分子生物学实验 生物技术研究中心 李晓玲 梁宏伟 2015年03月.

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1 分子生物学实验 生物技术研究中心 李晓玲 梁宏伟 2015年03月

2 实验内容 实验一 实验准备及培养基的制备与灭菌 实验二 质粒DNA的提取 实验三 琼脂糖凝胶电泳技术检测质粒DNA
实验五 DNA片段的PCR扩增 实验六 PCR产物电泳检测及切胶回收 实验七 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验八 植物基因组DNA提取 实验内容 2

3 主要掌握离心机、微量移液器及高压灭菌锅的使用及实验操作注意事项
实验一 实验准备及培养基制备与灭菌 【实验目的】 主要掌握离心机、微量移液器及高压灭菌锅的使用及实验操作注意事项 【实验准备内容】 1.实验准备： 器皿清洗、培养基配制、分装灭菌、取用保存 2. 离心机的使用 ①打开离心机电源开关，进入待机状态。 ②选择合适的转头 ③离心管平衡误差应在0.1克以内。 ④选择离心参数： 

4 ⑤将平衡好的离心管对称放入转头内。盖好转头盖子拧紧螺丝。 ⑥按下离心机盖门，如盖门未盖牢，离心机将不能启动。 ⑦按START键，开始离心。离心开始后（特别是高速离心时）应等离心速度达到所设的速度时才能离开，一旦发现离心机有异常（如不平衡而导致机器明显震动，或噪音很大），应立即按STOP键，必要时直接按电源开关切断电源，停止继续离心，并找出原因。 ⑧机器如发现故障，请及时与有关人员联系。 ⑨使用结束后请清洁转头和离心机腔，不要关闭离心机盖，利于湿气蒸发。

5 离心管在转子中的摆放位置

6 3. 微量移液器的使用 移液器是生化与分子生物学实验室常用的小件精密设备，移液器能否正确是用，直接关系到实验的准确性与重复性，同时关系到移液器的使用寿命。 移液器由可调的机械装置和可替换的吸头组成，不同型号的移液器吸头有所不同，实验室常用的移液器根据最大吸用量有2.5ul，10ul, 20ul, 200ul, 1ml，5ml等规格。 微量移液器的操作步骤： ①将微量移液器装上吸头(俗称枪头)（不同规格的移液器配用不同的吸头） ②将微量移液器按钮轻轻压至第一停点；

7 ③垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液样面下几毫米，千万不要将吸嘴直接插到液体底部； ④缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样液。否则液体进入吸嘴太快，导致液体倒吸入移液器内部，或吸入体积减少； ⑤等一秒钟后将吸嘴提离液面 ⑥排出液体时，平稳地把按钮压到第一停点，再把按钮压至第二停点以排出剩余液体； ⑦提起微量移液器，将吸嘴在容器壁擦过； ⑧然后按吸嘴弹射器除去吸嘴。

8 移液器的使用

9 量液操作注意事项 a. 连续可调移液器的取用体积调节要轻缓，严禁超过最大或最小量程； b. 在移液器吸头中含有液体时禁止将移液器水平放置，平时不用时置移液器于架上； c. 吸取液体时，动作应轻缓，防止液体随气流进入移液器的上部； d. 在吸取不同的液体时，要切记更换吸头； e. 移液器要进行定期校准，一般由专业人员来进行。 2017/3/18

10 4. 高压蒸气灭菌锅的使用及注意事项 ①首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。切物忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而损坏加热棒或引起炸裂事故。 ②放入内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。 2017/3/18

11 ③加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺旋松紧一致，避免漏气。
④ 用电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.11MPa,121.5℃,20min灭菌。

12 灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽，才能关上排气阀，维持所需压力。
⑤ 灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓。打开盖子，取出灭菌物品。 ！！压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出瓶口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤使用者。 2017/3/18

13 ⑥灭菌打湿的包装可置于70℃温箱中烘干备用。也可将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。 5
⑥灭菌打湿的包装可置于70℃温箱中烘干备用。也可将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。 5.分组：4-5人一大组，一个实验桌1套移液枪 6.实验器材准备： 每组蓝枪头和黄枪头各1盒，全班另加2包，1.5ml的离心管1盒或1包，30ml离心管12个，培养皿10个。全班配制LB固体和液体培养基各1000ml，分装成200ml每份。 2017/3/18

14 【思考题】 1. 高压蒸气灭菌之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低到“0”时才能打开排气阀，开盖取物？ 2. 移液操作应注意哪些事项？ 2017/3/18

15 【LB培养基的制备及灭菌】 【实验目的】 通过对LB培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。 2017/3/18

16 【实验原理】 LB培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。 琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。 2017/3/18

17 LB培养基配方 由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性。 LB固体培养基的配方如下：
胰蛋白胨 g/L 酵母提取物 5g/L NaCl g/L 琼脂 15g/L 蒸馏水定容至 1000mL，调pH 7.4。 调中性，以利于细菌的生长繁殖 2017/3/18

18 【试剂】 酵母提取物，蛋白胨， NaCl，琼脂； 1mol/L NaOH， 1mol/L HCl；
试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH 5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。 2017/3/18

19 【培养基配制】 配制：每升液体培养基，应在950ml蒸馏水中加入 胰蛋白胨 10g， 酵母提取物 5g，NaCl 10g。
摇动容器直至完全溶解，加入 5mol/L NaOH调节pH至7.4，定容1L。 LB固体培养基：在液体培养基基础上调PH值、定容、分装后，每升培养基加入15克琼脂。 灭菌：0.11MPa，121.5℃，20min灭菌。 2017/3/18

20 【操作步骤】 1．称量 按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。 2．溶化 在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。 2017/3/18

21 【操作步骤】 3．调pH 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.4。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。 对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。 2017/3/18

22 【操作步骤】 LB液体培养基分装：4瓶5ml，4瓶50ml，3瓶250ml。 LB固体培养基分装：100ml/瓶。 4．分装
按实验要求，可将配制的培养基分装入三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。 分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。 LB液体培养基分装：4瓶5ml，4瓶50ml，3瓶250ml。 LB固体培养基分装：100ml/瓶。 2017/3/18

23 【操作步骤】 5．加塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 6．包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。 2017/3/18

24 【操作步骤】 7．灭菌 将上述培养基以0.11MPa ，121 ℃，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
8．灭菌结束后，待压力将至“0”时，取出灭菌物品置于烘箱中或干净处备用。 9．无菌检查 将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24～48小时，以检查灭菌是否彻底。 2017/3/18

25 【思考题 】 1.培养基配制好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？ 2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？ 2017/3/18

26 实验二 质粒DNA的提取 【实验目的与意义】
碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列。 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA。 2017/3/18

27 【实验原理】 碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。 2017/3/18

28 细菌裂解的方法 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 SDS裂解法：10%SDS,一般用于 质粒大量提取。
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29 DNA抽提原理 DNA是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。 2017/3/18

30 DNA抽提原理 SDS是一种阴离子表面活性剂，既可使细菌细胞裂解，又可使一些蛋白质变性，因此用SDS处理细菌，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。 释放出来的DNA在强碱性（NaOH）条件下发生变性。再用酸性乙酸钾来中和，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA因分子较大，难以复性。 离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀至离心管底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。 2017/3/18

31 【仪器、材料与试剂】 （一）仪器 1.恒温培养箱 2.台式离心机 3.恒温摇床 4.高压灭菌锅 （二）材料 1.葡萄糖
2.三羟甲基氨基甲烷（Tris) 3.乙二胺四乙酸（EDTA) 4.氢氧化钠 5.十二烷基硫酸钠（SDS) 6.乙酸钾 7.冰乙酸 8.氯仿 2017/3/18

32 【仪器、材料与试剂】 9.乙酸 10.胰RNA酶 11.氨卞青霉素 12.蔗糖 13.溴酚蓝 14.酚 15.8－羟基喹啉 16.β巯基乙醇
17.盐酸 18.含pUC19质粒的大肠杆菌 19.EcoRⅠ酶 20.吸头、小指管 2017/3/18

33 【仪器、材料与试剂】 （三）试剂 1.溶液Ⅰ 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA，
25mM Tris-HCl pH8.0。 2.溶液Ⅱ 0.4mol/L NaOH, 2%SDS，用前等体积混合 3.溶液Ⅲ 60mL的5mol/L KAc 11.5ml冰乙酸 28.5mL H2O 4.TE缓冲液或水（+ 20μg/ml RNase ）: 10mmol/L，Tris-HCl pH8.0 1mmol/L，EDTA pH8.0 2017/3/18

34 【仪器、材料与试剂】 5.70％乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回） 6.胰RNA酶
将RNA酶溶于10mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min,缓慢冷却至室温，保存于－20℃。 7.凝胶加样缓冲液（6×） 40％蔗糖、0.25％溴酚蓝 2017/3/18

35 质粒(plasmid )  Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。 Plasmid chromosome 2017/3/18

36 质粒的结构 2017/3/18

37 【操作步骤】 一、菌种的活化 1. 用接种环挑取 1 环冷冻保存的含质粒 DNA 大肠杆菌工程菌（本实验是 含人 Bcl-2 重组质粒的 DH5 α），划线接种于含有 Amp 的 LB 固体培养基平板上， 37 ℃倒置培养约 12h( 过夜 ) 。 2. 用接种针或消毒牙签从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于2ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。 2017/3/18

38 二、提取步骤 1.将2ml含相应抗生素（Amp:50μg/ml)de LB培养基加入到试管中，接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃培养过夜。 2.取2.0ml培养液在4℃、6000rpm离心2min，吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥， 3.加100μl的溶液I，使菌体充分悬浮，室温静置10min。 4.加200μl新配置的溶液II，温和上下颠倒2-3次，冰浴静置5min。 5.加150μl的溶液III，上下颠倒混匀数次，冰浴静置15min。 6. 4℃，12000 rpm离心15min。 2017/3/18 三峡大学李晓玲编写与制作

39 9.加1 ml 预冷的70%乙醇，4℃，12000rpm离心5min，洗涤沉淀。
8.向上清液中加入2倍体积（约1ml）预冷的无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。12000rpm离心5min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 9.加1 ml 预冷的70%乙醇，4℃，12000rpm离心5min，洗涤沉淀。 10.弃上清，沉淀自然干燥后，加20μl TE缓冲液溶解沉淀。 11.加2μl 10 mg/ml的RNaseA酶，-20℃保存。 2017/3/18 39

40 Karroten Plasmid DNA Extraction kit 质粒DNA提取试剂盒组成
产品序列号及组成 K (50 次) K (250次) KarrotenTM DNA Mini Column 50 250 2ml Collection Tube Buffer K1 (Cell resuspension solution) 15 ml 75 ml Buffer K2 (Cell Lysis solution) Buffer K3 (Neutralization solution) 20 ml 100 ml Buffer KB (Column balance solution) 30 ml 150 ml Buffer KW (Wash  solution) 使用前加入70% 乙醇40ml 乙醇200 ml Buffer KE (Elution  solution) 5 ml 25 ml 2017/3/18 40 40

41 Karroten Plasmid DNA Extraction kit 质粒DNA提取试剂盒
1.将带有目的质粒的E.coli 接种于裝有5 ml LB/适当抗生素的10-20 ml 的培养管中，37℃搖床培养20-24h，以扩增质粒。用一个10-20 ml 培养管或培养瓶，其体积至少有培养液的3-4 倍。 2017/3/18 41 41

42 2.取一KarrotenTM Mini Column 柱裝在一个2 ml 收集试管上(已备)。加入500 μl Buffer KB平衡液至柱子內，室温下10,000 rpm 离心1 min，使平衡液完全流过柱子。弃去收集管中的平衡液. （保留空的收集管，继续往下使用）。特别注意：柱子不平衡，将导致质粒ＤＮＡ产率和纯度的减少。 2017/3/18 42 42

43 3. 取1.5~5.0 ml 的菌液，于室温下12,000 rpm 离心3min 以沉淀菌体。
4. 倒出或吸出培养基。往沉淀中加入250 μl Buffer K1，振荡使细胞完全悬浮。细胞沉淀的完全重悬对于获得高产量是十分重要的。 5. 往重悬混和液中加入250 μl Buffer K2，轻轻颠倒混匀5-10 次。室温静置2-5 分钟。避免剧烈混和裂解液，否则会使染色体DNA 断裂而使得到的质粒纯度降低。裂解反应不要超过5 min。（当使用完Buffer K2以后，须盖紧其瓶盖保存好，避免与空气中的CO2 反应。） 2017/3/18 43 43

44 6. 往上述混和液中加入350 μl Buffer K3 (可以预冷至4℃，也可以在常温)，并温和地上下颠倒离心管10-20 混匀，直至形成白色絮狀沉淀。
7. 在4℃， rpm 离心10 min, 或者在常温12000 rpm 离心3-4 min. (提高离心速度和时间有利于沉淀贴壁更加紧密，但是常温长时间的离心会造成质粒DNA 降解) 2017/3/18 44 44

45 8. 小心将细胞离心的上清液转至已平衡的柱子內，室温下10,000 rpm 离心1 min，使裂解液完全流过柱子。弃去收集管中的过滤液.
9. 把柱子重新装入2ml 收集管中，加入700 μl Buffer KW (用70% 乙醇溶解)至柱子，室温10,000 rpm 离心1min，弃去洗涤液。 　注意：冻干的Buffer KW在使用之前必须按标签的提示用70%乙醇溶解。如果 Buffer KW 在使用之前是置于冰箱中的，须将其拿出置于室温下。

46 10.（可选）重复用700 μl 70%乙醇 （室温）洗涤柱子。室温下10,000 rpm离心1min。 注意：这一步对需要提取细胞转染用途的质粒来说是必要的。其它的分子生物学实验不需要。
11. 弃收集管中的滤液，将空柱子套回2ml收集管内收集管。室温下,13,000 rpm离心2 min以甩干柱子基质残余的液体。 （注意：省去这一步将导致残留乙醇于质粒ＤＮＡ中）。 2017/3/18 46 46

47 12. 把柱子装在一个干凈的1.5 ml离心管上，加入30-50 μl（具体取决于预期的终产物浓度，如果需要高浓度，可以用15 μl）的Buffer KE (可用灭过菌的超纯水或TE缓冲液代替)到柱基质膜的中央，室温放置0.5-1min, 13,000 rpm离心1min以洗脱DNA。第一次洗脱可以洗出80%左右的结合DNA。 如果再洗脱一次的话，可以把残余的DNA洗脱出来(不推荐)

48 常见问题 可能原因 对策 DNA 产量低 细胞在加入Buffer K2 前未完全打散 保证完全重悬细胞 细胞裂解不好
考虑更换新配制K2，成份：0.2M NaOH，1%SDS。 纯化柱未平衡 使用前平衡 Buffer K2 出现沉淀 一般出现在低温时 可以水浴提高温度溶解 产物出现高分子质量DNA 污染物 加入Buffer K2 后过度混匀细胞裂解液 加入溶液后不要涡旋或剧烈地混匀 裂解时间太长 适当缩短裂解时间 产物不能酶切 乙醇没有完全从柱子上去除掉 在洗脱前甩干柱子 2017/3/18 三峡大学李晓玲编写与制作 48 48

49 【实验安排】 【思考题 】 1.在质粒DNA提取过程中，Buffer 1\Buffer 2\ Buffer 3各起什么作用？
3.分离基因组DNA和质粒DNA有哪些不同之处？ 4.在Buffer TE中为什么要加入EDTA？ 【实验安排】 一个上午 2017/3/18

50 实验三 琼脂糖凝胶电泳技术检测质粒DNA 【实验目的】 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 【实验原理】
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同大小的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。而具有不同的相对分子质量的DNA片断泳动速度不一样，可进行分离。 2017/3/18

51 【实验原理】 DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如上次实验提取的质粒DNA，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA,简称CCCDNA),开环质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂（open circular DNA,简称OCDNA),线状质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂（linear DNA,简称LDNA)。 这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。 2017/3/18

52 影响琼脂糖电泳迁移的主要因素 DNA的大小 DNA的构象 琼脂糖浓度 缓冲液 2017/3/18

53 【仪器、材料与试剂】 （一）仪器 1.恒温培养箱 2.琼脂糖凝胶电泳系统 3.台式离心机 4.高压灭菌锅 5.凝胶成像系统 （二）材料
1.三羟甲基氨基甲烷（Tris) 2.乙二胺四乙酸（EDTA) 3.溴化乙锭 4.硼酸 5.溴酚兰 6.蔗糖 7.琼脂糖 8.DNA marker 9.pUC19质粒 2017/3/18

54 【仪器、材料与试剂】 （三）试剂 1.5×TBE(5倍体积的TBE贮存液) 配1000ml 5×TBE: Tris 54g 硼酸 27.5g
0.5 mol/L EDTA ml pH8.0 2.凝胶加样缓冲液（6×） 溴酚蓝 ％ 蔗糖 ％ 3. 琼脂糖 4. EB μg/ml 2017/3/18

55 【实验步骤】 1.制备琼脂糖凝胶 称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml 0.5×TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶。 2. 胶板的制备 ①取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙）。 ②将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。 ③将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡） 2017/3/18

56 【实验步骤】 ④待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在电泳槽内。 ⑤加入电泳缓冲也至电泳槽中。 3.加样
用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔（记录电样顺序及点样量）。 4.电泳 ①接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片断从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。 ②当溴酚蓝燃料移动到距凝胶前沿1/3—1/4处，停止电泳。 5.染色 将电泳后的凝胶浸入EB溶液中，染色15min,以观察在琼脂糖凝胶中的质粒DNA带（戴手套操作）。 2017/3/18

57 【凝胶电泳操作注意事项】 1.缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。 2.琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 3.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。 4.样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。 2017/3/18

58 【凝胶电泳操作注意事项】 5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。
7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。 2017/3/18

59 实验结果 在凝胶成像系统中紫外灯观察拍照（戴手套操作）。DNA存在处显出荧光条带。 M1、M2泳道为DNA分子Marker；
2017/3/18

60 【思考题】 【实验安排】 1.如何提高琼脂糖凝胶电泳的分辨率 ？ 2. EB染色的特点和注意事项是什么？ 3.酶切缓冲液的功能是什么？
4.凝胶加样缓冲液的两种成分的作用是什么？ 5.如果电泳图谱出现连续模糊的带纹，原因是什么？ 2017/3/18

61 实验四: DNA的限制性内切酶酶切及电泳分析
核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。

62 一、DNA的限制性酶切实验原理 1.限制性内切酶的类型 根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。

63 一、DNA的限制性酶切实验原理 1. 限制性内切酶的类型
第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链，但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。

64 一、DNA的限制性酶切实验原理 1. 限制性内切酶的类型 第二类（Ⅱ型）限制性内切酶就是通常使用的ＤＮＡ限制性内切酶.
它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段； Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。 正是得益于Ⅱ型限制性内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。

65 粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。
如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G|AATTC ……3’ 3’…… CTTAA|G …… 5’ 在双链上交错切割的位置切割后生成 5’……G AATTC……3’ 3’……CTTAA G……5’ 各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。

66 2017/3/18 三峡大学李晓玲编写与制作

67 2017/3/18 三峡大学李晓玲编写与制作

68 平头末端： II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：
5’…… GAT|ATC …… 3’ 3’…… CTA|TAG …… 5’ 　 切割后形成 5’…… GAT ATC …… 3’ 3’…… CTA TAG …… 5’ 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。

69 一、DNA的限制性酶切实验原理 2. 限制性核酸内切酶的命名法
2. 限制性核酸内切酶的命名法 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示。斜体 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，正体。即Hind。 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，正体。如HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。

70 二、操作步骤 1、质粒DNA的限制性酶切反应 　（1）将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管编号,用微量移液枪分别加入DNA 5μl， 10×缓冲液1μl，限制性内切酶1μl，ddH2O 3μl，用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 　（2）混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）, 37℃水浴保温1小时,使酶切反应完全。 　（3）每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。 (4) 将酶切反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。

71 【实验步骤】 EcoRⅠ酶切位点 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-3’ DNA Buffer EcoRⅠ ddH2O
1.取5μl质粒DNA溶液，加1μl酶切缓冲液，EcoRⅠ酶1μl（2U),无菌水补至总体积10μl，37℃保温3小时，加凝胶上样缓冲液（6×）2μl，准备电泳。 酶切溶液： EcoRⅠ酶切位点 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-3’ DNA Buffer EcoRⅠ ddH2O Total 5μl 1μl 3μl 10μl 2017/3/18

72 三、注意事项 １．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；
内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常 1U指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对应２－３u酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。

73 三、注意事项 ２．ＤＮＡ： 作为内切酶底物，ＤＮＡ应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。 这种抑制可通过： 增加酶作用单位数（10~20U/ug DNA）、 增大反应体积以稀释可能的抑制剂 或延长反应时间加以克服。

74 三、注意事项 ３．反应缓冲液： 反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶辅基；
Tris·HCl维持反应体系pH值在 之间； NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度： 低盐（10mM NaCl) 中盐（50mM NaCl） 高盐（100mM NaCl） 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。

75 三、注意事项 ４．酶解温度与时间： 大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应， 反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则是酶：ＤＮＡ=２－３：１，1-2小时即可充分酶解。

76 Lambda DNA/EcoRI+HindIII Marker

77 双酶切缓冲液的选择

78 限制性内切酶相对活性

79 实验五 DNA片段的PCR扩增 【实验目的】 学习和掌握PCR扩增的原理与方法，并理解PCR技术在DNA操作中的重要性。 【实验原理】
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n 倍。 2017/3/18

80 【实验原理】 1.变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。
3.延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5′→3′的方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。 上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温度延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～35个循环后DNA可扩增106～109倍。 2017/3/18

81 【实验原理】 典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模
板、反应缓冲液、dNTPs 、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。整个反应过程如下图所示。 2017/3/18

82 待扩增的DNA片段+dNTP+反应缓冲液
+两条引物+ Taq DNA聚合酶 +Mg 2+ 94℃变性1′ 55℃退火1′ 72℃延伸1′ 25～35循环 使引物与两条单链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上 在DNA聚合酶的作用下，从引物的3’-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板按5’→ 3’方向延伸，合成新生DNA互补链。 双链DNA变性，形成单链模板DNA。 94℃预变性5 ′ 72℃延伸5′ PCR全过程 2017/3/18

83 【仪器、材料与试剂】 （一）仪器 PCR热循环仪：PTC-100 琼脂糖凝胶电泳系统
金花牌微量移液器（20 ul，100 ul，1000 ul） （二）材料 1.质粒DNA 2.4种dNTP或2X PCR扩增MIX 3.引物P1和P2。 2017/3/18

84 【仪器、材料与试剂】 4. Taq聚合酶 5.DNA相对分子质量标准物 6.吸头，PCR管 （三）试剂 （1）PCR扩增
1.2×Taq MIX（含有dNTP、Taq聚合酶、反应Buffer和染料） 2.引物P1和P2 10μmol /L 3. DNA模板 1ng/μl 4. dd H2O 2017/3/18

85 【实验步骤】 1.在0.5ml Eppendorf 管内配制20μl反应体系 每组做6×的MiX，然后每人分装一个PCR小管
成 分 体积(ul) 终浓度 2x Taq Mix 10.0 1x Primer F(10uM) 0.5 0.5uM Primer R(10uM) Template 1.0 50ng-100ng ddH2O 8.0 Total 20 每组做6×的MiX，然后每人分装一个PCR小管 2017/3/18

86 【实验步骤】 2.扩增程序 反应程序为：94℃预变性5分钟，循环（94℃1分钟、56℃1分钟、72℃1分钟）30次，最后72℃延伸5分钟。（根据引物和目的DNA长度来调整退火和延伸时间） 3.聚丙烯酰胺凝胶电泳 （1%琼脂糖凝胶） 包括制胶、点样、电泳、染色等几个过程。 4.凝胶成像 记录带型结果或凝胶成像。 5.结果分析 2017/3/18

87 【实验结果示例】 根据电泳图谱绘分析水稻品种的遗传多样性。
M M 168bp 158bp 103bp 66bp 2017/3/18

88 【思考题】 1.影响PCR扩增的因素有那些？ 2.分析电泳后DNA带拖尾的原因。 3.分析电泳后无带的原因。 2017/3/18

89 实验六 PCR产物电泳检测及切胶回收 实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物的方法;
2017/3/18

90 实验原理 利用琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。
试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质材料，在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA、RNA的原理，配备设计独特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速离心机，在较短时间之内即可以高效回收核酸片段。 2017/3/18

91 仪器与试剂 1、琼脂糖凝胶电泳系统 2、紫外观察分析系统 3、单面刀片 4、离心机 5、恒温水浴锅 6、DNA回收试剂盒 7、ddH2O
2017/3/18

92 实验步骤（具体步骤以试剂盒为准） 1. 在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖．放入1.5ml离心管中。 2. 按每100mg琼脂糖加入300—600μl 溶胶液的比例加入溶胶液（本实验加500ul），置55℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一次促溶。 3. 将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm 室温离心1分钟，倒掉收集管中的液体．再将吸附柱放入同一个收集管中。 4. 在吸附杜中加入500uI漂洗液，室温静置1分钟后， 12000rpm 室温离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 2017/3/18

93 实验步骤 5. 再在吸附柱中加入500uI漂洗液， 12000rpm 室温离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 rpm 室温空离心1分钟。 7. 将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脱缓冲液，室温静置2分钟后， 12000rpm 室温离心1分钟（为提高回收效率可再洗脱一次），将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20℃。 8. 琼脂糖凝胶电泳检测回收产物。（可不做） 2017/3/18

94 切胶示意图

95 2017/3/18

96 凝胶纯化结果示意图

97 注意事项： 切胶时应快速操作，在紫外灯下时间长容易伤害到眼睛；
溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带时应使用长波长紫外灯，切胶时间尽量短。 胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA的回收率。 把洗脱液加热，使用时有利于提高洗脱液效率。

98 【思考题】 1、如何有效提高凝胶纯化PCR产物的效率？

99 实验七 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 【实验目的】 【实验原理】
学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和将外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术及转化体筛选的技术方法。 【实验原理】 感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（ 如：CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell)。 2017/3/18

100 【实验原理】 转化（transformation）： 是将异源DNA分子引入受体细胞，使其获得新的遗传性状的一种技术方法。
转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。 2017/3/18

101 【实验原理】 转化的方法： 1.化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞； 2.电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 2017/3/18

102 【实验原理】 克隆的筛选： 主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等； 2017/3/18

103 【影响转化率的因素】 细胞生长状态和密度。 转化的质粒 DNA 的质量和浓度。 试剂的质量。 防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。
2017/3/18

104 2017/3/18 三峡大学李晓玲编写与制作

105 【仪器、材料和试剂】 （一）仪器 1.无菌超净台 2.离心机 3.电热恒温水浴锅 4.分光光度计 5.恒温摇床 6.恒温箱 7.超低温冰箱
1.无菌超净台 2.离心机 3.电热恒温水浴锅 4.分光光度计 5.恒温摇床 6.恒温箱 7.超低温冰箱 （二）材料和试剂 1.菌株： E.coli DH5α（TA克隆试剂盒） 2.质粒：PUC19质粒 3.LB培养基 4.含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉素，浓度 50-100µg／ml 5.预冷CaCl2溶液（0.1mol／L） 2017/3/18

106 【实验步骤】 （一）菌种活化 1.用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时。 2.挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时 3.将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时，到OD600＝0.3－0.4 2017/3/18

107 【实验步骤】 （二）感受态大肠杆菌的制备 1.从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌
落，接种于2ml LB液体培养中，37℃振荡培 养12h左右，直至对数生长期。 2.取1.5ml菌液转接于30ml LB液体培养基中， 37℃振荡扩大培养2－3h（OD600nm≤ ， 细胞数< 108,此为实验成功关键）。 3. 将菌液转到30ml离心管中，冰上冷却 10min； 2017/3/18

108 【实验步骤】 4.于4℃，4000r／min离心10min； 5. 倒净上清培养液，将管倒置10min以便培养液流尽；
6.用6ml冰冷的0.1mo1／LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴30min； 7. 0～4℃，4000r／min离心10min，回收细胞； 8. 弃上清，加1.2ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶 液，小心悬浮细胞，分装，200µl一份，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液。 9. 制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。 2017/3/18

109 （三）细胞转化 感受态菌液 1 ——— 10 —— 200 2 3 4 编号 组别 质粒DNA/µl TE buffer/µl
0.1mo1／L GaCl2/µl 感受态菌液 1 受体菌ck ——— 10 —— 200 2 质粒ck （0.5µg） 3 阳性ck 4 转化实验组 2017/3/18

110 【实验步骤】 （三）细胞转化 1. 取200µl感受态细胞悬液加入pUC19质粒 DNA 10 µl(10-100ng), 轻轻摇匀，冰上
放置20-30min。同时设置两管对照： 受体菌对照：200µl感受态细胞＋10µlTE buffer 质粒对照： 200µl0.1mo1／L GaCl2溶液＋10µl质粒DNA溶液 阳性对照： 200µl感受态细胞＋10µl纯质粒 2. 42℃水浴中保温1－2min，然后迅速冰上冷却2min。 3. 立即向上述管中加入0.8ml LB液体培养基，（即得转化反应原液），摇匀后于37℃振荡培养约60min ，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。 2017/3/18

111 【实验步骤】 （四） 平板培养 1.取各样品培养液0.1ml，涂在含100 µg/ml Amp的LB平板培养基上。
2.菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于 37℃恒温培养箱内培养12-16小时，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养。 2017/3/18

112 【实验结果】 在含氨卞青霉素的琼脂平板上生长的菌落即为含有pUC19质粒的大肠杆菌 含有pUC19质粒的大肠杆菌 2017/3/18

113 【实验结果】 不含抗菌素 平板 含抗菌素平板 结果说明 受体菌对照组 有大量菌落长出 无菌落长出 本实验未产生抗药性突变株 DNA对照组
表3.1 培养皿内各实验组菌落的生长状况及结果分析 不含抗菌素 平板 含抗菌素平板 结果说明 受体菌对照组 有大量菌落长出 无菌落长出 本实验未产生抗药性突变株 DNA对照组 质粒DNA溶液不含杂菌 转化实验组（阳性对照） 有菌落长出 质粒进入受体细胞便产生抗药性 2017/3/18

114 【计算转化率】 统计每个培养皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积 转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg) 感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积 　 感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数 2017/3/18

115 【思考题】 【实验安排】 1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量 2.为什么要设置阴性对照？ 3.如阴性对照中长出菌，原因？
4.在Amp培养板中，菌的密度过高或培养时间过长时会在阳性菌的周围长出一些小的卫星菌落，它们是 Amps的，原因？ 5.还有哪些方法可以将外源基因导入受体细胞？各有什么优缺点？ 【实验安排】 从制备感受态细胞到转化一天可完成 2017/3/18

116 实验八 植物基因组DNA的提取及检测 【实验目的】 通过本实验学习从植物组织中提取DNA的方法 【实验原理】
细胞提取液中含有的SDS可溶解膜蛋白而破坏 细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑 制DNA酶的活性。再用氯仿－异戊醇抽提的方 法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。 2017/3/18

117 【仪器、材料与试剂】 (一)仪器 1.低温离心机 2.恒温水裕器 3.台式离心机 4.琼脂糖凝胶电泳系统 （二）材料
1.水稻幼叶 2.三羟甲基氨基甲烷（Tris） 3.乙二胺四乙酸（EDTA） 4.氯化钠 5.无水乙醇 6.氯仿 7.异戊醇 8.琼脂糖 9.十二烷基硫酸钠（SDS） 2017/3/18

118 【仪器、材料与试剂】 10.1.5ml、2ml离心管 11.陶瓷研钵 12.吸管、移液管 13.DNA相对分子质量标准物 （三）试剂
200mM Tris-HCl, PH7.5 250mM NaCl 2.5mM EDTA 0.5%SDS 2. 氯仿/异戊醇 24:1 3.TE溶液 10mM Tris-HCl pH=8.0 1mM EDTA pH=8.0 2017/3/18

119 【实验步骤】 ⒈取幼叶5cm(约1-2g)左右放于研钵中，加入少许石英砂，再加入400μl的SDS抽提液，磨成绿色浆状。应尽快研磨，以免抽提液挥发。 ⒉将研磨液倒入2ml的离心管，用约400μl的SDS抽提液洗涤研钵，将之也倒入离心管中。将两次抽提液混匀。 ⒊将离心管置于65℃的水浴锅中保温30-50min。每10min颠倒混匀离心管。 2017/3/18

120 ⒋冷却至室温后加入等体积（或稍多一点）的氯仿/异戊醇（24:1），充分颠倒混匀。
⒌在室温下放置5min，使其分层。 ⒍在离心机中以12000rpm离心5min。

121 【实验步骤】 ⒎取上清液于另一1.5ml的离心管中。小心吸取，不能弄混浊上清液，不能吸取到上清液下面的部分。重复第4至第7步1-2次。
⒏加入2倍体积的预冷的无水乙醇，轻轻混匀，静置直到DNA析出（室温下30min或4℃冰箱中过夜）。 ⒐在离心机中以12000rpm离心2-3min；去上清液(小心别弄丢DNA)。 10.加入70%乙醇5ml漂洗一至两次。 2017/3/18

122 【实验步骤】 11.在离心机中以12000rpm离心1min，去上清液。 12.倒置在干净的吸水纸上或风干（约30 min）
13.加入 μl的TE溶液，溶解后置于4℃冰箱中保存待用。 14.取4μlDNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度与质量 2017/3/18

123 DNA Extraction Kit 试剂盒组成： Mini column: 50个 2ml Collection: 50个
Buffer KPL1 ：50ml （lysis solution） Buffer KB ：30ml (column balance solution) Buffer KW：(wash solution)使用前加50ml无水乙醇 Buffer KE： 10ml (elution) 2017/3/18

124 操作步骤 (一) 平衡吸附柱 取一吸附柱装入2ml收集管中。
加入300ul Buffer KB至平衡柱，室温下12000rpm离心1min，废弃收集管中滤液，将平衡柱套回收集管备用 (二)样品处理 将10-100mg植物组织直接放入研钵，加入500ul的KPL1，研磨匀浆，然后转入1.5ml离心管，室温下12000rpm离心2min。

125 (三) 吸附 将上步离心上清液，移至平衡好的吸附柱中，室温下12000rpm离心30s，废弃收集管中过滤液，把平衡柱装回收集管。 (四) 漂洗 加入700ul Buffer KW，室温下12000rpm离心30s，废弃收集管中过滤液，把平衡柱装回收集管。 用700ul的70%乙醇洗涤平衡柱，12000rpm离心1min，废弃收集管中过滤液。

126 (四) 漂洗 (五) 洗脱 将上步平衡柱套回收集管，室温下12000rpm离心2min，以甩干残液。
把平衡柱装入新的1.5ml离心管，加入50ul的KE Buffer，65℃下放置5-10min，室温下12000rpm离心1min洗脱。 4℃下保存备用。

127 【实验结果】 【思考题】 提取得到的DNA应为一条带，如DNA降解会出现弥散带。
1.在DNA提取时，SDS、NaCl、EDTA、氯仿/异戊醇及无水乙醇各起什么作用？ 2.如何制备1％的琼脂糖凝胶？ 【实验安排】 提前两星期准备幼苗，一个下午提DNA并检测。 2017/3/18