第二节 蛋白质的生物合成.

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1 第二节 蛋白质的生物合成

2 蛋白质的合成是从氨基端到羧基端还是从羧基端到氨基端？
一、多肽合成方向 蛋白质的合成是从氨基端到羧基端还是从羧基端到氨基端？ 1961年Dintzis等人用3H-亮氨酸作标记分析了兔网织红细胞无细胞体系中血红蛋白生物合成的过程。 血红蛋白分子含有较多的亮氨酸，而且其氨基酸顺序是已知的。 他们将活跃进行血红蛋白合成的网织红细胞（不成熟的红细胞）与3H亮氨酸较低温度(15℃)保温，以降低合成速度。

3 一、多肽合成方向 在460分钟内，按不同时间间隔取网织红细胞样品，将其中带有标记的蛋白质分离出来，将和链分开，并用胰蛋白酶水解肽链，生成的肽段再用纸层析分离，并测定所含的放射性强度。

4 Conclusion ? 一、多肽合成方向 表明多肽链的合成是从氨基端到羧基端进行的
兔网织红细胞的一个核糖体合成一条完整的血红蛋白-链（146个氨基酸残基），37℃时约需3分钟。大肠杆菌具有更高的速度，一个核糖体每秒钟可延伸20个氨基酸。

5 一、多肽合成方向 许多实验已经证明，mRNA上信息的阅读（翻译）是从mRNA的5端向3端进行的。如用人工合成的的多核苷酸5pAAA (AAA)nAACOH3 作模板，在无细胞蛋白质合成体系中测定mRNA的读码方向。AAA编码赖氨酸，而AAC编码天冬酰胺。此多肽产物是：赖氨酰（赖氨酰）n天冬酰胺。 由于天冬酰胺是羧基端的残基，所以它的密码子AAC是最后才被翻译的。

6 第一，蛋白质的合成依赖于tRNA的接头作用，以保证正确的氨基酸得到整合，每个氨基酸为了参与蛋白质合成必须共价连接到tRNA分子上。
二、氨基酸的活化 1.氨酰-tRNA的形成 游离氨基酸掺入多肽链以前必须活化即氨基酸与特异tRNA形成氨酰-tRNA。原因有两个： 第一，蛋白质的合成依赖于tRNA的接头作用，以保证正确的氨基酸得到整合，每个氨基酸为了参与蛋白质合成必须共价连接到tRNA分子上。 第二，氨基酸与tRNA之间形成的共价键是一个高能键，它使氨基酸和正在延伸的多肽链末端反应形成新的肽键，因此, 这一氨酰-tRNA的合成过程被称为氨基酸的活化。

7 二、氨基酸的活化 1.氨酰-tRNA的形成 氨基酸的活化是指氨基酸与tRNA相连，形成氨酰-tRNA的过程。

8 氨基酸羧基通过酸酐键与AMP上的5-磷酸基相连

9 二、氨基酸的活化 氨酰-tRNA合成酶： 此酶具有较高专一性，能有效识别tRNA和相应的氨基酸。 此酶具有校对功能。 活化一个氨基酸消耗2分子ATP。

10 二、氨基酸的活化 2. 起始氨酰tRNA的形成 1）识别mRNA的起始密码子为AUG，AUG对应的氨基酸为Met。 2）有两种甲硫氨酸专一性的tRNA： tRNAfmet—只与起始密码子结合 tRNAmmet—只与肽链内部的AUG有关 在原核生物中，多肽链起始的氨基酸均为甲酰甲硫氨酸。

11 二、氨基酸的活化 2. 起始氨酰tRNA的形成 在真核生物中，多肽链起始的氨基酸均为甲硫氨酸 tRNAimet—只与起始密码子结合 tRNAmet—只与肽链内部的AUG有关

12 二、氨基酸的活化 原核生物中的fMet-tRNA的合成 甲硫氨(蛋氨)酰tRNA合成酶 Met + ATP + tRNA  Met – tRNA + AMP + PPi

13 二、氨基酸的活化 原核生物中的fMet-tRNA的合成 Met-tRNA在转甲酰酶的作用下，在其Met的-NH2上甲酰化。 fMet – tRNA

14 在翻译的起始阶段，还需有3种蛋白质因子 —— 起始因子(IF)的参与，即IF1、IF2、IF3。
1. 起始 三、多肽链合成的过程 在翻译的起始阶段，还需有3种蛋白质因子 —— 起始因子(IF)的参与，即IF1、IF2、IF3。 起始复合物的结构： 此时核糖体的P位被起始氨酰-tRNA占据，A位空着，等待能与第二个密码子匹配的氨酰-tRNA进位。 

15 1. 起始 三、多肽链合成的过程 指核糖体与mRNA及起始氨酰-tRNA结合成起始复合物 分为三步： (1) 核糖体的小亚基30S与mRNA结合 小亚基识别mRNA上翻译的起始信号，并结合在这个部位，它的P位正好落在起始密码子AUG处。形成“小亚基 - mRNA”二元复合物。

16 形成起始复合物，即“核糖体 — mRNA — fMet-tRNA”三元复合物
1. 起始 三、多肽链合成的过程 (2) 起始氨酰-tRNA结合上去 起始氨酰-tRNA与mRNA上的起始密码子结合（通过反密码子与密码子之间的碱基互补配对），形成“小亚基 — mRNA — fMet-tRNA”三元复合物 (3) 大亚基结合上去形成70S起始复合物 形成起始复合物，即“核糖体 — mRNA — fMet-tRNA”三元复合物

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18 与A位处的密码子相对应的aa-tRNA进入核糖体的A位
2. 肽链的延长 三、多肽链合成的过程 这一阶段是在fMet（或肽链）的C末端逐个的添加aa，使肽链不断延伸。 每延伸一个aa，需要经历三步： 1）进位 与A位处的密码子相对应的aa-tRNA进入核糖体的A位

19 2. 肽链的延长 三、多肽链合成的过程 2）转肽 P位tRNA上的甲酰甲硫氨基转移至A位tRNA上的aa的氨基上，形成肽键。

20 核糖体在mRNA上向3'端移动一个密码子的距离，这样，原P位空载的tRNA离开了核糖体，原A位的肽酰- tRNA落在P位，而A位空了出来。
2. 肽链的延长 三、多肽链合成的过程 3）移位 核糖体在mRNA上向3'端移动一个密码子的距离，这样，原P位空载的tRNA离开了核糖体，原A位的肽酰- tRNA落在P位，而A位空了出来。

21 2. 肽链的延长 三、多肽链合成的过程 通过以上三步，完成了氨基酸的一轮添加。每延伸一个氨基酸，需要消耗 2 分子GTP→GDP。（进位和移位） 此过程还需要一些蛋白质因子的参与，称为延长因子（EF）  随着核糖体在mRNA上从 5'→3' 方向滑动，新生链从 N端→C端 延伸。mRNA上的核苷酸序列被“翻译”成多肽链上的氨基酸序列

22 四、肽链合成的终止与释放 核糖体的大小亚基解离并离开mRNA。
当核糖体在mRNA上由5'→3'移动至终止密码子（UAA、UAG、UGA）时，由于没有与之相应的tRNA，终止因子RF进入A位。 1 终止因子使肽基转移酶的活性转变为水解酶活性 (肽基不再转移到氨酰tRNA上，而是转移给水分子)，从而将肽酰tRNA水解。这样肽链被释放。 2 空载的tRNA也离开核糖体。 3 核糖体的大小亚基解离并离开mRNA。 4

23 五、多肽链合成的能量消耗 蛋白质的生物合成是个高耗能过程。 仅翻译过程，其能量消耗情况如下： NTP 高能磷酸键 氨基酸的活化 ATP 2/aa 肽链合成的起始 GTP 1 肽链的延伸 2/轮aa添加 肽链合成的终止 

24 五、多肽链合成的能量消耗 例：以游离的氨基酸为原料，起始合成一个100肽，至少需要消耗多少ATP？ （注：ATP→AMP折算成2个ATP，GTP折算成ATP） 解法一：分阶段累计 2×100 ＋ 1 ＋ 2×99 ＝ 399

25 五、多肽链合成的能量消耗 解法二：以aa为单位累计 ∵ 每个游离的氨基酸参入到正在合成的多肽链中，至少需要消耗 4 个高能磷酸键（活化 — 2个；氨酰tRNA进入A位 — 1个；核糖体移位 — 1个）。 但起始的氨基酸要少消耗1个GTP（可理解成它直接进入P位，不要移位）∴ 4n－1 ＝ 4×100－1

26 六、多肽链合成的速度 蛋白质的生物合成的速度极快。在最适条件下，合成一条含400个氨基酸残基的多肽链大约只要10秒钟。
多核糖体：在一条mRNA链上，可以有多个核糖体同时进行翻译，每个核糖体上都附着一条正在延长的多肽链，越靠近mRNA的3′端的核糖体上的肽链越长。这种结构叫做多核糖体。

27 多核糖体的结构可大大提高mRNA的翻译效率。
六、多肽链合成的速度 多核糖体：在一条mRNA链上，可以有多个核糖体同时进行翻译，每个核糖体上都附着一条正在延长的多肽链，越靠近mRNA的3′端的核糖体上的肽链越长。这种结构叫做多核糖体。 mRNA上核糖体的多少，视 mRNA 链长而定。一般每隔40个核苷酸有一个核糖体。  多核糖体的结构可大大提高mRNA的翻译效率。

28 七、多肽链合成后的加工 1. 多肽链的折叠 多肽链的折叠是指从多肽链氨基酸序列形成正确的三维结构的过程。
蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase）和肽基脯氨酸异构酶（peptidyl prolyl isomerase）参与蛋白质的折叠过程。 前者能加速蛋白质正确二硫键的形成。后者则加速脯氨酸亚氨基肽键的顺-反异构化。

29 2. 多肽链的修饰 七、多肽链合成后的加工 多肽链的修饰是指多肽链中氨基酸残基被切除或在氨基酸残基中添加和改变一些基团,从而使多肽链形成具有一定高级结构和生物活性的蛋白质分子的过程。

30 (1) 末端氨基的去甲酰化和N-甲硫氨酸的切除
原核细胞究竟采取去甲酰基还是去甲酰甲硫氨酸，常决定与邻近氨基酸。如果第二个氨基酸是Arg，Asn，Asp，Glu，Ile或Lys，则以前者为主，如果第二个氨基酸是Ala，Gly，Pro，Thr或Val，则以后者为主。

31 (2) 一些氨基酸残基侧链被修饰 有些氨基酸没有相应的遗传密码，而是在肽链从核糖体释放后经化学修饰形成的。如胶原蛋白中含有大量的羟脯氨酸和羟赖氨酸，分别是脯氨酸和赖氨酸经羟化而成的。有些蛋白质中的天冬酰胺、丝氨酸和苏氨酸发生糖基化形成糖蛋白，丝氨酸磷酸化成为磷酸丝氨酸。

32 (3) 二硫键的形成 多肽链的半胱氨酸残基可在蛋白质二硫键异构酶的作用下形成二硫键，肽链内或肽链间都可形成二硫键，二硫键在维持蛋白质的空间构象中起了很重要的作用。

33 (4) 多肽链的水解断裂 许多具有一定功能的蛋白质如酶、激素蛋白，在体内常以无活性的前体肽的形式产生，这些前体在一定情况下经体内蛋白酶的水解切去部分肽段，才能变成有活性的蛋白质，如胰岛素原变成胰岛素，胰蛋白酶原变为胰蛋白酶等。

34 八、蛋白质的定位 无论是原核还是真核细胞都是一个高度有序的结构，新生的蛋白质要被准确地运送到细胞的各个部分，如溶酶体、线粒体、叶绿体、细胞质和细胞核等，以更新其结构组成和维持其功能, 这一过程称为蛋白质的定位。 多肽的转运有两种类型即共翻译转移（co-translational translocation）和翻译后转移（post-translational translocation）。

35 1. 共翻译转移 八、蛋白质的定位 蛋白质的共翻译转移的特点是首先在游离核糖体上合成一段称为信号肽（signal peptide）的肽段，该信号肽指令核糖体结合到粗面内质网膜上，然后肽链边合成边进入内质网腔，经初步加工和修饰后，部分多肽以囊泡形式被运往高尔基体，再经进一步的加工和修饰后被运往质膜、溶酶体或被分泌到胞外。

36 信号肽通常在被转运的多肽链的N端，长度为1040个氨基酸残基不等，氨基端至少含有一个带正电荷的氨基酸;
1. 共翻译转移 八、蛋白质的定位 信号肽通常在被转运的多肽链的N端，长度为1040个氨基酸残基不等，氨基端至少含有一个带正电荷的氨基酸; 序列中心为含有1015高度疏水的氨基酸残基，如丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸。 在信号肽的C末端有一个可被信号肽酶识别的位点，当蛋白质运送到目的地后，信号肽即被信号肽酶切去。

37 1. 共翻译转移 八、蛋白质的定位 d. 在信号肽酶识别位点上游常有一疏水性较强的5肽，信号肽酶切点上游的第一个(1)及第3个(3)氨基酸常为具有一个小侧链的氨基酸（如丙氨酸） 一些真核细胞的信号肽的结构

38 信号肽是如何被识别的?含有这种顺序的蛋白质又是怎样被运过粗面内质网膜的?
1. 共翻译转移 八、蛋白质的定位 信号肽是如何被识别的?含有这种顺序的蛋白质又是怎样被运过粗面内质网膜的? Blobel等已证明，有一种被称为信号识别颗粒（signal recognition particle SPR）的核糖核蛋白与合成分泌蛋白的核糖体结合到粗面内质网膜上密切相关。 SPR的相对分子质量为325 kD，是由一种300个核苷酸的RNA分子(名为7SL RNA)和6个不同的多肽链组成的。SPR存在于细胞质中，其上有两个关键部位，即信号肽识别部位和翻译暂停功能域。

39 1. 共翻译转移 八、蛋白质的定位 信号肽的识别及多肽进入内质网的过程

40 1. 翻译后转移 八、蛋白质的定位 虽然线粒体和叶绿体均具有各自的基因组，但只编码其自身的一小部分蛋白质。大部分线粒体和叶绿体的蛋白质是由细胞核基因组编码的，并在细胞质游离核糖体上被完整合成后，通过新生肽的信号序列直接运往目的地(线粒体和叶绿体)，这种转运方式属于翻译后转移。

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42 六、名词解释 翻译(translation)；在蛋白质合成期间，将存在于mRNA上代表一个多肽链的核苷酸残基序列转换为多肽链氨基酸残基序列的过程。 2．遗传密码(genetic code)：核酸中的核苷酸残基序列与蛋白质中的氨基酸残基序列之间的对应关系。连续的3个核苷酸残基序列为一个密码子，特指一个氨基酸。标准的遗传密码是由64个密码子组成的，几乎为所有生物通用。

43 六、名词解释 3. 起始密码子(iniation codon)；指定蛋白质合成起始位点的密码子。最常见的起始密码子是蛋氨酸密码：AUG。 4. 终止密码子(termination codon)；任何tRNA分子都不能正常识别的、但可被特殊蛋白结合并引起新合成的肽链从翻译机器上释放的密码子。存在3个终止密码子：UAG、UAA和UGA。

44 六、名词解释 5. 密码子(eodon)：mRNA(或DNA)上的三联体核苷酸残基序列，该序列编码着一个指定的氨基酸，tRNA的反密码子与mRNA的密码子互补。 6．反密码子(anticodon)：tRNA分子的反密码子环上的三联体核苷酸残基序列。在翻译期间，反密码子与mRNA中的互补密码子结合。

45 六、名词解释 7. 简并密码子(degenerate codon)：也称为同义密码子(synonymous codon)；是指编码相同氨基酸的几个不同的密码子。 8.氨基酸臂(amino arm)；也称为接纳茎（acceptor stem)。tRNA分子中靠近3端的核苷酸序列和5端的序列碱基配对，形成的可接收氨基酸的臂(茎)。

46 六、名词解释 9. 摆动(wobble)：处于密码子3端的碱基和与之互补的反密码于5 。端的碱基之间的碱基配对有一定的宽容性，即处于反密码子5，端的碱基(也称为摆动位置），例如I可以与密码子上3端的U，C和A配对。由于存在摆动现象，所以使得一个tRNA反密码子可以和一个以上的mRNA密码子结合。 10. 信号肽(signal peptide)：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移(定位)的N-末端的氨基酸序列(有时不一定在N端)。