蛋白多肽类药物的 药物代谢动力学.

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1 蛋白多肽类药物的 药物代谢动力学

2 前言 蛋白多肽类药物的药代动力学十分复杂。 这类药物是生物大分子,与传统的化学合成药物小分子在理化性质和体内过程等方面均有显著不同。
该类药物的动力学研究不仅要解决相关理论问题，而且要求发展和应用新技术、新方法和建立新体系。

3 蛋白多肽类药物的体内过程 蛋白多肽类药物的药代动力学特点及其影响因素 生物样品中的分析方法

4 蛋白多肽类药物的 体内过程

5 蛋白多肽类药物的体内过程 蛋白多肽类药物的体内过程相当复杂。
化学结构特殊，其生理活性和体内过程不仅与其一级结构，而且与其二级和三级结构有关。 作用强，用药剂量小。 生物体内存在大量相似物质的干扰 在体内经受广泛的蛋白降解作用 血液中存在多种不同类型的结合蛋白，如抗体、受体、受体拮抗剂等

6 蛋白多肽类药物的吸收和生物利用度 蛋白多肽类药物的吸收呈现明显的给药途径依赖性。 口服 皮下 鼻腔给药 透皮吸收 其他途径

7 （一）口服 绝大多数这类药物不能采用口服途径给药。
多数口服生物利用度很差，通常仅为2～3%，以致绝大多数蛋白多肽类药物口服后不能产生足够的有效血药浓度。 吸收屏障：很难通过胃肠道吸收。 该类药物分子量大，极性较强，具有较低的分配系数和扩散性能，使其不易为亲脂性生物膜摄取。 酸屏障：易被胃酸分解破坏。 该类药物对胃液的强酸性（pH1～2）敏感 酶屏障：蛋白分子产生消化降解作用。 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及弹性蛋白酶、胃蛋白酶 绝大多数这类药物不能采用口服途径给药。

8 仅极少数肽类可供口服给药，如环孢素 由于其独特的分子结构（环状十一肽）使其成为高度脂溶性并对酶相对稳定，通常制成油溶液供口服用
即使如此，其口服生物利用度也较差，且可变（从2%至92%） 多种生理因素可影响其胃肠吸收。

9 （二）皮下注射 该类药物皮下注射给药可避免首关效应，吸收明显好于口服给药
但由于蛋白酶的普遍存在，这类药物也可部分受到皮下注射组织存在的蛋白酶的代谢破坏，致其生物利用度亦不理想。 重组细胞因子皮下注射通常生物利用度低于70%。

10 （三）鼻腔给药 鼻吸收远大于口服途径： 这些肽类包括 鼻黏膜上皮存在众多微绒毛而具有较大的表面积 鼻黏膜具有广泛的血管网 同时给予吸收促进剂
黄体激素-释放激素（LH-RH） 丙氨酸-赖氨酸-促肾上腺皮质激素（Ala-Lys-ACTH） 胆囊收缩素八肽 -硫代苯基青霉素以及头孢菌素类等 较大的肽或蛋白也可吸收 胰岛素在大鼠的鼻吸收达30%，且吸收迅速

11 经鼻给药避免了肝脏的首关效应，但粘膜的酶屏障产生了一种拟首关效应。
拟首关效应（pseudo-first pass effect）：鼻上皮的嗅觉区内的细胞色素P450活性甚至高于肝脏，主要由于NADPH-细胞色素P450还原酶含量较高（约高3-4倍），已发现在鼻黏膜中也存在肝脏中的三类可诱导的细胞色素P450同工酶，在鼻上皮中也发现第Ⅱ相结合反应活性。 鼻腔给予的多肽类药物的生物利用度与其分子量显著相关 对于分子量小于10kDa的分子：不需加入生物黏附剂和促进剂，常可产生足够量的药物进入体循环，生物利用度在1-10%左右。 较大分子：如干扰素，人生长激素等即使使用生物黏附性给药系统，其较大的分子亦阻碍药物的有效吸收。

12 鼻黏膜中主要酶类： 氨基肽酶；肽链端解酶；肽链内切酶。 肽类药物的吸收能够通过应用酶抑制剂而改善
某些表面活性剂如胆盐、羟乙酸钠可使蛋白变性而抑制蛋白水解酶，从而增加蛋白多肽药物的吸收。 例如表面活性剂羟乙酸钠与CRH同用，F达到100%。

13 鼻腔途径目前已成为肽类药物静脉外给药的颇受重视的重要给药途径，不少这类药物已制成喷鼻剂或滴鼻剂用于临床实践。
最早被采用的肽类药物为垂体激素，如催产素、加压素及其类似物，其中去氨加压素由于鼻腔吸收良好，不良反应少，已成为尿崩症治疗的首选给药方法。 醋酸布舍瑞林(LH-RH类似物)已有鼻内喷雾剂商品，其鼻腔给药是仅次于注射的有效给药方式。 胰岛素 鼻用制剂已在美国有商品出售。

14 某些蛋白多肽类药物经鼻给药的吸收情况 药物 相对F 峰时间（h） AA残基数目 实验对象 胰岛素 10~30 5~10 51 大鼠、犬、人
GH释放因子 2~20 20~40 40~44 胰高血糖素 70~90 29 人 LHRH激动剂和拮抗剂 2~5 9~10 猴、人 加压素类 6~12 10~20 9 催产素 30~40 脑啡肽类 5 大鼠、人 促甲状腺释放激素 5~15 3

15 (四)透皮吸收 透皮吸收已成为令人注目的给药途径 可避免肠道和肝脏对药物的首关效应， 可提供较好的传输控制和维持药物治疗水平于较长时间。
通常认为皮肤的蛋白水解酶活性较低. 影响蛋白多肽类药物透皮吸收因素主要来自吸收屏障: 较大的分子量，荷电性使这类药物很难通过被动转运吸收为克服这种屏障作用，通常采用离子电渗疗法 增强肽类药物的透皮吸收:透皮吸收促进剂、pH调节、蛋白水解酶抑制剂。

16 (五)其他途径 阴道内给予 肺内给予 直肠给予

17 蛋白多肽类药物的 体内代谢

18 蛋白多肽类药物的体内代谢 最重要的影响因素是它们给药后在体内经受广泛的酶介导的代谢分解，通常导致生物活性的丧失。
肝脏、肠道以及其他器官组织均存在大量代谢蛋白多肽的酶，就其反应类型可涉及第I相和第II相代谢反应。 静脉注射给药时这类药物的代谢失活主要发生在肝脏，当口服给药时则主要发生在肠道，造成显著的首关消除。 细胞色素P450与蛋白多肽类药物的代谢关系密切，如环孢素（环状十一肽）的代谢是细胞色素P450 3A4介导的。 酶抑制剂红霉素、维拉帕米、尼卡地平、酮康唑及依曲康唑可使环孢素血浓度升高， 酶诱导剂如利福平、苯妥英以及苯巴比妥能够降低环孢素的血药浓度。

19 （一）肝脏对蛋白多肽类药物的代谢 肝脏对链长小于8个氨基酸的小肽具有高度的摄取
这种摄取呈现结构特异性，被摄取的多肽可以完整形式或代谢物形式排入胆汁中 肝脏对多肽的摄取机制涉及以下两个过程： 被动转运: 疏水性肽类 主动转运过程: 低疏水性肽类 内吞：多数水溶性的不能通过特异机制清除的肽类 载体介导：受体介导的内吞继以溶酶体的分解作用适用于解释多种药物的肝脏代谢这些药物有神经生长因子，绒毛膜促性腺激素、催乳素、促甲状腺释放激素、TGF、上皮生长因子等。

20 （二）胃肠道对蛋白多肽类药物的代谢 胃肠道内存在大量代谢蛋白多肽的酶，可分为以下三种类型。 胃肠道腔内酶： 黏膜细胞酶： 刷状缘胞液酶：
这类酶参与蛋白质的消化 黏膜细胞酶： 主要指与刷状缘膜结合的酶类。刷状缘膜构成了肠道上皮细胞的腔面，富含有多种酶和转运蛋白，参与各种蛋白类在细胞表面的代谢转化和吸收。 氨基肽酶是肠刷状缘膜中最丰富的酶。 呈种属及底物依赖性 总的说来，其对肽类的药物水解速率遵循下列顺序：二肽＞三肽＞大分子肽。 刷状缘胞液酶： 胞液酶优先水解二肽，对二肽的水解能力超过对三肽和大分子肽。

21 （三）肾脏对蛋白多肽的代谢 肾脏是最重要的蛋白分解代谢的器官之一，特别是分子量低于60kDa的蛋白。
通常血循环中的肽类和蛋白能够自由地通过肾小球滤过 肽类可在刷状缘膜水解，其水解产物，游离氨基酸及短链多肽通常不经溶酶体的分解而通过近曲小管进入血液 当这些多肽分子量接近3-5kD或更大时，则往往在近曲小管的刷状缘膜被内吞（而不是水解）并随后被溶酶体消化，生成的游离氨基酸和短链多肽返回血液循环中。

22 (四)其他器官组织对蛋白多肽的代谢 由于蛋白水解酶的普遍存在性，蛋白多肽药物在体内的代谢部位极其广泛。
在肝、肾和肠道以外的组织也都存在各种水解蛋白多肽的酶，即使在一般认为蛋白水解酶活性较低的皮肤，也发现降解肽类的酶屏障。

23 蛋白多肽类的化学结构和化学修饰对其体内过程的影响

24 （一）糖蛋白分子中糖基的作用 大量细胞因子在化学结构上属于糖蛋白。糖基在糖蛋白的体内血浆时程的调节中起着重要的作用。
典型的药物为红细胞生成素（EPO）为含唾液酸的糖蛋白激素，分子中约40%为糖类。 糖基是EPO体内活性所必需，在体内外活性表达中十分重要。 不含唾液酸的EPO在体内无活性，这种活性的丧失可通过脱唾液酸EPO从血循环的快速清除加以解释。该蛋白脱去唾液酸后暴露出半乳糖残基，后者能为肝细胞表面存在的半乳糖受体识别，从而促进了EPO被肝细胞半乳糖结合受体的结合和内吞，继被溶酶体消化。

25 （二）氨基酸残基对寡肽的肝清除的影响 肽类分子中氨基酸残基对肽类的肝清除速率有显著影响。
随着丙氨酸数目的每一增加即伴有肽消失速率的显著增加； 相反，随着甘氨酸残基数目的每一增加，肽的消失速率显著减少。

26 （三）蛋白多肽一级结构的PEST假设 Roger等通过文献资料的总结发现，那些在真核细胞内快速分解的蛋白质分子结构通常含有共同的氨基酸序列，此即所谓PEST假设。 该假设认为细胞内半衰期短于2小时的蛋白质的氨基酸序列具有一个或一个以上富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、丝氨酸（S）和苏氨酸（T）的区域。 这些富含PEST的区域的两侧通常（但不总是）有数个带正电荷的氨基酸组。 所有的PEST区域的共同点是局部高度集中的P、E、S或T，而天冬氨酸较少。 PEST序列能够赋予蛋白多肽的快速分解，确切机制尚未明确。 PEST区给予蛋白一种快速降解的易感性，从而更易发生胞内蛋白水解。

27 （四）体内蛋白的化学修饰 1. 体内蛋白化学修饰的含义：
通常认为，少许的化学修饰是导致蛋白水解的首要过程。体内蛋白的化学修饰促进了蛋白的水解，即经修饰的蛋白的降解速率大于相应的未修饰的即天然的蛋白质 已知至少有9种这样的化学修饰，又称“标示步骤”（marking step），能够易化蛋白的水解，这些包括： 丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化 半胱氨酸残基的混合二硫化物衍生物的形成 赖氨酸残基氨甲酰化、 非血红素铁硫中心的氧化、 赖氨酸的-氨基与泛素的结合 甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亚砜和甲硫氨酸砜 谷氨酰胺和天冬酰胺残基的脱酰胺基 糖基化 细胞色素P450酶系统对氨基酸的氧化。 在以上化学修饰中引人注目的是细胞色素P450酶系统

28 2. 化学修饰加速蛋白水解的机制 3.蛋白氧化与蛋白多肽药物代谢之间的关系
化学修饰改变蛋白降解速率是通过调节平衡时伸展型蛋白的浓度而实现的。 天然的蛋白往往以折叠型存在，在天然状态和伸展状态之间的相互转化十分快速。 化学修饰可使这种平衡移向伸展型，从而使伸展型浓度较高。 整个降解速率受平衡时伸展型浓度的控制。 3.蛋白氧化与蛋白多肽药物代谢之间的关系 混合功能氧化酶（MFO）催化的蛋白氧化是蛋白降解的一个信号，蛋白的更新将受那些能够影响MFO活性的因素的影响。 某些食物以及药物的摄入能够影响蛋白的降解，能够诱导P450系统的药物，如巴比妥类就可能导致蛋白降解增加。

29 蛋白多肽类药物的 药物代谢动力学特点

30 一、蛋白多肽类药物的药物代谢动力学特点 显著的首关效应： 消除半衰期短： 表观分布容积通常较小： 非线性动力学性质：
故绝大部分蛋白多肽类采用胃肠外给药途径，特别是静脉注射给药 消除半衰期短： 这类药物体内迅速降解，这种短半衰期迫使它们在临床应用时不得不采用静脉滴注或多次频繁给药，以维持恒定的有效血药水平。 表观分布容积通常较小： 这类药物通常水溶性较强，亲脂性较差，不易透过细胞膜和生理屏障，故多数药物的表观分布容积相当于细胞外液体积。 非线性动力学性质： 蛋白多肽类药物的吸收、结合和消除均可能涉及非线性饱和动力学

31 二、蛋白多肽类药物药动学的影响因素 （一）结合蛋白的影响：
蛋白结合是小分子外源性化学药物的非特异性结合现象，对蛋白多肽类药物而言，这一结合现象多为特异性蛋白引起的。 这些结合蛋白往往是生理学上具有活性的蛋白多肽类物质的转运者、激活物以及调节剂。它们可在细胞水平调节治疗性蛋白多肽药物的效能，可影响这类药物的体内过程和药动学行为，特别是可影响治疗性蛋白多肽的体内清除并干扰其体液分析。 在某些情况下，结合蛋白作为一种储存库使其体内存留时间延长，相反，结合蛋白也可成为其清除机制而加速这类药物自机体的清除。

32 （二）种属特异性： （三）给药方案依赖性药物作用：
和小分子化合物不同，蛋白多肽具有结构和活性种属特异性，特别是氨基酸序列，对于相同的实体在不同种属之间有所不同，这就有可能使得一种活性蛋白在不同种属试验时变得无活性，且成为一种异物而导致免疫原反应。 （三）给药方案依赖性药物作用： 蛋白治疗药物的给药方案可影响该类药物的药效动力学，特别是蛋白激素类，这些激素生理情况下的分泌具有生理节律性，外源性蛋白治疗药不同给药速率和方式可产生不同的作用。 促性腺激素释放激素： 连续给药导致促性腺激素分泌抑制，脉冲式给药则能最有效的促进性腺激素的释放。

33 （四）蛋白的免疫原性 可诱发机体产生抗体，抗体的存在能够失活（中和）蛋白药物的生物活性，影响蛋白药物的体内分布，代谢和排泄，甚至或可能引起继发性不良反应和疾病，从而使得临床前和临床研究的结果变得难以解释。 抗体除可中和蛋白药物的生物活性外，还可通过影响其药代动力学而进一步影响蛋白的效能，这种影响表现为增加或减少抗原-抗体复合物的清除，如果生成的抗原-抗体复合物较未结合药物本身清除更快，则蛋白药物可因这种结合而失活，不论这种抗体是中和性的还是非中和性的。 （五）内源性干扰 内源性成分对外源性蛋白的药代动力学产生干扰，因而在阐明外源性给予的蛋白药物的确切药代动力学时，内源性物质的影响必须予以控制。 如通过静脉滴注葡萄糖和生长激素抑制素以抑制胰岛素和生长激素的内源性释放，从而使得有可能对外源性胰岛素和生长激素的药代动力学作出确切解释。 外源性给予的是药理剂量，而非生理剂量，药理剂量的蛋白质能改变蛋白质的体内过程，因机体会将药理剂量视为生成过度而作出调节反应。 机体暴露于高浓度的蛋白药物可能导致不可预测的不良反应。

34 （六）给药系统： 1. 缓释注射给药系统： 埋植剂和微球注射剂两种，其中以微球注射剂最为引人注目。在诸多多肽缓释注射剂中研究得最为成功的品种为黄体生成素释放激素（LHRH）及其类似物 纳米粒给药系统：近年快速发展的纳米粒给药系统在蛋白多肽类药物的体内传输中有着极广阔的应用前景，可有效延长这类药物的体内释放，避免酶的降解，提高生物利用度。 2. 口服给药系统： 加入蛋白酶抑制剂，吸收促进剂和稳定剂以克服口服吸收中遇到的屏障作用； 肠溶包衣技术； 微囊、微球技术及微乳技术； 部位特异性结肠给药技术； 其他特殊技术，如人体红细胞载体，具受体介导吞饮机制的蛋白结合物等。 3. 其他非注射给药系统： 鼻黏膜给药备受关注 气雾剂喷雾 直肠给予 阴道黏膜给予

35 4. 蛋白多肽的化学修饰 改善蛋白多肽类药代动力学性质的一个主要手段是对这类药物分子进行化学修饰，主要将蛋白多肽与生物可降解的高分子可溶性载体（聚合物）结合形成蛋白质-聚合物共轭体，常用的载体（聚合物）为右旋糖酐、白蛋白、聚乙二醇（PEG），以PEG应用最为广泛。 PEG具有良好的水溶性，用适当方法活化后可与各类蛋白偶联，PEG无毒，具有良好的生物相容性，从而使其成为最广泛使用的蛋白化学修饰剂。 PEG与蛋白多肽以共价键形成的轭合物的性质较未修饰的原蛋白多肽很大改善，表现为 溶解度增高 分子量加大 稳定性增强 药物血循环中存留时间延长，生物半衰期延长 生物利用度提高 免疫原性和过敏反应降低甚至消失，而活性基本不变。

36 5. 前体药物的应用： 将蛋白多肽药物制成抗酶前体药物以及亲脂性更强的前体药物，有利于抵抗蛋白酶的降解破坏以及增加亲脂性而提高生物利用度。 6. 脂质体： 作为药物载体的脂质体受到广泛重视，如IL-2，IFN，天门冬酰胺酶被包埋在脂质体内都表现出较长的半衰期，释放延缓，药效提高的特点，脂质体不仅能保护被包埋的蛋白多肽药物，延长半衰期，还可提高其靶向性，并能促进蛋白多肽类药物的透皮吸收。 胰岛素与脂质体结合或混合后均有抗胃蛋白酶、胰蛋白酶和α糜蛋白酶降解作用

37 生物样品中蛋白多肽类药物的 分析方法

38 生物样品中蛋白多肽类药物的分析方法 和传统药物比较，蛋白多肽类药物的检测面临相当大的难度
这类药物多为生理活性物质，化学结构特殊，稳定性差，体内处置十分复杂。 生物体内存在大量干扰物质。 故要求检测方法应高度特异。 该类药物生理活性强，用药剂量很小，通常为微克级水平，致体液中药物浓度极低，故要求检测方法必须具有极高的灵敏度。 由于存在以上困难，致使通常采用的方法如HPLC、GC不适用。目前尚无一种完全满足蛋白多肽药代动力学研究要求的分析方法。

39 一.生物检定法 定义： 该法是利用在体和体外组织或细胞对被测活性蛋白多肽类药物的某种特异反应，通过剂量（或浓度）-效应曲线对目标蛋白多肽进行定量测定的一种分析方法。 这类测定方法又分为 离体组织（细胞）培养技术：以细胞增殖、分化或细胞毒性为基础，以细胞数目的增减为量效指标。随着分子生物学的发展，许多依赖性细胞株被建立，从而增强了特异性和灵敏度。 非细胞培养方法（蛋白多肽的特异生物学反应）：如水蛭素的药动学研究可利用其抗凝活性进行，如凝血酶时间测定法、生色底物法和蝰蛇毒测定法等；纤溶酶原激活物利用其溶栓作用采用纤维蛋白平板法测定。 离体组织进行分析：如催产素采用离体子宫法； 在体分析法：如胰岛素的小鼠血糖法等。

40 优点： 测定药物的生物活性 缺点： 缺乏特异性，不能定量失去活性的代谢产物，不能区分内源性和外源性细胞因子
灵敏度差，为起动生物过程，细胞因子的浓度必须在阈水平以上，低于阈水平的样品将不能被定量，从而降低了方法的灵敏度； 耗时，为完成分析需时间较长，往往达数日或数周； 不同实验室的结果有很大差异性，致不同单位之间的比较难以进行，这种差异性可能来自细胞传代的差异或细胞对某种生物学作用产生的获得抵抗性。

41 二、免疫测定法 定义： 利用直接针对被分析蛋白质、多肽上的不同抗原决定簇部位的单克隆抗体或多克隆抗体特异地识别被分析的目标蛋白质，再以放射计数、比色等方法予以定量。该法系将抗原抗体反应配以灵敏检测的方法。 常用方法： 放射免疫测定法(RIA) 免疫放射定量法(IRMA) 酶联免疫吸附测定法(ELISA)

42 + 底物 固相Ab 标本（含Ag） Ag-Ab复合物 酶标Ab Ab-Ag-Ab-酶复合物 图8-1 双抗体夹心ELISA法示意图 + 显色

43 目前ELISA法已成为一种“备选方法”而被广泛用于蛋白多肽类药物的药物动力学研究，这是由于该法具有以下优点：
高度的灵敏度:由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫学反应的结果。 较高的特异性:由于应用抗原抗体反应故和生物检定法相比特异性较高。 易于操作、快速、不使用同位素、无辐射源，适用于批处理。 试剂使用寿命长。

44 免疫测定法存在以下缺点： 该法测定的是待测蛋白多肽的免疫活性而非生物活性。 该法不能对蛋白多肽作出阳性鉴定，如确切的生化组成和序列。 易受多方面因素的干扰： 一种形式的干扰来自代谢产物。 另一种干扰来自抗体的形成。 结合蛋白的存在: 对于低亲和力结合蛋白的干扰可用稀释法加以克服，但样品的稀释可降低检测的灵敏度；稀释法不能克服 高亲和力结合蛋白的干扰，可能需要采用抽提的方法以排除这些干扰。 还受基质特异的影响: 生物体液以及缓冲液的不同往往能够改变蛋白的反应性，某些可通过向血清样品中加入免疫球蛋白予以处理，检测标准曲线必须用相关的生物体液加以建立。

45 三、放射性核素标记示踪法 具有极高的灵敏度，尤其适用于药物组织分布的研究； 但是不适用于人体药物代谢动力学的研究以及特异性差。

46 四、理化分析技术 （一）色谱法 （二）毛细管电泳 （三）质谱法 高度的特异性 精确定量并能同时测定多种成分
分辨率高，分析时间短，样品用量少，操作简单 （三）质谱法 LC-MS; LC-MS-MS