PCR技术介绍 Introduction to PCR Technology

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1 PCR技术介绍 Introduction to PCR Technology
济南艾迪康医学检验中心有限公司 PCR实验室 杨超

2 主要内容 一. DNA结构和复制 二. PCR 1. PCR发展简史 2. PCR基本概念 3. PCR原理 三. 荧光定量PCR检测HBV
四.基因芯片技术平台 ——HPV23亚型检测技术

3 DNA结构和复制 ——DNA结构

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5 H O- O O—CH2 T O=P— 3′ 5′ OH C 碱基 A：腺嘌呤 G：鸟嘌呤 C：胞嘧啶 T：胸腺嘧啶 核糖 磷酸

6 DNA结构和复制 ——细胞内DNA复制

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8 1.DNA双链的打开 2.引物酶合成RNA引物

9 3.DNA聚合酶 延长子链

10 聚合酶链反应的发明 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）
基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖

11 PCR ——基本概念 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。

12 PCR 基本原理 基本组成： 模 板 底 物 DNA聚合酶 引 物 缓冲液 Mg2+ 基本过程： 变 性 退 火（复性） 延伸

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14 模板DNA

15 72℃ 95℃ 55℃ Taq酶 引物2 引物1 Taq酶

16 第1轮结束 第2轮开始

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18 DNA模板 DNA引物 TaqDNA聚合酶 dNTP 缓冲液 Mg2+

19 MJ Research, Inc. PTC-100 PTC-150 PTC-200 PTC-220 PTC-225

20 ABS, Inc. PE-2400 PE-2700 PE-9600 PE-9700

21 循环参数 循环参数是指PCR循环中每一步骤的温度、时间以及循环次数 1．变性温度和时间 2. 退火温度和时间 3. 延伸温度和时间
4. 循环数

22 PCR反应基本过程 1 2 3 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 高温变性 低温退火 适温延伸
重复1~3步 25~30轮 形成2条单链 DNA变性 目的DNA片段 扩增100万倍以上 子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性 DNA双螺旋

23 平台期效应

24 荧光定量PCR (Real-time PCR)
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

25 荧光定量PCR标记技术 1. TaqMan探针技术 2. LightCycler 双探针技术 3. 其他

26 TaqMan探针技术

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28 LightCycler 双探针技术

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30 标本的采集 荧 光 定 量 P C R 工 作 流 程 标本的运送 标本的处理 基因扩增 扩增产物分析

31 标本的采集 标本采集时间对扩增检测结果的影响 标本采集部位的准备 标本采集的类型和采集量 采样质量的评价 采样及运输容器 标本采集中的防污染

32 标本采集时间对扩增检测结果的影响 在疾病发展过程中，标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果

33 标本采集部位的准备 标本采集部位的清洁消毒可去掉污染的微生物或其他杂物，但应适度，过度的清洁消毒有可能会去掉或破坏靶微生物，故标本采集部位的准备应由训练有素的人员进行。

34 标本采集的类型和采集量 标本的类型和采集量应根据所测病原体而定 HBV 血清或EDTA抗凝血浆200ul TB 痰液 HPV CT
宫颈或尿道分泌物

35 采样质量的评价 主要观察有无溶血，脂浊，异物等现象

36 采样及运输容器 标本的采集材料如棉签、注射器应为一次性使用 运输容器亦应为密闭的一次性装置
采集标本所用的防腐剂、抗凝剂及相关材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰 严禁使用肝素抗凝

37 标本采集中的防污染 标本采集最好用一次性材料，不用处理便可直接使用 采集中要特别注意污染，防止混入操作者的头发、表皮细胞、痰液等
如使用玻璃器皿，必须经250°C干烤4小时或用DEPC水处理，以使可能存在RNAase失活

38 标本的稳定化处理 用于DNA检测的标本，采集后一般不需要特殊的稳定化处理，但标本应及时送至实验室
用于RNA检测的标本，由于RNA易受RNA酶的降解，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按1:4的比例加至含有5mol/L GITC（异硫氰酸胍盐）的试管中，从而使血清(浆)中的RNA酶不可逆失活。经上述稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可运送。

39 标本的运输 标本采集后必须尽快送至实验室 经过适当稳定化处理的标本可在常温下运送（如 用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及用于
RNA 扩增检测的经GITC稳定化处理的标本）通 常在运送时应采用不易破碎的容器装载标本 用于RNA检测的标本，如果未经稳定化处理，则 必须速冻后，放在干冰中运送

40 标本的保存 临床体液标本如血清/血浆等可于-70℃下长时间贮存 用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10mmol/L Tris，
1 mmol/L EDTA缓冲液(pH )中4℃保存 用于RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80℃ 或液氮中贮存；用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20℃ 即可；用GITC处理的RNA标本在室温可保存7天

41 实验室分区管理平面图

42 试剂准备区（Ⅰ 区） 使用所有试剂都已经准备好备用的商品试剂盒 时还需要试剂准备区吗？ 试剂准备区的仪器设备主要有冰箱、超净台、
加样器、混匀器和离心机等。仪器除了要专用 外，还应有定期校准。 试剂的分装应在超净台中进行。

43 标本处理区（Ⅱ 区） 标本处理区内的生物安全柜、加样器、离心机、 恒温金属 浴、混匀器等设备都应使用次氯酸钠溶 液消毒，然后用蒸
标本处理区（Ⅱ 区） 标本处理区内的生物安全柜、加样器、离心机、 恒温金属 浴、混匀器等设备都应使用次氯酸钠溶 液消毒，然后用蒸 馏水或70%乙醇洗涤去除残留的次氯酸钠 标本处理需在生物安全柜内进行，防止标本气溶胶的扩散 在标本处理的全过程中都应戴一次性手套，并经常更换， 以避免因手套的污染导致的标本间的交叉污染 实验时所用的加样器吸头都必须带有滤塞，以防止气溶胶 对加样器的污染

44 基因扩增检测区（Ⅲ 区） 空白对照 阴性对照 弱阳性对照 标准品（四种不同浓度） 质控品 待测样本

45 结果分析

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50 结果判断(HBV) 检测样本中1.0× 103copies/ml≤ HBV DNA ≤4.2 × 109copies/ml，测定结果有效，可直接报告拷贝数。 2. 检测样本中HBVDNA> 4.2 × 109copies/ml，既直接报告为> 4.2 × 109copies/ml。 样本检测结果< 1.0 × 103copies/ml，拷贝数仅供参考，报告为< 1.0 × copies/ml 报告模式： 6.666E+06＝6.666 ×106 copies/ml

51 荧光定量PCR的应用 1. 传染性疾病：了解病原体对人体的感染情况，判断病 情或对某一种药物的疗效进行评估
2. 肿瘤研究：通过对癌基因或抑癌基因mRNA的表达数 量进行检测，来判断肿瘤的发病情况，还可以通过查 找基因的表达差异，推断发病机理 3. 其他（遗传病、环境监测、SNP分析等）

52 HBV DNA

53 乙型肝炎病毒

54 HBV DNA定量检测的意义 判断肝病的病情、预后和传染性 预测抗病毒治疗的效果 监测和评价抗病毒药物的疗效

55 判断肝病的病情、预后和传染性 对于持续性感染的病毒性肝炎，病毒血症水平的消长与肝脏损害情况和预后相关。
随着病毒感染后肝脏病理损害的进展，病毒核酸逐渐在宿主血液中积蓄，直到发展为肝病晚期时，病毒血症也达到了最高水平，故如果病毒核酸水平升高表示病恶化，预后不良；水平降低说明向好的方向发展。 血中HBV核酸定量水平的高低，也是衡量传染性强弱的最直接量化指标。

56 预测抗病毒治疗的效果 血中病毒水平，对抗病毒药物的治疗效果，有预报的作用。 病毒水平降低，治疗效果好； 病毒水平升高，治疗效果差。

57 监测和评价抗病毒药物的疗效 应用抗病毒药物（如干扰素、拉米呋啶等）治疗前和治疗过程中，应定量检测血中病毒水平，以判断病人对药物的应答情况，修正治疗方案和评价疗效。

58 YMDD突变株 YMDD: 酪氨酸蛋氨酸天门冬氨酸天门冬氨酸 YIDD 突变：蛋氨酸 亮氨酸 YVDD突变：蛋氨酸 缬氨酸

59 基 因 芯 片 技 术 平 台

60 DNA芯片技术 以玻璃、硅片作为载体 以膜片作为载体 PCR技术 荧光定量PCR PCR

61 基因芯片的基本构造 外观 剖面图 平面局部放大 DNA芯片的组成： 1: 支持物：如玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜
探针 支持物 外观 剖面图 平面局部放大 DNA芯片的组成： 1: 支持物：如玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜 2: 探针：高密度的探针序列按照一定的次序固定在支持物上，每个位点的序列是已知的

62 基因芯片原理 采集标本 提取基因组 DNA/RNA PCR/RT-PCR 扩增 探针杂交 显色/扫描 电泳检测 玻璃片 膜 片 电泳图

63 DNA样品的获取和目的片段的PCR扩增 扩增区域 PCR扩增和目的片段的标记 Biotin Primer up Primer down

64 人乳头瘤病毒分型基因检测芯片

65 人乳头瘤病毒（Human Papillomaviruses, HPV）
双链DNA无包膜病毒 环状DNA，约8Kb 病毒颗粒直径为50～55nm。 依靠宿主细胞进行复制、转录和翻译。 广泛分布在高等脊椎动物 有很高的种属特异性 定向感染皮肤及粘膜的复层鳞状上皮

66 型别与分布 依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低可分
已发现100多种不同的亚型，其中超过40种可以感染人类的生殖器官，约30种与肿瘤有关。 依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低可分 1）低危型：宫颈上皮内低度病变，引起外生殖器湿疣等良性性病（HPV 6、11、42等） 2）高危型：宫颈上皮内高度病变，与宫颈癌的发生有关（HPV 16、 18、31、33、35、39 、45、51、52、53、56、58、59、66及 68等） 某些亚型有地理位置的差异

67 HPV与宫颈癌 宫颈癌的病因学研究进展 ： 早在十九世纪四十年代，一位意大利医生Regoni Stern最早提出结婚与否与宫颈癌的发生可能有关。 1977年Laverty在电镜中观察到宫颈癌活检组织中存在人乳头状瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）颗粒。 至89年左右，约翰.霍普金斯大学教授Keerti Shah证实子宫颈癌与HPV感染有直接关系。 1995年世界卫生组织国际癌症研究所（IARC）专题讨论会认为：HPV感染是宫颈癌发生的主要病因。

68 HPV与宫颈癌 目前已经确定高危型HPV的持续性感染是宫颈癌患病的关键病因 HPV与宫颈癌的发生有95%以上的相关性
宫颈病变CIN3组织切片中HPV的检出率为99.7％

69 HPV的致癌机理 HPV E6蛋白间接抑制p53活性 HPV E7蛋白与RB蛋白结合，RB蛋白不能抑制 E2F的转录而使细胞分裂增殖
HPV16-E5通过作用CDK抑制剂p27调节表皮生长因子受体信号转导途径

70 理想的宫颈癌的筛查方案 HPV检测（－） ＋ 细胞学检查（－） ↓
5—8年复查 HPV检测（＋） ＋ 细胞学检查（＋） HPV检测（－） ＋ 细胞学检查（＋） ↓ ↓ 阴道镜检查 每年复查 ↓ ↑ 组织学检查 HPV检测（＋） ＋ 细胞学检查（－）

71 人乳头瘤病毒分型基因快速诊断试剂盒 特点 技术先进性 快速诊断HPV的感染，并鉴定HPV亚型 可用于临床诊断和女性常规体检
应用PCR技术和膜杂交技术可同时检测18种高危型和 5种低危型HPV 目前国内同类产品中分析检测通量最大

72 HPV33、35 HPV16、43

73 HPV分型检测基因芯片设计原理 HPV16、43 变异区 Primer up 保守区 Primer down HPV18 HPV16

74 子宫颈癌与人乳头瘤病毒（HPV）的研究进展

75 一、宫颈癌的概述及其病因学研究进展 二、HPV的生物学研究 三、宫颈癌的筛查

76 宫颈癌－－最常见的妇科恶性肿瘤 据世界范围内统计，每年大约有50万左右的宫颈癌新发病例，占所有癌症新发病例的5%，其中80%的病例发生在发展中国家。我国每年宫颈癌新发病例约13.15万，占世界宫颈癌新发病例总数的28.8% ，发病率仅次于乳腺癌位居第二。 随着筛查制度的建立，世界宫颈癌的发病率和死亡率已经大幅下降。我国由70年代的10.28/10万下降到90年代的3.25/10万，但在高发病区，死亡率仍高居不下。 地区 死亡率 (/10万） 世界 8.00 中国 3.25 北京 2.54 上海 3.8 山西阳城 36.00

77 患病年龄更趋于年轻化（发病年龄提前到45岁），发病史缩短。如吉林省在80年代统计宫颈癌
患者中小于35岁的妇女占4.8％，而2000年已经占到34.1％

78 子宫颈癌的危险因素： 行为危险因素：如性生活过早、多个性伴侣、多孕多产、营养不良等； 生物学因素：如细菌、病毒和衣原体等各种微生物的感染。
目前仅有少量研究表明宫颈癌可能存在着家族聚集现象。

79 型别与分布 型别：已发现100多种不同的亚型（如果DNA序列同源性小于90％，则定为新的亚型）。其中超过35种可以感染人类的生殖器官，约30种与肿瘤有关。11－37％的女性一生中会感染至少一次HPV。 1）低危型：宫颈上皮内低度病变，引起外生殖器湿疣等良性性病（HPV 6、11、42、43、44） ； 2）高危型： 宫颈上皮内高度病变，与宫颈癌的发生有关（HPV 16、 18、 31、 33、35、 39 、45、 51、 52、 53、56、 58、59、 66、68、73、83及MM4）； 3）中间型：不确定型。 分布：有些亚型和地区、宫颈癌的病理类型有关。 HPV45在非洲西部很常见，HPV39和59在美洲中部和南部常见，HPV52，58在中国常见。 在宫颈鳞状上皮细胞癌中以HPV16（占51％），在腺癌和腺鳞癌中HPV18分别占56％和39％。

80 表 HPV型别与宫颈病变 常见HPV型别 宫颈病变 6，11 湿疣，CIN I 16 CIN, 18 CIN 30，40，58，69
31，33，35，39 45，51，52，56 CIN I 42，43，44 53 正常宫颈上皮 54 尖锐湿疣 55 鲍温样丘疹病 59 VIN 61，62，64，67 VaIN 66 鳞癌 70 外阴乳头状瘤

81 HPV感染率 最常见的低危型（HPV6、11） 最常见的高危型（HPV16、18、31、33、45、58 ） 宫颈癌患者中高危型HPV感染率
Other 宫颈癌患者中高危型HPV感染率

82 表 不同HPV亚型的检出频率统计表 注：1.本表统计样本数为1153例，其中阳性样本数为119例；
注：1.本表统计样本数为1153例，其中阳性样本数为119例； 由于检测样本中存在复合感染，故亚型的检出频率＝（该亚型的检出次数 / 所有亚型的检出次数）×100％， 所有亚型检出次数为226。 2. 本表统计数据由深圳市计生中心提供，HPV分型基因检测试剂由亚能生物技术（深圳）有限公司提供。

83 2001年版TBS（The Bethesda System)报告分类中常见的细胞学诊断宫颈癌前病变的几个术语解释：
未见上皮内病变－－鳞状上皮细胞异常－－腺上皮细胞异常 ASCUS（Atypical Squamous Cells)：非典型鳞状上皮细胞 ASC-US:意义不明确的非典型鳞状上皮细胞 ASC-H：意义不明确的非典型鳞状上皮细胞不除外高度鳞状上皮内病变 L-SIL：低度鳞状上皮内病变－－－－HPV感染、CIN I H-SIL：高度鳞状上皮内病变－－－－与CIN II、CIN III或原位癌含义一致 SCC：鳞状细胞癌 AGC（ Atypical Glandular Cells)：非典型腺上皮细胞 AIS（Adenocarcinoma In Situ)：腺原位癌 CS：腺癌 组织学检查的分类： CIN（Cervical Intraepithelial Neoplasm)：宫颈上皮内瘤变 CIN I：轻度不典型增生 CIN II：中度不典型增生 CINIII：重度不典型增生、原位癌

84 潜伏感染期 亚临床感染期 临床症状期 HPV相关肿瘤期
一过性，80％ 平均8个月 无细胞学改变/HPV消除 年龄<30岁 正常妇女 HPV暴露 机体免疫机制 辅助致癌因素 HPV CIN I（组织学） 主要是性传播 感染几率：4～15％ 年龄>30岁 CIN II/III（组织学） 子宫颈浸润癌 平均6~24个月 5－10年 潜伏感染期 亚临床感染期 临床症状期 HPV相关肿瘤期 图 HPV感染与宫颈病变的自然过程

85 说明：CIN级别越高，其消退和逆转的机会越小。
病变 消退（逆转） 持续（稳定） 进展（恶化） 表 CIN级别发展为CC的风险评估 级别 单纯HPV CIN I CIN II CIN III 风险率(%) 5 15 30 45 持续率(%) 37 35 <56 消退率(%) 80 57 43 32 说明：CIN级别越高，其消退和逆转的机会越小。

86 筛查是早诊早治关键 临床提示，从HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变并最终发展为宫颈癌大约需要5-10年。因此，必须采取适当的预防和筛查措施，才能够阻止宫颈癌的发生并有望最终根治。 美国肿瘤临床指导：性行为开始三年左右，不晚于21岁开始。每年筛一次。若2～3次HPV和细胞学筛查均为正常者，可延长筛查时间至5-8年。大于70岁，在10年内已有3次以上满意的细胞学检查和HPV检查正常者，可停止筛查。良性子宫切除患者不需要检查，否则，连续3年检查，可终止。 中国：筛查起始年龄可考虑为25-30岁，65岁以上可停止筛查。

87 表：筛查间隔时间与阳性病变风险系数表 筛查间隔时间 （年） 1 2 3 3～5 5～10 >10 阳性病变风险系数 2.5 4 9
备注：1～3年筛查间隔比较安全，随着筛查间隔的增加，风险大幅度增加。

88 宫颈癌的常规临床检测方法 临床检查：如肉眼观察、阴道镜等 细胞学检测：观察宫颈上皮细胞的变异，常见方法有：巴氏涂 片、LCT、 TCT等
操作简便，但准确率和特异性有待提高（50-70％） 细胞学检测：观察宫颈上皮细胞的变异，常见方法有：巴氏涂 片、LCT、 TCT等 1）长期宫颈糜烂可导致宫颈上皮细胞形态变异，但非HPV引起的细胞形态异常与宫颈癌病变没有直接联系。 2）在感染早期，细胞往往不会出现形态变化，但此时HPV对细胞内遗传物质的损伤可能已经产生。 病毒学检测：HPV DNA检测（PCR方法），常见方法有：基因芯 片分型检测、荧光PCR等 特异性强、灵敏度高，操作简便快捷 (98%)

89 中国癌症研究基金会（CCRF）筛查和早诊早治指南：
基本方案：肉眼观察＋冰醋酸试验（碘液试验） 一般方案：pap smear+HPV检测 最佳方案：TCT+HPV检测

90 HPV检测的应用领域： 一、宫颈癌的筛查 二、评估宫颈癌的治疗疗效

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92 高危型HPV持续感染是导致宫颈癌的主要原因

93 二、评估宫颈癌的治疗疗效 CIN患者： 成功治疗率达90～95％，复发率10％； 比正常人发生浸润癌的几率高4－5倍； 危险期：8年左右；
常规复查要求：4－6个月，复查HPV、细胞学、阴道镜等。

94 宫颈癌的筛查是非常重要的， 筛查的对象包括如下人群： 二、即使没有性生活，但年龄超过21岁的女性；
　　一、过早有性生活的女性； 　　二、即使没有性生活，但年龄超过21岁的女性； 　　三、只要保持有性生活的女性，特别是年龄过了30岁以后的女性； 　　四、性伴侣超过1个的女性； 　　五、配偶有其他性伴侣的女性； 　　六、吸烟的女性； 　　七、HIV（艾滋病病毒）感染者； 　　八、患有其他性传染疾病者； 　　九、正在接受免疫抑制剂治疗者； 　　十、有宫颈病变、子宫内膜癌、阴道癌或外阴癌等病史者。

95 上述人群应该每年做一次宫颈癌筛查，在做筛查前要注意如下问题：
　　一、不要在月经期间做筛查； 　　二、注意在检查前3天内不要冲洗阴道或使用阴道内药物； 　　三、24小时内不要有性生活，以免影响检查结果的准确性。　

96 谢谢大家