维生素类及辅酶类药物的分析 第一节 维生素概述 vitamin P237 一、维生素概念和特点 低分子有机化合物

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1 维生素类及辅酶类药物的分析 第一节 维生素概述 vitamin P237 一、维生素概念和特点 低分子有机化合物
第一节 维生素概述 一、维生素概念和特点 vitamin 概念：维持机体正常生长和健康所必需的一类 低分子有机化合物 特点：1 既不是构成组织的材料，也不是供能物质； 2 需要量有限 (长期大剂量使用维生素易引起中毒； 长期供给不足时，易导致维生素缺乏症); 3 大多数B族Vit.构成辅酶，参与物质代谢。 P237

2 二、维生素的分类与命名 脂溶性维生素： A、D、E、K 水溶性维生素：B族 + C 分类 B1、B2、PP、B6、泛酸、生物素、叶酸、B12

3 三、维生素缺乏症及原因 概念：维生素供应不足引起的疾病 原因： 摄取不足； 2 吸收障碍; 3 机体需要量增加； 4 服用某些药物。

4 一、化学性质----一种不饱和的多羟基内酯化合物
第二节 维生素类C的分析 一、化学性质----一种不饱和的多羟基内酯化合物 维生素C与糖类十分相似 分子中有两个不对称碳原子（C4，C5），能形成四个光学异构体。 L（+）-维生素C的生物活性最高 D（－）-异维生素C的活性只有前者的5%

5 维生素C分子结构中的二烯醇基性质极为活泼，极易受氧化转变为去氢维生素C。

6 二、性质 荧光反应 酸性 糖的性质 还原性 糖类性质 烯二醇结构 烯二醇结构 共轭 类糖

7 性质： 1.酸性 烯二醇结构—酸性。 ▲C3-OH， pKa=4.17(共轭效应) ▲C2-OH，pKa=11.57(邻位羰基) 一元酸.
能与NaHCO3作用生成钠盐

8 2、还原性 烯二醇基—还原性。 如：还原性 与硝酸银反应可生成金属银黑色沉淀 与2，6-二氯吲哚酚反应（2，6-二氯靛酚）

9 3. 荧光反应 4. 糖的性质 VC的结构很象糖结构，具有糖的性质。
3. 荧光反应 [O] 【邻苯二胺】 Vc 去氢抗坏血酸 蓝色荧光 4. 糖的性质 VC的结构很象糖结构，具有糖的性质。 可在三氯醋酸或盐酸存在下，经水解、脱羧、失水等反应，转变为糠醛，再与吡咯在50℃反应生成蓝色，用于鉴别反应

10 三、鉴别试验 1.还原性：维生素C分子中的二个烯醇基具有强还原性可以被氧化为二酮基

11 2.利用糖类的性质 可在三氯醋酸或盐酸存在下，经水解、脱羧、失水等反应，转变成糠醛，再与吡咯在50℃反应生成蓝色。
3.紫外分光光度法:根据维生素C在盐酸液（0.01mol/L）中，243nm有最大吸收。

12 四．含量测定 维生素C的含量测定基于其具有强的还原性，可被不同氧化剂定量氧化而进行。
碘量法，二氯靛酚法等容量分析法，操作简便、快速，结果准确，被各国药典所广泛采用。 紫外分光光度法 高效液相色谱法，则适用于制剂和体液中维生素C的专属测定。

13 1. 碘量法 a. 原理 抗坏血酸又称维生素C(Vc),分子式为C6H8O6, 由于分子中的烯二醇基具有还原性,能被I2氧化成二酮基:
1.   碘量法 a.      原理 抗坏血酸又称维生素C(Vc),分子式为C6H8O6, 由于分子中的烯二醇基具有还原性,能被I2氧化成二酮基:  维生素C的反应为  C6H8O6= C6H6O6 + 2H+ +2e-  1mol维生素C与1mol I2定量反应. 维生素C的摩尔质量为176.12g/mol .    由于维生素C的还原性很强,在空气中极易被氧化,尤其是在碱性介质中,测定时加入HAc使溶液呈弱酸性,减少维生素C的副反应.

14 b 操作 维生素C的测定 准确称取维生素C 0.2克左右, 称三份于三个250mL锥形瓶中, 用100mL新煮沸放冷的蒸馏水与10mL 2 mol.L-1 HAc的混合溶液溶解. 加淀粉指示剂2mL, 立即用I2标准溶液滴定. 终点颜色：无色→蓝色 0.1mol/L碘液1ml8.806mg C6H8O6 C讨论 反应条件 ＊ 酸性 使VC在空气中氧化速度减慢。 溶剂 新沸放冷的水。 减少水中溶解氧的影响 要排除亚硫酸的影响则在滴定前加入丙酮或甲醛。

15 2、2,6-二氯靛酚滴定法 原理： 在酸性下 氧化型是红色的;还原型是无色的 酸性下直接用2,6-二氯靛酚滴定，用滴定剂 自身的颜色变化指示终点，不需要另外的指 示剂。

16 3、与1，10-菲洛啉-铁（III）试剂的比色法
基于维生素C将Fe(Ⅲ)还原生成 Fe(Ⅱ),Fe(Ⅱ)与菲洛啉 形成桔红色络合物， 在510nm有最大吸收。

17 4、紫外分光光度法 pH5~10之间维生素C在267nm波长处有最大吸收
吸收度为A（I），如果维生素C经Cu2+催化氧化生成去氢维生素C，进一步水解为二酮古罗糖酸，测吸收度A（Ⅱ） 通过测定维生素C在Cu2+催化氧化前后吸收度之差，来测定维生素C的含量。

18 5.高效液相色谱法 人血浆中维生素C浓度的HPLC测定 色谱条件： ODS（4.6mm×20cm，5μm）色谱柱
甲醇-0.5%偏磷酸溶液（2.5∶97.5）流动相，流速1ml/min，检测波长245nm，柱温25℃。 进样20μl，按外标法峰面积定量。 样品测定 ： 12名健康受试者口服维生素C泡腾片1g，分别于给药前及给药后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24和36小时于静脉取血3ml，并分离血浆进行维生素C浓度测定。

19 第三节 维生素E的分析 维生素E（vitamin E）是一类与生育有关的维生素的总称，又名生育酚（tocopherol）
合成型为dl-α-生育酚醋酸酯(dl-α-tocopheryl acetate)； 天然型为d-α-生育酚醋酸酯(d-α-tocopheryl acetate)。

20 一、性质 （1）溶解性 植物油中易溶，在水中不溶。 （2）水解性 维生素E苯环上有乙酰化的酚羟基，在酸性或碱性溶液中加热可水解生成游离生育酚，故常将其作为特殊杂质进行检查。 （3）氧化性 对氧十分敏感，遇光、空气可被氧化。其氧化产物为α-生育醌和α-生育酚二聚体。 （4）紫外吸收特性 维生素E结构中苯环上有酚羟基，故有紫外吸收。

21 二、鉴别试验 1.硝酸反应 维生素E在硝酸酸性条件下，水解生成生育酚，生育酚被硝酸氧化为邻醌结构的生育红而显橙红色。

22 2.三氯化铁反应 原理 维生素E在碱性条件下，水解生成游离的生育酚，可被FeCl3氧化成对-生育醌；同时Fe3+被还原为Fe2+，Fe2+与联吡啶生成红色的配位离子。

23 3.紫外光谱法 本品的0.01％无水乙醇液，在284nm的波长处有最大吸收。 4. 其他鉴别方法 采用红外光谱法鉴别维生素E，其红外光吸收图谱应与对照的光谱图一致； 采用气相色谱法鉴别，供试品主峰的保留时间应与维生素E对照品峰的保留时间一致。

24 三、检查-- 天然维生素E采用硫酸铈滴定法检查游离生育酚。游离生育具有还原性，可被硫酸铈定量氧化。
取本品0.10g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液1滴，用硫酸铈滴定(0.01mol/L)滴定（黄色），消耗硫酸铈滴定液(0.01mol/L)不得过1.0ml。每1ml硫酸铈滴定液(0.01mol/L)相当于 g的游离生育酚，维生素E中所含的游离生育酚的限量相当于不得过2.15％。

25 合成维生素E检查 维生素E的合成步骤繁多，合成过程中会残存α-生育酚及其他杂质；《中国药典》（2015年版）采用气相色谱法检查有关物质，以控制α-生育酚及其他杂质的量。 有关物质（合成型） 取本品，用正己烷稀释制成每lml中约含2. 5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，用正己烷定量稀释制成每lm l中含25 μ g的溶液，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件，精密量取供试品溶液与对照溶液各1μ l，分别注入气相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，a-生育酚(杂质I ) (相对保留时间约为0. 87)的峰面积不得大于对照溶液主峰面积（1. 0% ) ，其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1. 5倍（1. 5% ) ，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2. 5倍（2.5% ) 。

26 三、含量测定 1.气相色谱法 该法具有高度选择性，可分离维生素E及其异构体，选择性地测定维生素E，目前该法为各国药典所采用。
2.高效液相色谱法 采用高效液相色谱法测定维生素E(dl-α-生育酚)的含量，以外标法定量。 供试品中生育酚的量(mg)=mr×Hx/Hr mr为生育酚对照品的量(mg)；Hx和厅Hr分别为供试品和对照品中生育酚的峰高。 3.荧光分光光度法 维生素E的测定国内外大多采用荧光法。

27 第四节 辅酶Q10的分析 一、概述 辅酶 Q10又名泛醌10，是一种脂溶性醌。是细胞呼吸链中的主要递氢体，是重要的天然抗氧剂、既有保护和恢复生物膜结构完整性的作用。 p256

28 抗氧化 黄色 呼吸链成员 调节基因表达 无色 重要的辅酶

29 二、鉴别 还原型辅酶Q10 1. 根据氧化型和还原型颜色不同来鉴别 氧化型辅酶Q10 （黄色） （无色）
（黄色） （无色） 2.氧化型辅酶Q10可将还原型亚甲蓝（无色）氧化而显 蓝 硼氢化钠 还原型辅酶Q10 3. 紫外吸收光谱，275nm 如教材图9-9进行测定

30 三、含量测定 1.紫外分光光度法 氧化型 275nm “—”还原型 275nm 2.HPLC
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇：水 （1：1）为流动相，柱温35℃，检测波长275nm，理 论塔板数按辅酶Q10峰算应不小于3000. 测定法：取本品20mg，精密称定，加无水乙醇约 40ml，在50℃水浴中振摇溶解，放冷后，移至100ml 量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶 液，取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱 图；另取经五氧化二磷干燥至恒重的辅酶Q10对照品 适量，同法测定。按外标法以峰面积计算。

31 第十章 核苷酸类药物分析 第一节 概述 P260

32 第二节 嘌呤类核苷酸药物分析 一、鉴别 （一）定糖法 地衣酚orcinol反应：核酸与浓盐酸共热时，可形成糠醛
绿色 670nm 二苯胺diphenylamine 反应：脱氧核糖核酸经酸水解后得脱氧核糖 蓝色 595nm 与间苯三酚反应：其中的核糖在水溶液中加间苯三酚，水浴，显玫瑰红色

33 （二）定磷法 （三）嘌呤的鉴定 （四）紫外吸收法 260nm 钼酸 浓硫酸 无机磷 核酸 蓝色产物 高氯酸 还原剂
嘌呤碱基的水溶液 + 氨制硝酸银 光 白色沉淀 红棕色 （四）紫外吸收法 nm

34 二、检查 （一）一般检查 三、含量测定 （二） 蛋白质检查 （三）有关物质 酸度 水分 无机盐 有机物 溶液颜色等 磺基水杨酸 有无沉淀
磺基水杨酸 有无沉淀 （三）有关物质 纸色谱 薄层色谱 电泳法 荧光检查法 三、含量测定 紫外分光光度法

35 四、三磷酸腺苷二钠（ATP)质量分析 P264 一 结构 二 性状 三 鉴别 1.定磷法 2. 定糖法 3. 紫外吸收 4.钠盐的火焰鉴别
腺嘌呤核苷-5‘-三磷酸酯二钠盐 二 性状 白色 溶于水 三 鉴别 1.定磷法 消化后 钼酸铵试剂 黄色沉淀 2. 定糖法 盐酸溶解 间苯三酚 加热 玫瑰红色 3. 紫外吸收 257nm Max A250/A260为 A280/A260为 4.钠盐的火焰鉴别 P264

36 四 检查 1.酸度 2.5-4.5 2.溶液的颜色 无色 3.蛋白质 磺基水杨酸 不浑浊 4.荧光杂质 电泳图谱 254nm无蓝紫色荧光斑点
1.酸度 2.溶液的颜色 无色 3.蛋白质 磺基水杨酸 不浑浊 4.荧光杂质 电泳图谱 254nm无蓝紫色荧光斑点 5.干燥失重 小于7% 6.含量测定 （1）纸电泳---254nm---紫色斑点---盐酸----紫外分光检测257nm ，吸光 系数为263 （2） 0.1M磷酸盐缓冲液溶解并制成终浓度为20ug/ml的溶液，259nm测定 ，吸光系数为279 （3）HPLC（测定重量比） 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.2M磷酸缓冲液：甲醇（1：1 ）为流动相，柱温35℃，检测波长259nm，理论塔板数按ATP峰算应 不小于1500。依次出峰为AMP ADP ATP.

37 第四节 嘧啶类核苷酸药物分析 P268 举例：氟尿嘧啶（Fluorouracil)的质量分析 1.结构
2.性状：白色或类白色结晶或粉末，在水中略溶 ，在稀酸或稀碱中溶解 3.鉴别 （1）卤素反应 加溴试液，振摇，颜色消失，加 氢氧化钡，生成紫色沉淀 （2）紫外法 265nm最大吸收 4.检查 5.含量测定 265nm P268

38 第二节 维生素类C的分析 二、性质与鉴别试验 三．含量测定 1. 碘量法 2. 2,6-二氯吲哚酚滴定法
1.酸性 2.还原性 3. 荧光反应 4. 糖的性质 三．含量测定 1. 碘量法 2. 2,6-二氯吲哚酚滴定法 3. 与1，10-菲洛啉-铁（III）试剂的比色法 4. 紫外分光光度法

39 第三节 维生素E的分析 合成型：dl-α-生育酚醋酸酯 天然型：d-α-生育酚醋酸酯 检查：

40 第三节 辅酶Q10的分析 二、鉴别 1. 根据氧化型和还原型颜色不同 2.氧化型辅酶Q10可将还原型亚甲蓝（ 无色）氧化而显蓝
3. 紫外吸收光谱

41 第十章 核苷酸类药物分析 一、鉴别 （一）定糖法 地衣酚orcinol反应： 二苯胺反应 间苯三酚反应