紫外/可见/近红外分光光度计 黄祖芳 E-mail:zfhuang@fjnu.edu.cn.

Presentation on theme: "紫外/可见/近红外分光光度计 黄祖芳 E-mail:zfhuang@fjnu.edu.cn."— Presentation transcript:

1 紫外/可见/近红外分光光度计 黄祖芳

2 概 述 分光光度法基本原理 仪器的基本构成 Lambda950结构和参数 具体应用与讨论

3 一、概述 分光光度法在分析领域中的应用已经有上百年的历史，至今仍是应用最广泛的分析方法之一。1862年，哈托莱（Hartolay）和贝利（Bailey）等人研究了各种溶液对不同波段的截止波长，发现与吸收光谱相似的有机物，它们的结构也相似。并且可以解释用化学方法所不能说明的分子结构问题，初步建立了分光光度法的理论基础，以此推动了分光光度计的发展。

4 而分光光度计在分析领域中的应用已有几十年历史。1918年美国国家标准局研制了世界上第一台紫外可见分光光度计（不是商品仪器，而且不成熟）。此后，紫外分光光度计被不断改进，很快在各个领域的分析工作取得应用。 1945年美国Beackman公司推出世界第一台成熟的、商品化的紫外可见分光光度计仪器。

5 随着分光元器件及分光技术、检测器件与检测技术、大规模集成制造技术等的发展，以及单片机、微处理器、计算机等技术的广泛应用，分光光度计的性能指标不断提高，并向自动化、智能化、高速化和小型化等方向发展。
分光元器件方面：棱镜、机刻光栅，全息光栅。 仪器控制方面：单片机、微处理器的出现以及软硬件技术的 结合，从早期的人工控制发展到自动控制。 显示、记录与绘图方面：从早期电位指示、绘图仪绘图，到 如今的计算机显示屏显示。

6 检测器方面：光电池、光电管，光电倍增管甚至光电二极管
阵列。 仪器构型方面：单光束，双光束 仪器向小型化、数字化、便携式方向发展 满足环境、野外、海洋等现场分析测试需要 较典型的代表有：海洋公司（Ocean Optics）和美国HACH公司，国内的普析通用（北京）小型，模块化的光纤光谱仪

7 (Ocean Optics) Ocean Optics

8 HACH 北京普析通用

9 二、分光光度法的基本原理 紫外可见吸收光谱的形成
原子或分子中的电子，总是处在运动状态中，每一种运动状态都具有一定的能量，属于一定的能级。在各种外界条件的激发下，以光或热的形式释放出能量。从而实现能级的跃迁，同理，当这些电子吸收了外界的辐射能量后，就会从能量低的能级跃迁到能量高的能级。 物质的分子吸收光谱形成的机理，就是由于能级之间的跃迁所引起。

10 一个分子的总能量 分子吸收外来辐射能量，能量改变为： 其中： 当分子发生电子能级跃迁时，不可避免的发生振动能级间的跃迁，而发生
电子能级跃迁和振动跃迁时，不可避免的发生转动能级之间的跃迁，因此， 得到的为带状光谱。

11 定量分析的基础----------比耳定律
几乎所有的光学分析仪器（紫外可见分光光度计，原子吸收分光光度计，液相色谱仪的紫外检测）的原理都采用朗伯-比耳定律（简称比耳定律） A为吸光度；I0为入射光强；I为透射光强；b为液体厚度；K0为消光系数，C为摩尔浓度

12 或表达为： 其中， 为溶液浓度为1mol/L，光程b为1cm时的吸光度， 的变化范围是10～105， >104为强吸收， <103为强度小的吸收

13 三、仪器的基本构成 一、电光源系统 光源部分：紫外可见分光光度计的光源一般为氘灯和卤钨灯两种。
氘灯提供紫外波段使用的光源，发光的波长范围一般为 nm，常见的使用波段为 nm左右。另外氘灯在486.0nm、583.0nm和656.1nm三处各有一根特征谱线，其中656.1nm常用于仪器定标波长。 氘灯为易耗件，一般使用寿命为：国产氘灯 h；进口氘灯为1000h（少数达2000h）另外跟电源设计的好坏有关。我国国家标准规定，如果新的灯测试数据为100，那么能量不足新灯的45%，则被认为寿命到期。

14 氘灯寿命(Heraeus)

15 电源部分：略

16 二、外光路系统 外光路系统一般由光源、反射镜或透镜组成。反射镜一般采用凹面反射镜，作用是将光源发出的光成像在单色器的入射狭缝。
外光路系统形式：

17 三、分光系统 分光系统是紫外可见分光光度计的核心部分。主要由入射狭缝、准直镜、光栅和出射狭缝等组成。
狭缝作用：入射狭缝限制杂散光进入，出射狭缝限制光谱带宽； 准直镜：从入射狭缝进来的复合光变成平行光 单色器：入射狭缝、出射狭缝、色散元件（光栅或棱镜）、准直镜等组成。主要技术指标包括：工作波长范围，波长准确度，波长重复性，光谱带宽，杂散光，波长扫描速度等。比较常用的有C-T型光栅单色器，两块球面镜可相互补偿慧差，具有较好的成像质量，并且增加狭缝高度不会严重影响仪器的分辨率。

18 四、Lambda950结构和参数 Lambda950仪器外观图

19 Pre-aligned for fast replacement and maximum uptime
For ultra-low stray light performance Second sampling area houses a range of snap-in modules Precise Adjustment of beam height For sensitive and accurate measurements on highly absorbing samples Provide full-range UV/Vis/NIR coverage from 175 – 3300 nm Largest sample compartment in the Industry 4-segment design increases measurement accuracy Corrects for inherent instrument polarization

20

21

22 Chopper 黑区/样品/黑区/参比循环

23

24 仪器主要参数指标 型号 Lambda950 Lambda900 Lambda650 原理 双光束，双单色器，比率记录 光学系统
全反射光学系统（SiO2涂层）全息光栅1440刻线/mm UV/VIS，闪耀位置240nm，360刻线/mm，NIR，闪耀于1100nm 全反射光学系统（SiO2涂层）全息光栅1440刻线/mm UV/VIS，闪耀位置240nm， 全反射光学系统（SiO2涂层）全息光栅1440刻线/mm UV/VIS，闪耀位置240nm 光束分光系统 斩光器（46Hz，周期：暗/样品/暗/参考）CSSC技术 探测器 R6872光电倍增管（UV/VIS区域） 半导体冷却的PbS探测器（NIR）

25 光源 Pre-aligned 钨卤素灯和氘灯 波长范围 175nm-3300nm 175nm-900nm 190nm-900nm 分辨率 ≤0.05nm(UV/VIS) ≤0.20nm(NIR) N/A ≤0.17nm(UV/VIS) 波长精度 +/-0.08nm UV/Vis +/-0.30nm NIR +/-0.08nm +/-0.15nm

26 软件操作 UV WinlabV5 由两个主要部分组成：资源管理器和工作区。 在UV Winlab的界面上可看到三个分栏，如下图所示:

27 UV winlab中添加仪器 采集数据前，必须在UV Winlab中添加仪器，仪器从UV winlab的资源管理器里添加，如下图示:
Instrument‥

28

29

30

31 UV winlab中添加方法 方法是对样品进行何种分析测试的设定。方法包含仪器参数的详细设定、是否使用附件及其设置、样品状况的记录表、结果数据的处理和输出报告，常用的方法有：Scan，Timedrive，Wavelength quant，Wavelength program，Polarization scan等。 Timedrive：设置项目包括，分析波长，纵坐标类型和狭缝宽度，另外还有两个时间设定：time interval(测量的时间间隔)和 total time。

32

33

34

35

36

37

38

39 方法设置 数据采集（Data collection）
设置扫描范围，开始（start）值必须大于结束值（end） 纵坐标类型可选择的有：A，T%，E1(样品光路能量值)，E2（参考光路能量值），R% 仪器页面（Instrument） 狭缝宽度（Slit width）0.5、1、2或者4nm。通常所选择的狭缝宽度为所测量的谱带宽度的五分之一到十分之一。 数据间隔（Data interval）采样的数据间隔

40 校正页面（Correction） 校正用来规定多长时间采集一次基线，基线的类型，反射设置和吸收光度设定。 设置基线校正模式： Always at task start Always before next measurement As required at task start As required before next measurement

41

42 数据处理(Processing) 处理程序是UV Winlab当中特色部分。处理程序允许在某些方式下改变光谱，或者另一个光谱可以从原始的光谱创建。具体操作步骤： Processing页面，点击“Add”，增加一个处理步骤，也可以增加多个，处理步骤排列的顺序就是它们被执行的顺序。因而可以针对性的进行“Up，Down”调整。可选择的处理选项有： Arithmetic，数学计算，即把光谱当数字一样进行运算。 Convert X 横坐标转换(nm和cm-1) Convert Y 纵坐标转换

43

44 Derivative 求导，导数光谱 使用光谱求导的目的：谱带没有完全分开时，判断谱带的中心点；或定量分析时，用来减少带宽的影响。 Difference 差谱 Interpolate 插值 Normalize 归一化 Peak Table 峰值表 Smooth 平滑 Equation 方程式

45

46

47

48

49

50 Universal Reflectance Accessory
附件介绍 Universal Reflectance Accessory URA 可变角镜面反射模块。工作参数： 角度范围：8度-68度，测绝对或相对反射 波长范围：3100nm-190nm 样品尺寸：8mm-150mm，3mm-8mm之间的可用 custom-made sample holder

51

52

53

54 150 MM Intergrating Sphere Reflectance Accessory
积分球是内置漫反射附件。工作参数： 波长范围：2500nm-190nm 样品尺寸：8mm-150mm，3mm-8mm之间的可用 custom-made sample holder

55

56

57

58

59 Specification

60 五、具体应用与讨论 1、定量分析 紫外分光光度计的应用领域涉及制药、医疗卫生、化学、环保、食品、生物、材料等领域。 绝对法：
标准法：相同测试条件下，分别测试标准样品溶液和被测样品 溶液的吸光度值A标和A样，然后计算。

61 标准曲线法：紫外可见分光光度计最常用的定量分析方法是标准曲线法,即先用标准配制一定浓度的溶液,再将该溶液配制成一系列的标准溶液。在一定波长下，测试每个标准溶液的吸光度，以溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。将测试样溶液吸光度值按曲线的位置查找出对应的浓度或含量。 原则上所配制的标准溶液的吸光度在 A范围内，吸收光度精度可达0.5%，值得注意的是，分析测试不是千篇一律的按照此标准，主要还跟仪器的参数特性有关。仪器杂散光指标尤为重要。

62 最小二乘法：实际上也是回归方程法，因为，分光光度法中试样的吸光度A与试样的浓度C之间的关系可用方程，C=aA+b描述，如果做标准曲线时求出的回归方程差，相关系数（R）不好，测定量误差就很大。因此，提出应用最小二乘法。 应该注意两点： 1、回归方程是在特定条件下求得的，不能随便套用 2、分光光度法中试样的吸光度与试样的浓度C之间的关系， 应建立在回归方程中的取值范围内，否则，不能随便外推。

63 1.1生命科学领域的应用 蛋白质分析工作中的应用：蛋白质含量的检测，基于蛋白质对紫外光的主要吸收波长为280nm

64 2、定性分析 某个未知物的紫外吸收光谱如果峰较多，结构复杂，那么只用分光光度计是不能作为定性分析的，必须还要有色谱、红外、质谱、波谱等多种仪器的联合使用，才能做定性分析。 如果两吸收光谱的形状和吸收峰的数目、位置、拐点等完全一样，就可初步判断未知物与标准物是同一种物质，当然不排除特殊情况。 利用波长位置判断有机化合物的生色基团

65 3、学习与讨论部分 1、双光束比单光束好? 价格上，一般双光束比单光束贵。
光源波动方面，双光束可以抵消波长引起的误差，而普遍认为单光束不能，光源带来的影响有多大？而且光源的设计也在发展，对于单光路设置采集数据多次取平均能否改善？ 能量方面，双光束由一束变两束，能量减半？ 双光束的信噪比，光度准确度，基线飘移等都比单光束好。

66 2、透过率T%与吸光度A的关系

67 3、影响比耳定律偏离的主要因素 非单色光 理论分析建立在单色光的基础，仪器上不可能得到真正的单色光。 杂散光
大部分来自光栅，另外外光路。高浓度时，影响更严重；此外， 不少物质还会产生光致发光或产生荧光，也会导致比耳定律偏离。 噪声 噪声限制紫外可见分光光度计对样品浓度分析的下限，主要来自 电子学系统，正负噪声分别带来吸光度值增大和减小的影响。 化学因素

68 4、比耳定律的可靠性 实际的分析条件有偏差，在使用中就会出现可靠性的问题。 （一）非单色光 （二）吸光物质成分之间的相互作用
原先的假设是吸光粒子相互无关，实际只存在稀溶液（浓度≤0.01mol/L），在高浓度时，容易产生聚集、聚合等现象，从而影响吸光度；并且，粒子之间的相互作用改变了粒子本身的电荷分布，从而改变对所吸收的入射光能量的要求，导致吸收峰位、形状、高度等随浓度增加而改变。 （三）光程不等 照到样品或溶液比色皿上的光存在一定的夹角，导致光程改变。 比色皿匹配的问题。

69 5、吸光度值在什么范围里最准确? 一般认为吸光度在 之间误差小,在0.434处最小。有一个问题,如果吸光度在0.8以上,或者在0.2以下，是否有必要将溶液浓缩或稀释而让其吸光度在 的范围内?

70 6、光谱带宽与狭缝宽度 光谱带宽以nm计，而狭缝宽度以mm计，经常有称分光光度计仪器的狭缝宽度为多少纳米，原则上是不正确的，但实际大家都这么用。

71 7、光度准确度(Accuracy)和光度精密度(Precision)
准确度：测量值与理论值之差，偏差越小说明测量结果越准确可靠。 精密度：连续重复多次测量某一吸收峰值，其中最大值与最小值之差。 差值越小，说明仪器的光度重复性越好。 (a)精密度，准确度都不好 (b)精密度好，准确度差 (c)精密度差，准确度好 (c)精密度，准确度好

72 8、吸光度A为负值

73 参考书目

74 Thank You !