发光细菌法急性毒性的测定.

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1 发光细菌法急性毒性的测定

2 主要内容 一、 简 介 二、实验目的与内容 三、实验原理 四、实验材料与方法 五、实验步骤 六、注意事项 七、习题与思考

3 简 介 发光菌毒性测试是20世纪70年代后兴起的一种微生物监测环境污染及检测污染物毒性的新方法。 1978年美国 Beckman 公司即推出功能完备的生物发光光度计“Microtox”，自此，这一急性毒性测试技术在世界范围内迅速推广。因此人们也将发光菌毒性测试称为Microtox测试。

4 简 介 采用现代光电检测手段(生物发光光度计)的发光菌生物毒性实验是毒理学中生物测定的方法之一。 该方法快速、简便、灵敏、廉价,在有毒物质的筛选，环境污染生物学评价等方面有重要的意义，因而备受各国有关研究者的关注。 1995年3月，国家环境保护局、国家技术监督局将发光菌毒性测试定为水质监测标准方法(GB/T )。

5 实验目的与内容 一、实验目的 1. 掌握发光细菌毒性测试的标准方法； 2. 根据发光细菌发光强度的变化判断 受试化合物的毒性；
3. 初步了解发光细菌毒性测试的影响因素。

6 二、实验内容 1. 发光细菌的复苏； 2. 发光细菌发光强度的测定； 3. 受试化合物毒性的计算。

7 实验目的与内容 发光细菌是一种非致病性的普通细菌，具有发光能力，在正常条件下经培养后能发出肉眼可见的兰绿色光，这种发光过程是细菌体内一种新陈代谢反应，是氧化呼吸链上的一个侧支。发光细菌的发光反应模式图(1)所示。发光细菌发光反应途径可简单概述为： FMNH2＋O2＋RCHO→荧光＋FMN＋H2O+RCOOH （1） 这个发光现象是呼吸代谢耦合，作为光能被散发。当细菌体内合成萤光酶、萤光素、长链脂肪醛时，在氧的参与下发生生化反应，反应的结果便产生光。

8 实验原理 发光菌的发光现象是其正常的代谢活动, 在一定条件下发光强度是恒定的, 与外来受试物(无机、有机毒物, 抑菌、杀菌物等) 接触后, 其发光强度即有所改变。变化的大小与受试物的浓度呈相关关系, 同时与该物质的毒性大小有关。通常认为外来受试物通过下面两个途径抑制细菌发光: (1) 直接抑制参与发光反应的酶类活性; (2) 抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程(如细胞呼吸等)。 毒物的毒性可以用EC50表示, 即发光菌发光强度降低50% 时毒物的浓度。实验结果显示, 毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系。因而可以根据发光菌发光强度判断毒物毒性大小, 用发光强度表征毒物所在环境的急性毒性。

9 图 (1) 发光细菌的发光反应模式。E1: 细菌荧光素酶，由α、β 2个亚基组成，α为40000~42000D，β为37000~39000D。单独α、β亚基均无发光活性，只有α、β共存时才有活性。E2: NADH：FMN氧化还原酶，分子量为3000D，对FMN有高度特异性。E3: 脂肪酸还原酶。

10 实验材料与方法 1. 试剂：氯化汞（分析纯）；氯化钠（化学纯）；蒸馏水。
氯化钠溶液，2.0 g/100 ml (3.0 g/100 ml)，称取2.0 g (3.0 g)氯化钠溶于100ml蒸馏水中，置于2-5℃冰箱备用。 氯化汞母液，2 000 mg/L，万分之一分析天平精称密封保存良好的无结晶水氯化汞 g于50 ml容量瓶中，用3.0 g/100ml氯化钠溶液稀释至刻度，置于2-5℃冰箱备用，保存期6个月。

11 氯化汞工作液，2. 0 mg/L，用移液管吸取氯化汞母液10 ml入1000 ml容量瓶，用3
氯化汞工作液，2.0 mg/L，用移液管吸取氯化汞母液10 ml入1000 ml容量瓶，用3.0 g/100ml氯化钠溶液定容。再用移液管吸取氯化汞20 mg/L 液25 ml入250 ml容量瓶，用3.0 g/100 ml氯化钠溶液定容，将此液倒入配有半微量滴定管的试液瓶，然后，用3.0 g/100 ml氯化钠溶液将氯化汞2.0 mg/L溶液按表1稀释成系列浓度(稀释至50 ml容量瓶中)。配制的稀释液保存期不超过24小时。

12 表1 氯化汞工作液稀释配制系列(稀释至50 ml容量瓶中)
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 配制氯化汞浓度，mg/L 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20 0.22 0.24

13 2. 明亮发光杆菌T3小种 (Photobacterium phosphoreum T3 spp
2. 明亮发光杆菌T3小种 (Photobacterium phosphoreum T3 spp.)冻干粉，安培瓶包装，在2-5℃冰箱内有效保存期为6个月。新制备的发光细菌休眠细胞(冻干粉)密度不低于每克800万个细胞；冻干粉复苏2 min 后即发光，可在暗室内检验，肉眼可见微光， 稀释成工作液后，经稀释平板法测定，每毫升菌液不低于1.6万个细胞(5毫升测试管)或2万个细胞(2毫升测试管)。在DXY-2型毒性测试仪上测出的初始发光量应在 mV之间，低于600 mV允许将倍率调至“X2”档，高于1900 mV允许将倍率调至“X0.5”档。仍达不到标准者，更换冻干粉。发光细菌的毒性实验在美国Maxwell（MSI.） LuminMax-C 冷光仪完成。

14 发光细菌的复苏 从冰箱内取出含有0.5 g 发光细菌冻干粉和氯化钠溶液，置于含有冰块的小号保温瓶，用1 ml注射器吸取0.5 ml冷的氯化钠2.0 g/100 ml溶液(适用于5ml的测试管)或1 ml 冷的氯化钠2.5％溶液(适用于2 ml的测试管)注入冻干粉中，充分混匀。2 min后菌即复苏发光，可在暗室观察，肉眼可见微光。备用。

15 发光细菌的培养： 培养液：酵母浸出汁5.0g，胰蛋白胨5.0g，NaCl 30.0g，NaHPO4 5.0g，KH2PO4 1.0g，甘油3.0g，加蒸馏水至 1000ml,pH调至7±0.5，趁热分装于150ml三角瓶中，每瓶约50ml，塞上棉球，用牛皮纸包扎好，经115℃、20-30min高压蒸汽灭菌后置于4℃左右冰箱中备用。

16 (2)固体培养基： 取上述培养液100ml，加入1.5~2g琼脂粉，电炉加热使溶解至透明，调节pH值为7±0.5，趁热用漏斗分装于试管中，每支试管各约10ml，塞上棉球，用牛皮纸包扎好，经121℃高压灭菌20–30min后，取出制成斜面。 (3)斜面菌种培养： 将发光菌冻干粉用0.5ml 3%NaCl溶解，迅速转入50ml培养液中，20℃恒温培养，每24h后转接一次斜面，将培养好的第三代斜面置4℃冰箱中备用。

17 (4) 摇瓶菌液培养：将培养好的第三代新鲜斜面菌种T3接入装 有50ml培养液的150ml锥形瓶中，接种量不得超过一接种环，于20℃振荡(180r/min)培养12h(即对数生长期)后备用。
(5) 工作菌液培养：吸取一定量刚培养好的摇瓶菌液，用3%的NaCl溶液稀释并磁力搅拌均匀。控制对照(2.0ml 3%NaCl溶液+0.1ml工作菌液)发光强度300mv-900mv。

18 3. 仪器： 生物发光光度计，配制2或5 ml测试管，当氯化汞标准液浓度为0.10 mg/L时，发光细菌的相对发光度为50％，其误差不超过10％。2或5 ml 测试样品管，具标准磨口塞，为制造比色管的玻璃料制作，由专业玻璃仪器厂制造，分别适用于相应型号的生物放光光度计。注射器(1 ml)、微量注射器(10 μl)、定量加液瓶(5 ml)、吸管(2、10、25 ml)、试剂瓶(100 ml)、量桶(100、500 ml)、棕色容量瓶(50、250、1000 ml)、半微量滴定管(配磨口试液瓶，全套仪器均为棕色，10 ml)等若干。

19 测定 在预实验的基础上，将待测物配成5-7个浓度梯度，各取不同浓度梯度溶液2ml加入具塞磨口比色管中，取0.2ml工作菌液与各比色管中，加塞上下振荡摇匀，去塞，暴露15min，以2ml3%的NaCl溶液做空白对照。测发光强度。每个浓度梯度设3组平行。

20 实验结果 受试化合物的毒性作用用发光细菌的发光强度相对抑制率表示。 计算公式如下： (2)
光强的相对抑制率与毒物毒性的大小成正比。通常用发光细菌光抑制50％的受试化合物浓度来表征其毒性效应(EC50)。将计算的光相对抑制率与受试化合物的浓度进行回归分析，根据所得回归方程可求出相应的EC值。

21 注意事项 （1）实验前判断发光细菌是否复合测试要求。 （2）平行或批处理样品的处理与测试应注意 操作时间的一致性。

22 思考与讨论 1. 测试结果误差的主要来源？ 2. 测试过程中，暴露时间、温度以及体系的pH等 对发光细菌的发光特性是否有影响，及影响如何？
3. 本测试方法与上述三种测试方法的结果是否一致，应如何解释？