第六章 可见紫外分光光度法 一、分光光度法的基本概念 二、可见紫外分光光度计 三、分光光度法的基本定律 四、分子结构与电子光谱

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1 第六章 可见紫外分光光度法 一、分光光度法的基本概念 二、可见紫外分光光度计 三、分光光度法的基本定律 四、分子结构与电子光谱
第六章 可见紫外分光光度法 一、分光光度法的基本概念 二、可见紫外分光光度计 三、分光光度法的基本定律 四、分子结构与电子光谱 五、定 量 分 析 六、在农药分析中的应用

2 一、分光光度法的基本概念 分光光度法是根据物质对光具有选择性的吸收特征而建立起来的一种分析方法，通常又称吸收光谱法。吸收光谱是可见光谱、紫外光谱和红外光谱的统称。 吸收光谱是由物质吸收光能而产生。光具有波粒二重性，它既是电磁波又是辐射能。 （一）光的波动性 光作为电磁波，具有波动性的特征，可用波长（λ）、频率（v）及波数（σ）来表示。三者的关系可用以下表示。 式中：λ——波长 c——光速 v——频率 σ——波数，为每厘米长度中波的数目，即波长的倒数，单位为1/cm。

3 （二）光的微粒性——普朗克公式 光作为辐射能又具有微粒性的特征。所谓微粒性，即指光是由光量子（或光子）的一种粒子组成。光辐射的能量是一份一份的。单个光量子的能量与波长的关系可用普朗克（plank）公式表示 式中：E——能量； h——普朗克常量 从公式可见，光量子的波长与其能量成反比，波长愈长，能量愈小。 （三）可见紫外、红外光区的划分 根据电磁波具有波粒二重性的特点，可把自然界存在的各种电磁波按波长顺序排列成谱，称为电磁波谱，如表6－1所示。

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5 可将电磁波波长划分为若干波段区域，如X射线区、远紫外区、可见光区和红外光区等，从表6－1可以看出各区的波长一次上升，而其能量则依次下降，各波段能量不同，引起物质运动的形式亦不同。物质吸收紫外光和可见光则引起分子中价电子的跃迁；物质吸收红外光则引起分子振动，因此可见紫外光谱又称为电子光谱，红外光谱又称为分子振动光谱。 本章讨论可见及紫外分光光度法，由于可见紫外吸收光谱是由电子跃迁产生的，因此波长为100－800nm的光线才有足够的能量引起电子跃迁。在这个范围内又可分为三个区域，100－200nm为远紫外区；200－400nm为近紫外区；400－800nm为可见光区域。

6 二、可见紫外分光光度计 分光光度法使用的仪器是分光光度计。分光光度计的种类很多，其仪器结构的主要部件都是由光源、分光系统（单色器）、吸收池、检测器和记录仪所组成。见图6－1。

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8 在可见紫外分光光度计上常用的光源是钨丝灯和氢弧灯(或氘灯)
（一）光源 在可见紫外分光光度计上常用的光源是钨丝灯和氢弧灯(或氘灯) 可见光区用钨丝白炽灯，其波长在320－2500nm之间。 紫外光区用氢弧灯或氘灯，其波长在180－375nm。 用氢灯或氘灯作为光源，灯管上必须装有石英窗（因玻璃对紫外光有吸收）。

9 （二）单色器 单色器是指能将不同波长的入射光分散为单色光的装置，主要由透镜（聚焦作用）、输入输出狭缝（阻挡不需要的光）和散射装置（把白色光散成不同波长的光，是一种分辨器）组成。散射器是单色器的核心，由棱镜或衍射光栅组成。玻璃棱镜只能用于可见光区；石英棱镜或反射光栅可用于紫外、可见及近红外光区。 棱镜的色散原理：不同波长的光在玻璃或石英中的折射率不同，波长短的光折射率大，波长长的光折射率小，当平行的混合光经过棱镜后，就会使不同波长的光按次序偏折分开，而成光谱。其光波由紫外线到长波方向越来越密。

10 光栅的色散原理：光栅是在石英或玻璃表面上刻划许多等距离的平行线，大约每2
光栅的色散原理：光栅是在石英或玻璃表面上刻划许多等距离的平行线，大约每2.45cm刻15000－30000条线。刻线处不透光，光只能在两条刻线中间的平面处透过去。这些平面形成极微小的缝，光透过小缝时即产生绕射现象。较长的光波偏折的角度大，较短的光波偏折角度小。 从棱镜或光栅射出的光经旋转反射镜就可依次射出狭缝，经聚焦后达到吸收池。 现代高级分光光度计往往采用双单色器，即包含两个光栅或两个棱镜，或一个棱镜一个光栅，这样可以减少杂散光，提高仪器的分辨能力。

11 （三）吸收池 吸收池是用以盛装样品溶液进行测定的容器。 可见光区用玻璃吸收池；紫外区需用石英吸收池。 池厚（内径）有0.5，1，2cm等几种，一般使用1cm的，吸收池的光洁度对测定影响很大，透明光学面不得用手指拿，不得用毛刷等硬物擦洗，通常用擦镜纸擦洗。测定时如遇挥发性液体或气体，需盖上池盖，以免溶液挥发影响测定浓度或产生气体损害仪器部件。

12 （四）检测器 检测器的功能是检测光信号并将其转变为电信号。 检测器主要部件为光电池或光电倍增管等。 光电倍增管是当前应用最多的一种检测器，它的作用是利用二次电子发射以放大光电流，放大倍数可达108倍。对检测器的要求是灵敏度高、对辐射响应时间短、对辐射能量响应的线性关系良好、噪音小、性能稳定等。

13 （五）测量信号指示系统 用光电倍增管作检测器，需要将检测器信号放大以后用记录器记录下来，不同型号分光光度计记录装置不同，目前许多由微处理机控制的紫外可见分光光度计，可自动调零，自动筛选波长，自动设置参数、扫描与计算均自动完成，大大减少了人为误差。

14 三、分光光度法的基本定律 （一）光吸收定律
用分光光度法进行定量分析是以朗伯－比尔定律(Lambert－Beer’s Law)为依据的，它是描述各种类型的电磁辐射被介质吸收规律的基本定律，简称比尔定律。定律具体内容是：当一束平行的单色光（I0）射入具有平行平面的吸光介质（溶液）时，一部分（I）透过介质（溶液），一部分光被介质（溶液）所吸收。光的强度随介质的厚度及吸光物质的浓度的递增而依指数规律递减。

15 此公式一般适合于稀溶液，也可用于气体或固体。
比尔定律基本公式如下： 式中：A——吸光度（absorbence） T——透光度（transmittance）或称透射率； I0——入射光强度； I——透过强度； L——光程长度即样品溶液的厚度（通常为吸收池的 厚度）； C——样品溶液的浓度； K—— 。 此公式一般适合于稀溶液，也可用于气体或固体。

16 在具体应用时，被测溶液浓度可用mol/L或百分浓度来表示。
用mol/L来表示时，用L为1cm比色池，相应的吸光系数称为摩尔吸光系数（molar absorptivity）用符号ε表示 用百分浓度g/100ml来表示时，L为1cm比色池，相应吸光系数称为百分吸光系数，用符号 表示。 E与ε的关系如下： 式中： m——物质的分子量

17 测定ε值得意义 (1) 根据ε值的大小，可以确定化合物吸光度的强弱， ε值＞104为强吸收， ε ＝103－104为较强吸收， ε ＝102－103为较弱吸收， ε ＜102为弱吸收。 (2) ε值大小与电子跃迁种类及电子在两个能级间跃迁的几率有关，如不饱和双键化合物，可以产生π→π*跃迁， ε值则很大，属于强吸收。又如n→σ*及π→π*跃迁，所需能量相差不多，但二者中π→π*跃迁几率较大，因此ε值比n→σ*的大，约为104，属强吸收。 (3) ε值可以衡量不同物质在同一波长下吸收能力的强弱，在同一波长下， ε值越大吸收光能力愈强。 (4) 对同一化合物而言，在不同波长下具有不同的ε值，但在一定波长下，它又是一个特征常数，因此可作为有机化合物定性鉴定的参数之一。 (5) ε值是衡量分析灵敏度高低的依据之一， ε值越大，灵敏度越高。

18 （二）吸收曲线 吸收曲线又称为光谱曲线或光吸收曲线，是指用固定浓度及吸收池的厚度，在不同波长下用分光光度计测得相应的吸光度（A），然后以波长为横坐标，吸光度值为纵坐标作图，所得的吸光度－波长曲线，即为吸收曲线。如图6－2所示。

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20 曲线的峰称为吸收峰，它所对应的波长称为最大吸收波长，用λmax表示。曲线的谷所对应的波长称为最小吸收波长，用λmin表示。峰旁一个小的曲折称为肩峰，在吸收曲线的波长最短一端不成峰形的部分，称为末端吸收。吸收曲线有时也可用ε或logε作为纵坐标。此外也可用百分透光度为纵坐标，但应用较少。 图6－3绘出了不同浓度的“稀禾定”溶液的吸收曲线。从图中看出，同一物质即使浓度改变，其吸收曲线形状及最大吸收波长不变，三种浓度的最大吸收波长均为283nm。

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22 吸收曲线的用途： （1）吸收曲线的特征和形状是由分子的电子结构决定的，它反映了物质分子中能级的变化情况； （2）它描述了物质对不同波长光的吸收能力，在定量分析中可作为选择最大吸收波长的依据； （3）吸收曲线体现了物质的特性，不同物质具有不同特征的吸收曲线，因此可用作定性鉴定的依据。

23 （三）对比尔定律的偏离 根据比尔定律的原则，当吸收池厚度不变，以吸光度对浓度作图时，应得到一条通过原点的直线，但在实际工作中，吸光度与浓度之间的线性关系常常发生偏离，使曲线弯曲，发生正偏差或负偏差。如图6－4所示。

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25 偏离比尔定律的因素主要有： 1．被测溶液浓度过大 比尔定律只适用于测定稀溶液，在浓度高时由于产生吸收的组分中粒子密度变大，以致每个粒子都可以影响邻近粒子的电荷分布，这种粒子间的相互作用，使吸收辐射的能力发生了改变，以致发生偏离。 2．化学偏离 由于吸收组分的缔合、解离、光化学作用或与溶剂的相互作用，使吸收峰的形状、位置、强度以及精细结构都发生变化，导致偏离。 3．杂光的影响 比尔定律要求被测溶液吸收的光是单色光，但事实上由于分光光度计的单色器的输出狭缝分离出的光常混有与选定谱带无关的杂光，这种多色光，则导致对比尔定律的偏离。一般良好的可见紫外分光光度计在全谱域杂光可保持低于0.1％，多数情况下可以不考虑杂光的影响。但是当被测试样浓度增加或波长接近紫外的短波界限时，则会导致检测器灵敏度下降，而且使工作曲线弯向横坐标。由表6－2可见，含杂光的比率越高，对测定灵敏度的影响就愈大。

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27 4．谱带宽度的影响 在实际测定样品时，为了保证足够的光强，分光光度计的狭缝必须保持一定宽度，因此，由出射狭缝投射到被测物质上的光，并不是真正的单色光，而是一个有限宽度的谱带，称为光谱带通。随着光谱带通宽度的增大，光源谱带增宽，谱带的精细结构逐渐消失，峰值吸光度降低，工作曲线的斜率也随之降低，从而偏离比尔定律。 5．其它因素的影响 除上述主要因素外，试样中含有悬浮率或胶粒，以及会产生荧光的物质都会使透射光强度减少而偏离比尔定律。

28 (四)精密度与检出限 1．精密度 可见及紫外分光光度计产生误差的主要来源，在于吸光度的测量误差。 根据比尔定律公式 可以改写为 上式左边换成自然对数，然后两边取微分，可得： 上述公式两式相除，经过整理可得下式：

29 如以有限值表示又可以写成 式中： ——浓度相对误差， ΔT——透光率T测量中的绝对误差。 通常市售的分光光度计透光率的测量误差一般在±0.002到±0.01之间。假设透光率测量误差ΔT为0.005，通过以上公式计算，可得到与T及A的函数关系数据列于表6—3。

30 表6－3 浓度百分误差的变差与透过率T、吸光度A的函数关系
浓度百分误差 ×100 0.95 0.022 ±10.2 0.90 0.046 ±4.74 0.80 0.097 ±2.80 0.70 0.155 ±2.00 0.60 0.222 ±1.63 0.50 0.301 ±1.44 0.40 0.399 ±1.36 0.30 0.523 ±1.38 0.20 0.699 ±1.55 0.10 1.000 ±2.17 0.030 1.523 ±4.75 0.020 1.699 ±6.38

31 2．检出限 检出限不仅决定于吸光系数。也决定于所用仪器的噪声水平。对多数商品分光光度计而言，1％吸收(T＝0.99，A＝0.004)与其最小可测信号相符。 在理想情况下，摩尔吸光系数可高达105，如使用1cm光程吸收池，吸光度范围在0.1 — 1.5时，浓度范围则为1×10－6 — 1.5×10－5 mol／L。如果待测化合物的摩尔吸光系数为105，使用10cm吸收池则近似检出限将是4×10－9 mol／L。

32 四、分子结构与电子光谱 （一）可见及紫外吸收光谱的产生
物质的分子在室温下，一般处于基态能级，当它受到电磁辐射的作用时，吸收一定能量的光子，使分子受到激发，就从原来能量较低的基态能级跃迁到能量较高的能级(激发态)，而产生吸收光谱。 分子跃迁有三种类型，即电子跃迁，振动跃迁及旋转跃迁，这三种跃迁所需的能量不同，可以产生三种不同的吸收光谱，即电子光谱，振动光谱及转动光谱。振动光谱及转动光谱能级跃迁需要能量较小，位于红外区及远红外区，电子跃迁所需能量最大，在1—20eV(电子伏特)之间，位于可见与紫外光区，这种光谱又称为电子光谱或可见紫外光谱。本章要讨论的可见紫外光谱就是由电子跃迁所产生的。

33 1．有机化合物中价电子的类型 在有机化合物中有几种不同性质的价电子，根据分子中电子成键的种类不同，可分为三种类型：形成单键的电子称为σ键电子；形成双键的电子称π键电子，氧、氮、硫、卤素等含有未成键的电子称为孤对n电子。以醛基为例示意如下： 当有机化合物吸收紫外光时，这些价电子可以从基态跃迁到较高的能级状态(受激态)，此时电子所占的轨道称为σ*，π*反键轨道。

34 2．电子跃迁的类型 有机化合物分子中电子跃迁的方式与键的性能有关。电子跃迁主要有下面几种类型，即σ→σ*、n→σ*、n→π*及π→π*。各种跃迁所需能量大小为 σ→σ*＞n→σ*＞π→π*＞n→π* 见图6—6所示。 通常当电子由一个能级跃迁到另一个能级时，同时伴随有振动能级和转动能级的跃迁。因此，所得到的吸收光谱不是线状光谱而是带状光谱。

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36 (二)几个常用术语 1．生色基(又称发色基团)
有机分子中能够吸收紫外或可见光而引起电子跃迁的不饱和基团叫做生色基 (Chromophores)又称发色基团(Chromophoric group)。 生色基主要是指共轭多烯系统，含有未成键电子对的双键结构或基团、芳香基团及部分含有未成键电子对杂原子的基因。常见生色基的最大吸收峰见表6—4。

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38 2．助色基(又称助色团) 某些含有未成键电子对的原子或基团，称为助色基(Auxochrome)，助色基本身在紫外区没有特征吸收带，但当它们与生色基连在一起时，可以使生色基所产生的吸收峰向长波方向移动，并使其强度增加。这类基团有－OH、－NH2、－SH、 －SO3H、 － COOH、 － Cl、 － Br等。 3．红移、蓝移、增色效应、减色效应 红移(Bathchromic)：指因结构变化(如顺反异构)、共轭体 系加大、助色基效应、溶液pH变化等引起吸收峰向长波 移动的效应。 蓝移(Hypsochromic)：指由于取代基或溶剂等的影响，使吸收峰向短波方向移动的效应。 增色效应(Hyperchromic effect)：由于结构变化或其它原因使吸收强度增加的现象。 减色效应(Hypochromlc effect)：使吸收强度减弱的现象。

39 (三)有机化合物结构与电子跃迁及吸收谱带的关系
1．饱和单键碳氢化合物 只含σ键电子，电子结合的很牢固，只有吸收很大能量后才能产生σ→σ*跃迁。在近紫外区没有吸收峰，只有在远紫外区(10一200 nm)才有吸收峰。这已超出了紫外可见分光光度计的范围，应用不多。 2．饱和烃中氢被氧、氮、硫、卤素等原子所取代 由于这类原子中有孤对n电子(如－HH2、－OH、－S、－X等)n电子较σ电子容易激发，可产生n→σ*跃迁，此种跃迁所需能量较σ→σ*小。含这些原子的化合物在150－250 nm的紫外区有吸收峰、少部分在近紫外区(＜200 nm)有吸收。表6—5列出了能进行n→σ*跃迁的一些基团和原子。

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41 3．不饱和碳氢化合物 含有π键电子，它比n电子更易于激发可以产生π→π*跃迁，此种跃迁的能量较σ→σ*及n→σ*都小。吸收峰大都位于紫外区(200 nm)。 具有共轭双键的化合物，由于相间的π与π键相互作用。形成大π键，使电子更容易激发，可使吸收峰波长向长波方向移动。共轭分子的吸收光谱通常有两条谱带，一种称为K带(德文“共轭作用”得名)，是由π→π*跃迁所产生。这种跃迁是整个共轭键的基态向激发态的跃迁。例如C＝C—C＝C→C＋—C＝C—C＋；另一种称为R带(德文“基团”得名)为n→π*跃迁所产生。为共轭体系一端的单个生色基的跃迁。如－C＝O、－NO2、－N＝N－、－N＝O等。

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43 4．芳香族化合物 主要包括苯及芳香杂环的衍生物：
4．芳香族化合物 主要包括苯及芳香杂环的衍生物： (1)苯：苯为环状共轭体系。 其紫外光谱特征是具有π→π*跃迁所引起的三组谱带。 在180－184nm处(ε＝47000)、有强吸收的E1带，因在远紫外区，实用意义不大。 在204nm处(ε＝7900)有中强吸收的E2带，E2带在末端范围，也不常用。 在230－270 nm处(ε＝200)有弱吸收的B带。B带是由π→π*跃迁及振动效应的重叠引起的一系列锐峰，又称“精细结构”吸收峰。在气体或非极性溶剂中精细结构较清楚，在极性溶剂中，精细结构消失。图6—7、图6—8分别为苯的紫外光谱及苯酚的B吸收带。

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45 (2)苯的单取代物： 在苯环上有取代基时，复杂的B吸收带一般都简单化，向长波移动，同时吸收强度增加。 烷基取代：由于超共轭作用(hyperconjugation)产生红移，但效应不大。 带弧对电子基团取代：如－NH2、－OH、－OK等由于弧对电子与苯环上的π电子产生n—π共轭使吸收强度增加．产生红移。 与苯环共轭的不饱和基团取代：如－CH＝CH－、－C＝O、－NO2等。由于π—π共轭，产生新的电子轨道，使波长显著红移。 总之、取代苯对光谱红移影响的大小与取代甚的拉电子和推电子的程度有关。表6—7列出一些单取代苯的紫外吸收数据

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47 (3)苯的二取代物： 在二取代苯中，由于取代基的性质和取代位置不同，产生的影响也不同。
①当一个吸电基(如－NO2、－C＝O)及一个供电基(如－OH、－OCH3、－X)互为对位时，由于两代基的效应相反，产生协同作用，使波长显著红移。若两个效应相反的取代基互为间位或邻位时，则二取代苯与各单取代苯的波长区别很小。例如 为280nm， 为 380nm， 为280nm。

48 ②当两个取代基都是吸电基或都是供电基时，由于效应相同，两个基团不能协同，则吸收峰往往不超过单取代基时的波长，且邻、间、对位三个异构体的波长也相近。例如
为260nm， 为258nm， 为255nm， 为255nm。

49 (4)稠环芳香族化合物： 此类化合物由于共轨体系增加，使波长红移，吸收强度增加。 例如萘有三个吸收谱带，E1谱带为220nm，ε＝100000，E2谱带为275nm，ε＝5700，B吸收带为312nm，ε＝250。菲的谱带E1为252nm，ε＝50000，E2＝293nm，ε＝16000，B谱带为330 nm，ε＝250。表6—9列出了一些稠环芳烃的吸收谱带。

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51 (5)杂芳环化合物 ①五元杂芳环化合物：如吡咯、呋喃、噻吩，可看作是环戊二烯的C1被杂原子取代。因此，紫外光谱与环戊二烯相似。一般有两个吸收峰，在200 nm附近有一个峰，属K带，在238nm附近还有一个峰，类似苯环的B带。例如： 200nm，238.5nm nm，252nm 211nm，240nm nm，269.5nm ②六元杂芳环化合物：六元杂芳环化合物的紫外光谱与苯相类似，例吡啶在257nm有吸收峰与苯的B带相似，也有精细结构，而其n→π*跃迁引起的弱峰多被B带覆盖。极性溶剂可使吡啶的B带吸收强度明显增高，这可能是吡啶氮原子上的弧对电子与极性溶剂形成氢键的原故。

52 5．吸收谱带 跃迁类型相同的吸收峰称为吸收谱带又称吸收带。化合物结构不同，跃迁类型不同、因而有不同的吸收带。在前面化合物结构与电子跃迁的关系中已提到各种吸收带。现将吸收带的种类与特点扼要总结如下：
(1)R吸收带：由n→π*跃迁产生的吸收带，它具有杂原子和双键的共轭基团。如， ，－NO2，－N＝C－等。该带的特点是吸收强度很弱，处于长波方向，吸收峰波长一般在270 nm以上。 (2)K吸收带：由共轭的π→π*跃迁产生的吸收带，其特点是吸收峰很强ε＞104。共轭双键增加，波长红移，而且吸收强度增加。K带是共轭分子的特征吸收带，借此可判断化合物中共轭结构。

53 (3)B吸收带：这是芳香族化合物的特征吸收带，由苯的π→π
(3)B吸收带：这是芳香族化合物的特征吸收带，由苯的π→π*跃迁所产生。为一宽峰并出现精细结构。吸收峰在230一270 nm之间，B带的精细结构常用来识别芳香族化合物，但当苯环取代后或用极性溶剂时，精细结构消失。 (4)E吸收带；E带可分为El、E2两个吸收带。二者可分别看成是苯环中的乙烯键和共轭乙烯键所引起的，也属π→π*跃迁。E1带吸收峰在l 84nm左右，在远紫外区不常用。E2带在203nm处有吸收，E2带有些书籍也称它为K带。E2带可因苯环上引入助色基而向红移。当苯环上引入生色基时，吸收峰显著红移，此时E2带就称为K带。

54 五、定 量 分 析 （一）试 样 的 制 备 1．溶剂的选择 可见紫外分光光度测定，通常都是在溶液中进行，因此选择合适的溶剂十分重要。
五、定 量 分 析 （一）试 样 的 制 备 1．溶剂的选择 可见紫外分光光度测定，通常都是在溶液中进行，因此选择合适的溶剂十分重要。 选择溶剂应考虑的原则是：对试样有良好的溶解能力和选择性；在测定波段内溶剂本身无明显吸收；溶剂不得与被测组分发生化学反应；被测组分在溶剂中具有良好的吸收峰形。 对于紫外光谱分析，选择溶剂更为重要，因为极性溶剂对电子跃迁产生的谱带有影响。因此在紫外测定时，在溶解度允许的范围内，应尽量选择极性小的溶剂。分光光度法常用的有机溶剂见表6—10。

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56 2．样品的净化 样品中含有杂质，会直接影响分光光度法的测定结果，因此，测定前必须进行净化。 农药原药和制剂中都含有许多杂质，测定前都必须进行净化处理，常用的方法有薄层层析、液液分配、柱净化等。也可以用水解、氧化还原或调节酸碱性方法等，消除干扰。

57 (二)测量条件的选择 1．波长的选择 应选择被测组分最强吸收带的最大吸收波长(λmax)作为测量波长。因为在λmax处，待测组分每单位浓度的吸光度值变化最大，测量灵敏度较高，而且吸收曲线在最大波长附近较为平坦，可以较好的遵守比尔定律。但是实际工作中，往往由于待测液中含有杂质，为避开杂质的干扰，而选择灵敏度稍低的不受干扰的次强吸收峰或肩峰等进行测量。 2．狭缝宽度的选择 狭缝宽度直接影响测定灵敏度和校正曲线的线性范围。狭缝宽度增大，在一定范围内可使灵敏度下降，校正曲线线性变坏，偏离比尔定律。狭缝也不是越小越好，狭缝太小，入射光强度变弱，也不利于测定。一般应选择不减少吸光度时的最大狭缝宽度为测量宽度。

58 3．吸光度与浓度之间关系的确定 在确定了分析条件之后，必须用一系列标准溶液制作一条标准曲线，标推曲线的浓度范围应接近实际试样的浓度，并在此浓度上下一定范围包括待测样品的浓度范围，通过标准曲线的制作，可以了解遵循比尔定律的浓度范围。 4．空白溶液的选择 空白溶液亦称为参比溶液，在分光光度法测定样品时都需要有空白溶液作为参比。在仪器上将空白溶液的透光率调成100％，以作为测量时的相对标准。 空白溶液除了具有参比作用外，在分光光度测定中，还可以用来抵消某些杂质的干扰．例如所用试剂或溶剂不纯、显色剂本身有颜色、以及无法去除的杂质色泽等，都会影响吸光度的测定，此时可用相应的空白溶液消除其影响。

59 在可见光区进行分光光度测定时，常需选择合适的显色剂将被测组分转变为有色化合物或络合物，然后进行测定。
(三)反 应 条 件 1．显色剂的选择 在可见光区进行分光光度测定时，常需选择合适的显色剂将被测组分转变为有色化合物或络合物，然后进行测定。 选择显色剂的原则是： 显色反应灵敏度高，—般应在100 ppm以内； 显色剂选择性好，对杂质无反应或反应小； 显色稳定性好，生成的有色化合物颜色要稳定，组成要恒定； 符合比尔定律； 受溶液的酸度、温度等因子影响要小等。

60 显色条件包括试剂的浓度、溶液的酸度、显色时间、反应温度、杂质的干扰等。
2．显色条件的选择 显色条件包括试剂的浓度、溶液的酸度、显色时间、反应温度、杂质的干扰等。 (1)试剂的浓度： 显色过程中加入的试剂或显色剂的量，会影响有色化合物的组成，常使颜色发生变化，因此试剂(显色剂)的加入量必须通过实验确定，应做一条吸光度与试剂(显色剂)浓度的变化曲线，在吸光度值恒定的范围内确定试剂(显色剂)的浓度。 (2)溶液的酸度： 显色过程都是在一定的酸度条件下进行的，酸度高低对络合物的形成，颜色的稳定性，水解、沉淀等都有很大影响。显色反应的最佳酸度范围可以通过实验确定，即做一条吸光度与溶液pH值的变化曲线，在吸光度值恒定部分对应的pH值，即为最佳酸度范围。

61 显色反应一般在室温下进行，但个别反应需要在特定的温度下进行，因此，需要根据反应性质选择合适的反应温度。
(3)显色时间： 显色过程中由于显色反应不同，需要的时间也不同，有时颜色不稳定，放置时间过长就会变色或退色，影响测定结果。因此，显色反应后，必须在适当时间内测定吸光度，通过实验确定合适的显色时间。 (4)反应温度： 显色反应一般在室温下进行，但个别反应需要在特定的温度下进行，因此，需要根据反应性质选择合适的反应温度。 (5)杂质的干扰： 试样中的杂质对显色反应会造成很大干扰，必须去除杂质干扰的影响。 去除杂质的方法有：加入掩蔽剂，选择合适的显色条件；选择不受干扰的测定波长，利用空白溶液的抵消或通过薄板、柱层析、离子交换等方法，使被测组分与干扰杂质分离。

62 六、在农药分析中的应用 (一)农药分析的特点 1．测量范围广
大多数农药为芳香族化合物，化合物本身或其衍生物在可见紫外区都有吸收峰。在农药分析上，配合薄层法净化，可用于测定原药及制剂中有效成分含量，也可剧定农药残留量及痕量农药，其灵敏度和准确度可与近代仪器相比美。 2．操作简便快速 可见紫外分光光度计，仪器成本较低，易于掌握．随着近代分光光度计的产生，在测量计算方面通过微机控制，使测定结果既快速又准确， 3．有较好的准确度 一般的浓度测量，相对误差在1％－3％范围内。如用示差分光光度法，误差可以减少到千分之几。 4．既可定量也可用于定性 除可用于大多数农药的定量分析外，还可以作为定性手段，并常和红外光谱、核磁共振相配合，作为定性鉴定的工具。

63 (二)可见比色分析 可见比色分析法就是吸收光谱在可见光范围内的分光光度法。可见光波长范围是由紫色的400nm到红色的760nm。 随着分光光度计的发展，比色测定已由分光光度计代替了旧时的比色计。分光光度计与比色计相比，具有准确、省时、选择性好的优点，现代的分光光度计都具有扫描功能，可以通过吸收曲线，找出被测物质的最佳吸收波段，还可以从吸收曲线上选择合适的条件，以减少杂质的干扰。

64 农药的可见光比色分析有以下几种情况： 农药有效成分本身带有颜色，可以直接进行比色，这种农药数量很少，如敌克松原药为黄棕色，在波长435nm处有最大吸收峰。故可直接进行比色测定。 农药本身无色，经化学反应，引入或生成一个显色基团而变成有颜色的化合物，此过程称为“显色”，大多数农药都需要显色，才能进行测定。 (1)经化学反应可以生成有色化合物，如对硫磷经碱解后形成对硝基酚而呈黄色。五氯酚经氧化形成四氯代苯醌呈黄色。 (2)引入显色基团生成有色化合物：如农药经酸、碱水解产生酚类或芳胺，可与偶氮试剂进行偶合形成有色化合物，偶氮试剂则称为显色剂。

65 1．含氯农药的颜色反应 (1)吡啶—碱显色反应(Fujiwara反应)
含卤素农药在碱性溶液中，与吡啶短时间加热，至少有两个卤原子和一个碳原子成键，产生红色或蓝色。 如DDT与含有呫啐酚的吡啶溶液及氢氧化钾加热生成红色。可在510 nm处测定光密度。 三氯杀螨醇在碱性条件下，水解产生氯仿，氯仿在碱—吡啶作用下生成红色，可在535nm处测光密度。氯丹可以产生紫色(404nm)，毒杀芬可产生黄色(400 nm)，七氯、克菌丹、敌敌畏等都有此反应，反应过程中，含有水或乙醇对颜色形成有干扰。

66 (2)硝化—甲醇钠法；含氯芳香族农药，经硝化后加甲醇钠，形成四硝基衍生物，经分子重排变为醌式，呈蓝色。如对位DDT、对位DDD及三氯杀螨醇形成蓝色(598nm)；DDE，DDA形成红色（420nm），邻位DDT形成紫色(590－511nm)。

67 六六六需加碱水解成l，2，4三氯代苯再经硝化与甲醇钠反应形成6氯2，4二硝基间苯二酚，呈黄色，可在415nm处测定光密度。

68 (3)脱氯磺化显色反应： DDT，甲氧 DDT等在1％乙醇氢氧化钾镕液中，脱掉一分子氯化氢，再与浓硫酸反应，即呈现颜色，DDT为桃红色；甲氧DDT为紫色。 (4)二苯胺—氯化锌显色反应： 狄氏剂、毒杀芬等经与二苯胺、氯化锌混合熔融，而形成蓝绿色化合物，将此化合物用丙酮或冰醋酸溶解，即可进行比色。 (5)浓硫酸与铬变酸显色反应； 卤代苯氧乙酸类与浓硫酸反应产生甲醛，再与铬变酸(1，8二羟萘、3，6二磺酸)加热到150℃出现紫色。

69 2．含磷农药的颜色反应 (1)钼蓝比色法测全磷： 含磷农药用高氯酸及硫酸混合液，消化分解成无机磷，在酸性条件下与钼酸铵及偏钒酸铵反应形成磷钼杂多酸，显黄色，在420 nm处测定光密度。 PO33－＋12MoO42－＋3NH4＋＋24H＋ →[(NH4)3·PO4·12MoO3]＋12H2O 如在钼酸铵中加入1氨基—2萘酚—4磺酸试剂或SnCl2则显蓝色，在735nm处测定光密度，所有有机磷农药均可用此法测定全磷含量。

70 (2) 4－(对硝基苄基)吡啶(NBP)反应：
有机磷农药在乙醇中与4—(对硝基苄基)吡啶在100℃加热12—17min，冷却后加入四乙撑戊胺丙酮液(或吗啉丙酮液)30 min呈蓝色，在580 nm处测定光密度。此法可测定马拉硫磷、乐果、倍硫磷等含硫或不含硫有机磷农药。

71 (3)皂化比色法： 含硝基有机磷化合物，碱解后，产生对硝基苯酚化合物，呈黄色，可在420－480nm波长范围内测光密度。如对硫磷、甲基对硫磷、杀螟松均可用此法测定。 (4)与氯化钯反应： 含硫磷酸酯类在酸性条件下与氯化钯反应形成黄色或褐色螯合物。二硫代磷酸酯形成1∶1螯合物，一硫代形成1∶2螯合物。

72 (5)形成铜盐络合物： 二硫代磷酸酯类，在碱性条件下，水解成二烷基二硫代磷酸，与铜离子在四氯化碳溶液中反应，呈黄绿色，在420 nm下测定光密度。如马拉硫磷、甲拌磷、乙硫磷、亚胺硫磷等均有此反应。但乐果无此反应，因乐果碱解后生成硫代磷酸和硫醇：

73 3．氨基甲酸酯类 氨基甲酸酯类农药经碱解后形成酚类与偶氮试剂反应形成重氮盐而显色。 甲萘威、克百威等经碱解后生成α萘酚，与对硝基苯偶氮氟硼酸的甲醇溶液反应，呈黄色，在590 nm处测光密度或加入对硝基氯化重氮苯在酸性条件下呈黄褐色。

74 速灭威等经碱解后生成苯酚类，在弱酸下与对硝基氯化重氮苯反应呈黄色。如在碱性条件下，则形成亮红色染料可在490 nm处测定光密度。

75 4．其它 (1)酚类的颜色反应：酚类化合物在微碱性溶液中与4－氨替比林及氧化剂的作用下，形成红色，在510－520nm处测光密度。 具有卤素、羧基、甲氧基等取代的酚类均有上述反应，五氯酚常用此法定量。 (2)福美双的颜色反应：福美双在酸性溶液中为 与Cu 2＋定量络合成铜的络合物，在430 nm处测定光密度。

76 (三)紫外光谱定量分析 农药的有效成分在紫外区(200一400nm)大多有特征吸收，一些吸收不明显的农药，也可以通过适当的化学处理转化成有吸收特征的物质，再加以分析。 1．一些农药的紫外光谱 (1)有机氯农药

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78 (2)苯醚类农药

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80 (3)苯酯类农药：

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82 表6－14 一些有机磷酸酯农药的最大吸收波长 名 称 λmax（nm） 硝基苯 260 三对位硝基苯磷酸酯 264 乙基二对位硝基苯磷酸酯 267 对氧磷 268 对硫磷 274 嘧啶 243 二嗪磷 247.5

83 (4)苯胺类农药

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85 (5)均二嗪类农药： 表6－16 一些三嗪类农药的最大吸收波长 名 称 λmax（nm） 莠去通 220 西玛通 朴灭通 西玛津 222
表6－16 一些三嗪类农药的最大吸收波长 名 称 λmax（nm） 莠去通 220 西玛通 朴灭通 西玛津 222 莠去津 朴灭津 223 草达津 228

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87 (6)吡啶类化合物： (7)其它：含唑类及咪唑类农药大多有很好的吸收峰，如三环唑、三唑酮、多菌灵等都可用紫外光谱法进行定量测定。

88 2．测定方法 (1)标准对照法：在同样条件下配制标准溶液及试样溶液，在所选波长处分别测量吸光度，根据吸光度与浓度成正比的关系，用下式求出样品浓度。 式中：A——吸光度；C——浓度。 (2)吸光系数法：用标准品在最大吸收波长处的吸光系数  值为依据，进行定量测定。将标准品分别在已核正过的不同型号分光光度计上进行多次测定，计算出吸光系数 作为标准，然后与样品的实验值比较.

89 (3)标准曲线祛；根据光的吸收定律，当液层厚度及入射光的波长不变，在一定浓度范围内吸光度与溶液的浓度成正比。因此，配制一系列标准溶液、将测得的吸光度A为纵坐标，标准溶液的浓度C为横坐标，可绘制出A—C关系图。如果符合比尔定律，则成为一条直线，称为标准曲线，如图6—15所示。在相同条件下，测量样品溶液的吸光度，可以在标准曲线上查出相应的浓度。

90 (4)最小二乘法：最小二乘法是根据光的吸收定律具有线性函数的特性，A＝ac＋b。配制若干不同浓度的标准溶液，测定出一系列相应的吸光系数，用最小二乘法处理，求出系数a和b，以求其最佳值，这样得到的吸光系数比较可靠。目前带有微机的分光光度计可以通过设置二个或多个浓度的标准溶液，根据最小二乘法校正系统，自动求出校正系数a及b，可以进行准确的定量分析。 (5)示差分光光度法：示差分光光度法是用一个与待测组分浓度相近的标准溶液作参比溶液与未知试样溶液相比较测量其吸光度，再从测得的吸光度值，求出未知浓度。利用示差分光光度法可以使相对误差减小到千分之几，所以又称精密分析法，常应用于微量分析。示差分光光度法对仪器的灵敏度和稳定性要求较高，需用较高级的分光光度计，一般比色计不能测定。