有色溶液光谱分析法、称量校准法、同位素计数法以及使用配套校准盒等。校准多道移液器时，必须保证每一个加样头都能够连续、准确地加样。移液器的精密度应在厂家说明书规定的范围内。 范例 用蒸馏水称量法标定移液器： 在室温22℃无风的工作室中，在万分之一级别天平上放置一个小三角烧瓶，用待校准的移液器吸取存放过夜的蒸馏水加入烧瓶底部，称重并计算蒸馏水重量，连续称重10次。加蒸馏水的量根据待校准移液器的规格而不同（表6），10次校准称量均在要求的重量范围内为合格，贴上合格标签，注明校准日期，不合格移液器要请生产厂家进行校准。填写和保存校准记录。

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104 3 冰箱和孵育箱 4 定期检查其它仪器设备 必须每天检查和记录低温、超低温冰箱及孵育箱的温度，并做好记录。
3 冰箱和孵育箱 必须每天检查和记录低温、超低温冰箱及孵育箱的温度，并做好记录。 4 定期检查其它仪器设备 精密仪器及出具实验结果的仪器必须定期校准，其它仪器定期检查并做好记录。

105 文件和文件管理 标准操作程序 (SOP) 艾滋病实验室要建立覆盖主要工作内容的SOP文件。艾滋病实验室应建立以下SOP：
（1）样品的接收、登记和处理， （2）检测方法和步骤， （3）仪器的使用维护和校准， （4）实验中的质量控制， （5）结果解释与报告， （6）保密程序， （7）检测数据的记录与保存， （8）追踪和处理， （9）实验室的清理和消毒， （10）实验室安全防护。

106 SOP通常包括（但不限于）以下内容 （2）编写和修改日期 （3）编写和修订人员姓名 （4）方法、目的和应用范围 （5）相应的职业规范
（1）标题和编号 （2）编写和修改日期 （3）编写和修订人员姓名 （4）方法、目的和应用范围 （5）相应的职业规范 （6）检测设备和试剂 （7）安全防护相关步骤 （8）结果的解释和报告 （9）附录，包括相关的附加文件如标准表格、设备和试剂盒说明书等。

107 SOP由各岗位工作人员起草， 实验室主任审定，并应定期修订。 修订应该在实验室主管人员（技术负责人）的领导下进行，每年至少1次。 所有工作人员要在所从事工作的SOP文件上签名表示已经阅读并掌握了有关内容。

108 实验原始记录表 应按实验要求，设计操作的原始记录表，标明空白对照、阳性对照、阴性对照、外部对照以及待检样品的位置，便于指导实验人员加样。要注明试剂盒厂家、测定方法、批号、效期、操作人员和复核人员姓名及检测日期。 标本的登记 收到标本后，及时登记有关参数，包括受检者姓名或代号、试管编号、性别、年龄、职业、送检单位、人群类别、检验结果、送检日期、报告日期、备注 ( 必要时记录通信地址 )等。

109 HIV阳性标本的保存记录 文件存档 包括HIV阳性标本的类型、贮存量、贮存温度、贮存起始时间以及标本保管人姓名。
实验原始记录表、打印数据、免疫印迹试验的膜反应条带或其照片、检测记录表、标本登记、标本保存记录以及仪器设备维修和校准记录等都应该妥善存档保存15年以上。最好同时使用计算机保存各种文件和记录。

110 质量控制（QC） 质控血清的制备和保存（以ELISA试验检测HIV抗体为例） 在每次实验中必须包含有内部对照质控血清和外部对照质控血清。
内部对照质控血清指试剂盒内提供的阳性和阴性对照血清。内部对照是质量控制的基础。每一次检测必须使用内部对照，而且只能在同批号的试剂盒中使用。 外部对照质控血清是为了监控检测的重复性和稳定性以及试剂盒批间或孔间差异而由实验室设置的一套对照血清，包括强阳性、弱阳性和阴性对照血清。也可以只设置一个弱阳性对照，以该试剂盒临界值（Cut-off）的2~3倍为宜。

111 外部对照质控血清的制备 HIV抗体阳性和阴性血清，56℃ 30min灭活，3000r/min，离心15min。
弱阳性对照可以用HIV抗体阴性血清梯度稀释HIV抗体强阳性血清并标定后得到。按一年使用量配制（可加入不影响检测结果的防腐剂）用0.2μm滤膜过滤除菌。

112 外部对照质控血清的保存 按一周实验用量分装、分类、标记、封口、-20℃冻存于非自动除霜冰箱中。
外部对照血清不可反复冻融，一旦融化后应该存放28℃，供一周内使用。

113 外部对照质控血清的使用 每一次实验必须使用外部对照质控血清，以便监控实验的重复性和稳定性。同时可以了解各批试剂盒的批间或孔间差异，绘制质量控制图。 外部对照质控物的质量要求 质控物的管间或瓶间变异必须小于监测系统预期的变异（cv＜20%），并且质控物的成分应在稳定状态中。质控物应无菌，并不含有影响ELISA反应的防腐剂。

114 质控图的建立及应用 （以ELISA试验检测HIV抗体为例）
最常用的质控图是Levey-Jennings质控图，使用累计和技术或趋势分析技术的图形可提供系统偏移和漂移的状况。 1 建立质控图参数 外部对照质控物的平均值和标准差应建立在实验室常规使用方法对质控物重复测定的基础上。 一般采用在不同批次检测取得至少20个数据；如果仅做少量批次的检测，也至少做5个批次的检测，每个批次中不少于4个质控物测定结果，以建立一个临时性的平均值和标准差，当达到20批次数据后，替代临时性的平均值和标准差。

115 算术平均值 (x )： 代表一组S/CO值的平均值。为了统计学上有显著性意义，应该采用至少20次(天)所测得的外部对照质控血清S/CO值结果计算出平均值。
标准差(s)：是描述样品与均数之间离散程度的一个指标，是与对照质控血清S/CO值均值有关的预期范围。一组S/CO值的标准差以s表示。

116 变异系数(cv)：是反映各次S/CO值相对于均值离散程度的一个指标，可以用来衡量检测的重复性或精密度。
控制限：由实验室根据对质控物检测结果的平均值和标准差来确定。 外部对照S/CO平均值加减2个标准差。

117 计算公式

118 绘制质控图 质控图是把检测数据与已确定的（计算出的）“控制限”进行比较的图，包含一条中心横线和其上、下两条平行的控制线，并按时间顺序点入本实验室每次试验质控血清的测定值。

119 质控图的绘制步骤 在常规条件下，对同一批血清连续测定20次（天）或以上，获得一组S/CO值，求均数(X)和标准差(s), 超出2s或3s的数据不应删除。 将均值(X)和标准差(s)分别在质控框架图中标示出来。以S/CO值作纵座标(Y轴)，每一次(天)试验作横座标(x轴)，绘制质控图。 从第21次起，将每次质控血清的检测结果依次点入该质控框架图中，检验进入质控状态。

120 质控规则及使用 实验室在报告实验结果之前必须评价质控数据，可通过图形记录的检查或由计算机审核结果来决定。目前许多质控规则已被采用，常用的是12S和13S规则。 告警（12S）：当外部对照的S/CO值超出+2s范围时，系统处于告警状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观察。若将12S做失控标准，有较高的假失控概率，所以一般不采用。 失控（13S）：当外部对照的S/CO值超出+3s范围时，系统处于失控状态，本次实验结果不能被接受，可能是系统误差、随机误差或外部对照滴度下降造成。 位移：连续几次（3~5次）外部对照S/CO值都落在均值的一侧则称为位移，提示实验条件发生了较大的变化。

121 趋势：连续几次（5~7次）外部对照S/CO值几乎按一个方向分布时称为趋势，通常由参数的缓慢改变引起。
质控规则的使用应检出随机误差和系统误差，即具有高的检出分析误差的能力，同时应具有较低的假失控概率。考察试验系统的可靠性应采用多标准质控方案，多规则质控方法能提高误差检出，并具有低的假失控概率。其要点为： 出现一次2s范围的变化时，系统处于告警状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观察。 出现下列情况时，应暂停检测查找原因：出现一次3s范围的变化、连续两次出现同一方向2s范围的变化、连续四次出现同一方向的1s范围的变化、连续10次结果都在1s范围内，但落在均值线的同一侧。

122 质控图的分析及失控处理 实验室应建立质控图分析及失控情况处理程序。
当质控已有计划并恰当地执行时，要求可靠的平均值和标准差用于计算质控限，将假失控概率降到最低。当出现失控时进行如重复质控测定或重新分析新的质控物不是最有效的方法，必须找出问题原因，找出解除故障的方法，并消除原因，防止将来出现同样的问题。

123 绘制和分析质控图的要点 1、要在常规条件下建立质控图参数，
2、用S/CO比值绘制质控图。对同一批质控物连续测定得到20个数据，求均值(X)和标准差(s), 超出2s或3s的数据不应删除。 3、由专人负责建立质控图，每月定期召开质控分析会，讨论本月的质量控制情况。 4、建议长期和稳定地使用一种质量好的试剂盒， 5、更换不同厂家的试剂盒后，必须重新绘制质控图。改用新批号试剂盒也应重新制作质控图。使用新批号或不同厂家的试剂盒必须在质控图上注明使用日期。 6、发现质控结果失控，应填写报告单，上交质量负责人，分析原因并决定是否发出检测报告。 7、使用新批次的外部对照质控物时，必须重新绘制质控图。变异系数(cv)小于20％，表示外部对照处于稳定状态。

124 “即刻法”质控 “即刻法”质控方法是在对同一批外部质控血清连续测定3次后，即可对第3次检验结果进行质控。具体计算方法如下：
1 将质控血清的测定值从小到大排列：x1，x2，x3……xn(x1为最小值，xn为最大值)。 2 计算 X和s。 3 计算SI上限值 和SI下限值。

125

126 将SI上限、SI下限与SI值表（表7）中的数字比较

127 （1）当SI上限和SI下限<n2s时表示处于控制范围内，可以继续测定。继续重复以上各项计算。
（2）当SI上限和SI下限有一值处于n2s~n3s值之间时说明该值在2s(3s范围，处于“告警”状态。 （3）当SI上限和SI下限有一值> n3s值时说明该值已在3s范围之外，属“失控”。数值处于“告警”和“失控”状态应舍去，需重新测定该质控血清和病人样品。舍去的只是失控的这次数值，其它测定值仍可继续使用。

128 质量评价（EQA） 室间质量评价是检验实验室对未知样品获得正确结果的能力。 评价体系
1 艾滋病参比实验室和一些艾滋病确认中心实验室参加相关国际机构的室间质量评价活动。 2 艾滋病参比实验室对全国艾滋病确认中心实验室和艾滋病确认实验室进行室间质量评价，并负责提供室间质量评价标本、评价标准以及有关文件。 3 艾滋病确认中心实验室对本省的艾滋病筛查实验室进行室间质量评价。

129 质量评价参比标本 经过确认的HIV抗体阳性、弱阳性和阴性血清或血浆标本； 应清亮、无溶血、无菌、五过多的脂质 经过加热灭活并加防腐剂处理；
等量分装后低温存放； 发放标本时，每套质控物有一个外包装； 经过标定和统计学处理，数据保密； 失效标本按传染病生物材料处理办法销毁。

130 评价程序 我省每年一次 质量评价管理 及时总结经验。

131 谢 谢 !