13下游加工过程概论 生物工程系 吴蕾.

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1 13下游加工过程概论 生物工程系 吴蕾

2 本课程主要内容 13 生物下游加工过程概论 14 发酵液的预处理和固液分离方法 15 细胞破碎 16 沉淀法 17 膜分离技术
18 溶剂萃取法 19 双水相萃取 20 吸附法 21离子交换法 22 液相色谱法 23 亲和分离技术 24 结晶法 25 基因工程药物生产实例

3 主要参考书 《生化分离工程》严希康 编著，化工业出版社 《生物分离原理与技术》欧阳平凯 编著，化工业出版社
《新编生物工艺学》，俞俊棠主编，化工出版社，2003 《生物分离工程》（第二版），孙彦编著，化工出版社，2005 《生物工程下游技术》（第二版），刘国诠主编，化工出版社，2003 《生化分离工程》严希康 编著，化工业出版社 《生物分离原理与技术》欧阳平凯 编著，化工业出版社

4 成绩 平时成绩占30%，包括平时作业、课堂(提问,点名)等。 期末考试占70%，闭卷考试方法总成绩:平时(30%)+期末(70%)。

5 13.1 下游加工过程在生物技术中的地位 下游加工过程是生物工程的一个重要组成部分. 发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯化、富集生物产品的过程称为下游加工过程(downstream processing) 它由一些化学工程的单元操作组成,但由于生物物质的特性，有其特殊要求，而且其中某些单元操作在一般化学工业中应用较少。

6 在发酵产品的生产中，分离和精制过程所需的费用占成本的很大部分。
对传统发酵工业(如抗生素、乙醇、柠檬酸)，分离和精制部分占整个工厂投资费用的60％， 对重组DNA生产蛋白质、精制的费用可占整个生产费用的80％一90％。

7 从第一个基因工程药物，人胰岛素在1982年投产后，人们逐渐认识到下游加工过程的落后有可能会阻碍生物技术的发展，特别是当有其他生产方法与其相竞争时。
英国政府工业部，于1983年发起生物分离计划(BIOSEP)，专门研究下游加工过程，有7个国家、50家公司参加。1987年英国化学工业会召开了专门讨论下游加工过程的国际会议。 美国United Engineering Foundation 从1981年开始连续召开了生物产品回收的会议。 我国也于1989年在济南召开了一次专门会议。人们逐渐取得了共识；现代生物技术的发展是和下游技术的进步紧密相关的。

8 13.2 传统生化产品和基因工程产品回收方法的比较
13.2 传统生化产品和基因工程产品回收方法的比较 1.生化产品的类型 按用途分类 食品类。 保健品类。 医用类产品（1998年，719种）。抗生素112种 农业用产品（1998年，36种）。 生物试剂类（1998年，975种）。 按分子量大小分类 Mass < 1000D：抗生素、有机酸、、多肽类等 Mass > 1000D：酶、抗原、抗体、多肽、蛋白质类 按发酵时目的产物所在的位置分类 cell内：胰岛素、白细胞介素、干扰素、重组蛋白质 cell外：抗生素（青霉素、红霉素）、胞外酶（α-淀粉酶）等

9 2.传统生化产品和基因工程产品在提取和精制上的差异
传统生化产品都为小分子(工业用酶除外，但它们对纯度要求不高、提取方法较简单)．其理化性能(如平衡关系等)数据都为已知，因此放大比较有根据；基因工程产品大多为大分子，必要数据缺乏，放大多凭经验。

10 由于第一代基因工程产品都以E.coli作为宿主，表达产品处于胞内，提取前需将细胞破碎，细胞内物质释放出来，给提取增加了很多困难；而发酵液中的产物，浓度较低，杂质又多，且一般大分子较小分子不稳定(易失活，如对剪切力)，故提取较困难。 大分子(蛋白质)的分离主要困难在于杂蛋白的分离，由于蛋白质都内氨基酸所构成，所以性质相似，分离主要依靠高分辨力的精制方法，如色谱分离等。

11 3. 分离效率的评价 浓缩率（富积率，concentration factor）
3. 分离效率的评价 浓缩率（富积率，concentration factor） 原料(Raw material) 分离器 产品(Product) FW, VW, cT,W, cX,W    废液(Waste fluid) 意义：1）如mT >1，则目标产物得到富积；2）如mT = mX，则目标产物未得到分离纯化。

12 分离因子(separative factor)，或分离系数(separative coefficient)
B、 = 1时，则未分离。故在分离为主要目的时,   此式在单级平衡蒸馏中相当于相对挥发度；在萃取分离中又称为萃取的选择性(selectivity) 比活的定义：在一定条件下，单位质量(mg)的酶在给定的时间内分解底物的umol数[in U/mg]

13 纯化因子(purification factor)
回收率(recovery)： 纯化因子(purification factor) 对于具有生物活性的蛋白质或酶，常常用分离前后目标产物的比活 A [in U/mg]之比表示目标产物的分离纯化程度，

14 13.3 生化产品及加工过程的特点 1)应用面广。 医药卫生、环保、动植物生长调节、食品和试剂等
2)种类繁多。分子量X0–X000000，结构功能复杂，生物活性各异。 3)目的产物在初始物料中的含量低。 青霉素（4.2%）、庆大霉素（0.2%）、干扰素（<50ug/ml）。

15 原料中目标产物浓度越低，所需能耗越高，分离过程成本越大。
4)产品价格与产物浓度呈反比 原料中目标产物浓度越低，所需能耗越高，分离过程成本越大。

16 5)初始物料成分复杂,常需多个步骤,产品总收率低。除少量产物外，还有大量的细胞及碎片、其他代谢物（几百上千种）、培养基成分、无机盐等。

17 6)生物活性物质的稳定性低。易变质、易失活、易变性，对温度、pH值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感。
7)产品的质量要求高，尤其是药品等。成品青霉素对其强致敏原 --- 青霉噻唑蛋白必须控制RIA值（放射免疫测定）小于100（1.5*10-6），蛋白类药物（杂质 < 2%）、重组胰岛素中杂蛋白小于0.01%。

18 13.4生物技术下游加工过程的一般流程和单元操作
动、植物组织、体液等 胞外产物 提取 发酵液 → 预处理 → c分离 → c破碎 → 碎片分离 → 初步纯化 → 精制 → 制成品 培养液 加 热 沉 淀 匀 化 离 心 沉 淀 分子筛 无菌过滤 酶反应液 调 pH 离 心 超 声 萃 取 吸 附 离 子 超 滤 絮 凝 过 滤 胞 溶 过 滤 萃 取 亲 和 冻 干 错流过滤 研 磨 错流过滤 超 滤 吸 附 喷 干 憎 水 结 晶 电 泳 发酵液预处理 细胞破碎 初步纯化 高度纯化

19 13.6 纯化方法选择的基本原则 1)尽可能简单、低耗、高效、快速。 反面例子 ---- 中药现代化、超临界萃取； 正面例子
2)分离步骤尽可能少，每步收率尽可能高。 A) 分离步骤越多，回收率越低；如Y10 = = 0.63，Y5 = =0.77 B)分离步骤多，设备投入大，人员物资消耗大，生产周期长

20 3)避免相同原理的分离技术多次重复出现 分子筛和超滤技术按分子量大小分离，重复应用两次以上，意义就不大了。
4)尽量减少新化合物进入待分离的溶液。 A)引起新的化学污染；B)蛋白质的变性失活 5)合理的分离步骤次序。 原则是：先低选择性，后高选择性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本。 1)、：反面例子 ---- 中药现代化、超临界萃取； 正面例子 ---- 技术的发明和应用 2)、：A）、分离步骤越多，回收率越低；如φ10 = = 0.63，φ5 = =0.77； B）、分离步骤多，设备投入大，人员物资消耗大，生产周期长。 3)、：

21 13.7 纯化流程设计前应了解的信息 要掌握的产物物化性质，主要包括： (1)、溶解度及影响因素，包括温度、pH值、有机溶剂和盐等；
(2)、分子量和分子形状。对于高分子物质非常有意义； (3)、沸点和蒸汽压。对于热稳定的小分子物质非常有意义； (4)、极性大小； (5)、分子电荷及影响因素，包括pH值和盐等； (6)、功能团。功能团为萃取剂和特异性吸附的选择提供依据； (7)、免疫原性。设计亲和色谱； (8)、稳定性及其影响因素，包括温度、pH值、毒性试剂等(如青霉素低pH不稳定)； (9)、分子的淌度及影响因素，包括pH值、离子强度和盐等； (10)、等电点pI； To (8) 淌度：m2 s-1 V-1

22 成品规格（或产品质量标准） 表1.3 五肽胃泌素的上海市药品标准（1993年版32页） 指标名称 指标
表1.3 五肽胃泌素的上海市药品标准（1993年版32页） 指标名称 指标 含量（C37H49N7O9S） 比旋光度 ˚ ~ -29˚ 吸收值比 A(280nm):A(288nm) = 氨基酸 各氨基酸之比为1 干燥失重，%  进料的组成和物性 (1)、目的产物的浓度。高？低？ (2)、物料中的与目的产物相近物质组成的物理化学性质。 (3)、目的产物的定位。是胞内还是胞外？ (4)、菌种的种类和形态。 (5)、微生物的含量和发酵液的黏度。

23 生产规模 危害性 分批分离还是连续纯化 (1)离心产生的气溶胶、发酵产生的废气、干燥产生的粉尘等。
(2)目的产物本身的危害性；抗肿瘤代谢类药物，类固醇类抗生素，激素类药物等。 (3)试剂危害。萃取试剂CCl4、甲苯、苯、二甲苯、CNBr。 (4)微生物的危害。重组DNA工程菌不能任意排放。这一菌种为新的物种，不能排除对生态系统和人的危害。 分批分离还是连续纯化 生产规模不仅对发酵阶段的生产能力提出要求，同时也对分离阶段的生产能力作出了规定。一般而言，规模决定分离提取设备型号（即生产能力），但不规定分离技术基本原理和顺序。为满足大的生产规模，可采用大型号设备，或同种多台设备同时使用。

24 13.8非蛋白质类杂质的去除 在纯化过程中，三种可能存在的非蛋白质类杂质需要特别注意，它们是DNA、热原质和病毒。 DNA的除去
热原的除去：细菌内毒素 病毒的除去

25 13.9目标蛋白质的表征和分析方法 蛋白质在分离、纯化过程个易发生变化，因此得到的产品应与已知标准品对照，证明为同一物质并检查其纯度。为达此目的，仅用一种分析方法是不够的，常需用几种方法。 ①HPLC选用基于个同原理的两种层析系统(如反相层析和离子交换层析)，如只得到单个对称峰则表明纯度较高； ⑦聚丙烯酰胺凝胶电泳(PALE)和等电聚焦； ⑤顺序分列N·端和C端顺序分析可用来表征蛋白质： ④其他分析，如氨基酸分析、肽图、免疫化学分析等可进一步提供产品纯度达到均质(homogeneity)和标准品一致的证明。

26 13.10 发展趋向 操作集成化 方法集成化 大分子与小分子分离方法的相互渗透 亲和技术的推广使用和亲和配基的人工合成
优质亲和层析介质的开发 基因工程对下游过程的影响 发酵与提取相耦合

27 思考题 下游加工技术的定义。 下游加工过程的特点。 浓缩率，分离因子，回收率，纯化因子的概念及表达式。