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1 Add your company slogan
第八章 微生物遗传变异 Add your company slogan

2 本章内容 第一节 遗传变异的物质基础 第二节 基因突变 第三节 基因重组 第四节 菌种的衰退、复壮和保藏
第一节 遗传变异的物质基础 第二节 基因突变 第三节 基因重组 第四节 菌种的衰退、复壮和保藏

3 几 个 概 念 遗传型（genotype）：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子的总和。是遗传物质上所负载的特定遗传信息。
表型（phenotype）：指某一生物体所具有的一切外表特征及内在特征的总和。是遗传型在合适环境下的具体体现。 遗传（heredity或inheritance）：指生物上一代将自己的遗传因子传递给下一代的行为或功能，具有极其稳定性。

4 变异（variation）：指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。特点是出现频率低、可稳定遗传。
饰变（modification）：指不涉及遗传物质的改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。其特点是在整个群体中普遍出现，不能稳定遗传。

5 微生物是遗传学研究的模式生物 （1）个体的结构极其简单； （2）营养体一般都是单倍体； （3）易于在成分简单的组合培养基上大 量生长繁殖；
（3）易于在成分简单的组合培养基上大 量生长繁殖； （4）繁殖速度快； （5）易于积累不同的中间代谢产物或终产物； （6）菌落形态特征的可见性和多样性；

6 （7）环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性；
（8）易于形成营养缺陷型； （9）各种微生物一般都有相应的病毒； （10）存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式；

7 第一节 遗传变异的物质基础 一、3个经典实验 经典转化实验 噬菌体感染实验 植物病毒的重建实验

8 1. 经典转化实验（transformation）
1928, 英国Griffith（格里菲斯）, Streptococcus penumoniae (肺炎双球菌) 菌株 毒力 荚膜 菌落 型 野生型 有 产生 光滑Smooth Ⅰ Ⅱ Ⅲ 突变型 无 不产生 粗糙Rough Ⅰ Ⅱ Ⅲ

9 对小鼠注射活RII菌或死SIII菌 ———小鼠存活 对小鼠注射活SIII菌————小鼠死亡
（1）动物实验 对小鼠注射活RII菌或死SIII菌 ———小鼠存活 对小鼠注射活SIII菌————小鼠死亡 对小鼠注射活RII菌和热死SIII菌 ———小鼠死亡 ———抽取心血分离———活的SIII菌

10 混合培养 RII型活菌 SIII型活菌 SIII型热死菌 健康 病死

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12 热死SIII菌—————不生长 活 RII 菌—————长出RII菌 热死SIII菌+活 RII 菌——长出大量RII菌和10-6SIII菌
（2）细菌培养实验 热死SIII菌—————不生长 活 RII 菌—————长出RII菌 热死SIII菌+活 RII 菌——长出大量RII菌和10-6SIII菌 （3）S型菌的无细胞抽提液试验 活RII菌+SIII菌无细胞抽提液——长出大量R菌和少量S菌

13 这种一种生物由于接受了另一种生物的遗传物质而表现出后者的遗传性状，或发生遗传性状改变的现象叫做转化。
Griffith认为，加热杀死的SIII型细菌细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入RII型细胞并使RII型细胞获得稳定的遗传性状，转变为SIII型细胞。并把转化物质称为转化因子。 这种一种生物由于接受了另一种生物的遗传物质而表现出后者的遗传性状，或发生遗传性状改变的现象叫做转化。

14 分别用降解DNA、RNA、蛋白质的酶作用于有毒的S型菌细胞抽提物
1944年O. T. Avery、C. M. MacLeod和M. McCarty从热死S型S. pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化试验：

15 ①加S菌DNA ②加S菌DNA及DNA酶以外的酶 ③加S菌的DNA和DNA酶 ④加S菌的RNA ⑤加S菌的蛋白质 ⑥加S菌的荚膜多糖 活R菌 长出S菌 只有R菌 只有S型细菌的DNA才能将S. pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。

16 2. 噬菌体感染实验 1952，A. D. Hershey & M. Chase, E.coli T2噬菌体 大肠杆菌培养在以放射性32PO43-或35SO42-作为磷源或硫源的培养基中，制备出含32P-DNA核心的噬菌体或含35S-蛋白质外壳的噬菌体，作了两个实验：

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18 沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体
（1）含32P-DNA的一组 10分钟后 用捣碎器 使空壳脱离 吸附 离心 沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体 结论：放射性85%在沉淀中

19 沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体
（2）含35S-蛋白质的一组 10分钟后 用捣碎器 使空壳脱离 吸附 离心 沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体 结论：放射性75%在上清液中 推论：蛋白质外壳不进入细胞中，推测DNA中存在着包括合成噬菌体蛋白质外壳在内的遗传信息。

20 3. 植物病毒的重建实验 1956，H. Fraenkel-Conrat用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了植物病毒重建实验。
将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。

21 选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV），分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：
（1）RNA（TMV）­ 蛋白质（HRV） （2）RNA（HRV）­ 蛋白质（TMV） 用两种杂合病毒感染寄主： (1)表现TMV的典型症状病分离到正常TMV粒子 (2)表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。 说明在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。

22 证明核酸（DNA或RNA）是遗传的物质基础
结论 证明核酸（DNA或RNA）是遗传的物质基础 简单的细菌（或病毒）解决复杂而重大的问题 微生物与高等生物具有共同的遗传本质

23 （一）7个水平 二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式 细胞水平：细胞核、核区，多核微生物 细胞核水平：基因组、质粒（仅2μm质粒在核内）
染色体水平：部分双倍体 核酸水平：DNA、RNA 基因水平：操纵子，内含子和外显子， 基因、蛋白、抗性基因书写方式 密码子水平：密码子三联体 核苷酸水平：TACGU，最低突变单位或交换单位

24 基因组:单倍体细胞核内整套染色体所含的DNA分子及其所携带的全部基因。
基因组的大小: 病毒103bp 原核生物106bp 真核生物109bp

25 2. 原核生物的质粒 (1) 质粒：游离于原核生物基因组外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状DNA分子，即cccDNA（circlularcovalently closed DNA）。 (2) 类型 严紧型质粒：其复制过程与核染色体的复制同步，一般细胞中只含有1~2个。 松弛型质粒：其复制过程与核染色体的复制不同步，在细胞中一般有10~15个。

26 几种重要的质粒 ① F因子（ fertility factorfertility factor））
又称致育因子，是大肠杆菌等细菌中决定 “性别”的质粒。可通过接合转移。

27 ②R因子（resistance factor） 又称抗药性质粒，具有多种抗生素抗性基因，且可在不同细菌中传递,作为基因工程的载体。
③Ti质粒（tumor inducing plasmidtumor plasmid） 即诱癌质粒，存在于根癌农杆菌（ Agrobacterium tumefaciens）中，可引起多种双子叶植物的根癌。 Ti质粒是当今植物基因工程研究中的重要载体。

28 ④降解性质粒 只在假单孢菌属（pseudomonas）存在的一系列质粒的总称，它们可以为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而可以分解利用一般细菌所难以分解的物质。这些质粒以其所分解的底物命名，如：CAM（樟脑）质粒、XYL（二甲苯）质粒、NAP（萘）质粒等。 在环境保护上具有重大的应用价值。

29 基因突变（gene mutation）：简称突变，指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化。可自发或诱导产生。
第二节 基因突变 基因突变（gene mutation）：简称突变，指生物体内遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化。可自发或诱导产生。 狭义的突变：一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，包括一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换而导致的基因突变，其发生变化的范围很小，又称点突变。

30 广义的突变：包括染色体畸变和点突变。染色体畸变是指大段染色体的缺失、重复、倒位、易位。
野生型菌株：从自然界分离得到的菌株 突变株：野生型经突变后形成的带有新性状的菌株。

31 一、基因突变 （一）基因突变的类型 1. 营养缺陷型（auxotroph）
某一野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出。

32 营养缺陷型的表示方法 基因型： 所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：hisC （组氨酸缺陷型，其中的大写字母C同一表型中不同基因的突变）
使用时多用hisC-——缺陷型，hisC+——野生型。

33 2. 抗性突变型（resistant mutant）
野生型菌株因发生基因突变，而产生的对某种化学药物或致死物理因子的抗性变异类型，可在加有相应因子的培养基上选出。 表示方法：所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示 str r 和 str s 分别表示对链霉素的抗性和敏感性

34 3. 条件致死突变型（conditional lethal mutant）
某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可以正常的生长繁殖并呈现其固有的表型，而在另一种条件下却无法生长繁殖的突变类型。 如E.coil的Ts突变株（温度敏感突变型），在37℃下正常生长，42℃下不能生长。 4. 形态突变型（morphological mutant） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异。如：孢子的颜色、有无；鞭毛、荚膜的有无；菌落的表面情况等

35 5. 抗原突变型（antigenic mutant） 指由于基因突变而引起的细胞抗原结构发生的变异类型。如：细胞壁缺陷型、鞭毛突变型等。
6. 产量突变型（producing mutant） 通过基因突变获得的在有用产物的产量上同原始菌株有明显差别的突变株，两种： “正变株”（plus-mutant） “负变株”（minus-mutant）。

36 （二） 突变率 ( mutation rate )
某一细胞或病毒粒在每一世代中发生某一性状突变的几率。 或：每一单位群体在每一世 代中产生的突变株的数目来表示。

37 ①不对应性：突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系；
（三） 基因突变的特点 ①不对应性：突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系； ②自发性：突变可以在没有人为因素的处理下自发发生； ③稀有性：自发突变的频率是极低和稳定的，常在10-6～ 10-9之间；

38 ④独立性：某一基因的突变，不会对其他基因的突变频率产生影响；
⑤诱变性：通过诱变剂的作用，可以提高自发突变的几率10～105倍； ⑥稳定性：突变性状是稳定的、可遗传的； ⑦可逆性：任何性状都会发生正向突变，也会发生回复突变。

39 突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系
（四）基因突变自发性 和不对应性实验证明 三个经典实验 变量实验、涂布实验、影印实验 突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系

40 （1）变量试验（fluctuation analysis）Salvador Luria and Max Delbruck（1943）波动试验、彷徨试验
结果： 说明：

41 （2）Newcombe的涂布试验（1949） 结果： 说明：

42 （3）影印平板培养法（replica plating ）

43 Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）
结果： 说明：

44 “生物化学统一性”法则：所有生物的DNA在结构及特性上具有一致性。
诱变剂与致癌物质——Ames试验 “生物化学统一性”法则：所有生物的DNA在结构及特性上具有一致性。 人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。

45 Ames试验 Ames试验(艾姆氏实验)：美国加利福尼亚大学Bruce Ames教授于1966年发明，检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium) 组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率。用于检测环境或食品中是否存在化学致癌剂。P215 回复突变(reverse mutation或back mutation)：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变

46 证明Ames试验重要性的应用实例： 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在60-70年代十分流行，但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用但如果能在这种药物上市之前就进行Ames试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免。

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48 （五）基因突变及其机制

49 1. 诱发突变( induced mutation ) ①碱基的置换（substitutionsubstitution）
转换（transitiontransition）：即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶所置换；A G，T C 颠换(transversiontransversion)：即DNA链中一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换。A T或C, G C或T

50 直接引起置换的诱变剂：如：亚硝酸、羟胺等。不论体内还是体外，均可直接与核酸反应。
碱基置换的机制 直接引起置换的诱变剂：如：亚硝酸、羟胺等。不论体内还是体外，均可直接与核酸反应。 间接引起置换的诱变剂：如：5-BU，2-AP，5-AU等，均为碱基类似物。

51 ②移码突变(frame-shift mutation
移码突变：指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的添加或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的异类突变。移码突变诱变剂：丫啶类染料（丫啶橙丫啶黄、原黄素等）和一系列ICR类的化合物。􀂙 ICR：由美国的肿瘤研究所（Institute for Cancer Research）合成，是一些由烷化剂与丫啶类化合物相结合的化合物。

52 ③染色体畸变（chromosomal aberration）
即 DNA分子大损伤：染色体结构的缺失、重复、插入、易位、倒位 染色体易位是分子遗传学研究的热点 转座：DNA序列从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或者其它染色体上某一部位的现象称为转座。这段DNA顺序称为转座因子。包括插入序列、转座子、 Mu噬菌体等

53 插入序列（IS，insertion sequence）：分子量最小（0.7～1.4kb），只能引起转座效应而不含其它任何基因；
转座子（Tn，transposon）分子量居中（2～25kb），除了与转座有关的基因外，常含有抗药性基因或乳糖发酵基因等其他基因； Mu噬菌体（mutatorphage即诱变噬菌体）是E.coil的一种温和噬菌体，无特定整合位点，分子量最大（37kb），含有20多个基因。

54 2. 自发突变 自发突变：没有人工参与下的生物体自然发生的突变。 可能的机制： A 背景辐射和环境因素的诱变；
B 微生物本身有害代谢物的诱变效应； C 复制过程中碱基配对错误引起。

55 （六）紫外线对DNA的损伤及修复 损伤机制

56 ①光复活作用（photoreactivation）
修复机制： ①光复活作用（photoreactivation） 经紫外线照射过的微生物立即曝露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象。又称为SOS修复，是一种倾向差错型修复作用。 ②暗修复（dark repair）又称切除修复（excision repair）：这种修复与光无关，必须有四种酶的参与：ａ．核酸内切酶ｂ．核酸外切酶ｃ．DNA聚合酶ｄ．连接酶。

57 第三节 基因重组 基因重组：两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新的稳定基因组的过程，称为基因重组(gene recombination)或遗传重组(genetic recombination)。是分子水平上的杂交. 原核生物：转化、转导、接合和原生质体融合； 真核微生物：有性杂交、准性杂交、原生质体融合。

58 一、原核生物的基因重组 （一）转化（transformation）
1928年，Griffith（格里菲斯）发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转化现象 目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化能力 是现代生物学发展史上重要的里程碑

59 感受态（competence）：受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。 自然转化→→→人工转化→→→基因工程
转化（transformation）：指受体菌（recipient cell, receptor）直接吸收供体菌（donor cell）的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象。 转化子：通过转化方式形成的杂种后代 感受态（competence）：受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。 自然转化→→→人工转化→→→基因工程 基因工程的奠基石和基础技术

60 定义：通常将不经特殊处理的细菌细胞从其环境中吸收外来DNA的过程。
1. 自然转化 定义：通常将不经特殊处理的细菌细胞从其环境中吸收外来DNA的过程。 自然转化一般可人为地分为下列三个阶段 ①感受态的出现； ②DNA的结合与进入； ③DNA的整合。

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62 如果通过二价阳离子处理，大肠杆菌和许多G-细菌能产生感受态；对另一些细菌特别是某些G+细菌，则可通过制备原生质体实现DNA转化。
2. 人工转化 如果通过二价阳离子处理，大肠杆菌和许多G-细菌能产生感受态；对另一些细菌特别是某些G+细菌，则可通过制备原生质体实现DNA转化。 （1）大肠杆菌的转化1970年Mandel和Higa首先发现，DNA在高Ca+的条件下能够被受体细胞摄入和转化。

63 DNA转化过程 StrR StrS StrR

64 （3）电穿孔法：电穿孔法是用高压脉冲电流击破细胞膜或将细胞膜击成小孔，使各种大分子能通过这些小孔进入细胞，又称电转化。
（2）PEG介导的转化 （3）电穿孔法：电穿孔法是用高压脉冲电流击破细胞膜或将细胞膜击成小孔，使各种大分子能通过这些小孔进入细胞，又称电转化。 （4）基因枪转化：将包裹有DNA的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使DNA留在细胞内，特别是留在细胞器中。

65 （二）转导(transduction) 1952年，Joshua Lederberg（莱德伯格）和Norton Zinder（辛德）为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验。 用“U”型管进行同样的实验时，在供体和受体细胞不接触的情况下，同样出现野生型细菌！

66 转导模型 溶源性菌株：色氨酸营养缺陷型LA-22：trp-,his+ 比细菌小的噬菌体、培养基、游离的DNA片段能通过

67 一株为沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌，另一株是非溶源性细菌 基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的P22噬菌体介导的
一个常规研究导致一个十分惊奇和重要的发现发现普遍性转导这一重要的基因转移途径！

68 转导：利用缺陷噬菌体为媒介，将供体菌的小片段DNA转移到受体细胞中，通过交换和整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。
转导子：由转导作用获得部分新性状的重组细胞 通常，用温和噬菌体作为媒介 转导DNA位于噬菌体蛋白外壳内，不易被外界的DNA水解酶所破坏，所以比较稳定。 分为普遍性转导和局限性转导两种类型。

69 1. 普遍转导（generalized transduction）
通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”，而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象。 完全普遍转导：简称完全转导(complete transduction)，由完全不含噬菌体自身DNA的假噬菌体－完全缺陷噬菌体把外源DNA片段导入受体细胞内。 流产普遍转导：简称流产转导(abortive transduction)，经转导而获得了供体菌DNA片段的受体菌，如果外源DNA在其内既不进行交换、整合和复制，也不迅速消失，而仅进行转录、转译和性状表达，这种现象就称流产转导。

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71 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。
2. 局限转导 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。 特点：只能转导供体菌的个别特定基因；该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带。

72 局限转导 温和噬菌体λ只能整合到宿主染色体的特定位点，裂解时的不正常切割：包含gal或bio基因 （几率一般仅有10-6）

73 ①低频转导（10-5）：不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体DNA上，形成一种特殊的噬菌体——缺陷噬菌体。
②高频转导（high frequency transduction, HFT）（50％）：在局限转导中，若对双重溶源菌进行诱导，就会产生含50％左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物HFT，用这种裂解物去转导受体菌，就可获得高达50％左右的转导子。

74 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重组形成的稳定转导子
溶源转变与转导温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象，称为溶源转变。 溶源转变不同于转导： ①噬菌体不携带任何外源基因 ②噬菌体基因而非供体菌基因提供了宿主的新性状 ③新性状是宿主细胞溶源化时的表型而非经遗传重组形成的稳定转导子 ④获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失

75 （三）接合(conjugation) 定义：供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。
1946年，Joshua Lederberg（莱德伯格）和Edward L.Taturm（塔图姆）进行了著名的细菌的多重营养缺陷型杂交实验。

76 1. 接合现象的发现与证实 他们用大肠杆菌K12的两个营养缺陷型菌株混合培养。 结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组:
①转化作用的排除②F质粒的发现

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78 比细菌小的、培养基、游离的DNA片段能通过
“U”型管实验（ Bernard Davis，1950 ） 结论：重组子不是转化的结果,接合需要两亲本的接触 比细菌小的、培养基、游离的DNA片段能通过

79 2. F质粒的结构 及其在细胞中的存在状态 F质粒：双链环状DNA分子，99159bp。 F质粒整个基因组由三个主要区段组成：
①转移区 ②复制区 ③插入区

80 F质粒 两株E.coli的接合电镜照片

81 根据F质粒在大肠杆菌细胞内有无及存在状态可将细胞分为四种类型：
F-：雌性，不含F质粒， F+：雄性，含有F质粒，游离 Hfr：F质粒整合到宿主染色体上，并随之复制 F’：携带了宿主的一部分染色体的F质粒

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83 （3）F质粒与接合作用 ① F+ ×F- →F++ F+

84 ② Hfr×F- → Hfr×Hfr ， Hfr×F- → Hfr×F-
F因子不易转入受体细胞中，故Hfr×F-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是F-。

85 ③F’ ×F-→ F’ + F’

86 四、原生质体融合（protoplast fusion）
1. 概念 通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子（fusant）的过程，称为原生质体融合。

87 2. 原生质融合的主要步骤

88 二、真核微生物的基因重组 1. 有性杂交（sexual hybridization）
杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。有性杂交，一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。

89 2. 准性杂交（parascxualhybridization）
通过同一物种两个不同菌株的体细胞发生融合，不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子。类似于有性生殖但更原始的生殖方式。 为半知菌育种提供了一个重要手段。准性生殖是在自然条件下，真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象。准性生殖包括四个过程： ①菌丝联结 ②形成异核体 ③核融合或核配 ④体细胞交换和单倍体化

90 异核体：同一菌丝有不同遗传性状的核在同一 细胞质中生长。
①菌丝联结 ②异核体形成（质配） ③核配形成杂合二倍体 ④体细胞交换和单倍体化。 异核体：同一菌丝有不同遗传性状的核在同一 细胞质中生长。 同核体：同一菌丝中只有一种核。

91 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无
项 目 准性生殖 有性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无 接合后双倍体细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同 双倍体变单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现，几率低 正常出现，几率高

92 选择亲本：以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本
准性杂交 选择亲本：以来自不同菌株的合适的营养缺陷型为亲本 强制异合：将两菌亲株的分生孢子（106~107）混合涂[-]平板，并做各单亲本对照， [-]平板上长出的菌落是异核体或杂合二倍体 移单菌落：纯化菌落，并将纯化后的菌落移入[-]斜面 验稳定性：在[-]夹层平板上培养后，再倒上一层[+]，再培养后若出现大量新菌落，说明是不稳定的异核体，反之是杂合二倍体 促进变异：用诱变剂进行处理，以促进染色体发生交换、染色体在子细胞分配不均、染色体缺失或畸变、点突变等，使分离后的子代提高增加新性状的可能 筛选：

93 Penicillum urticae 的准性杂交步骤

94 1. 菌种退化(Degeneration ) ：生产菌株生产性状的劣化、遗传标记的丢失。
第四节 菌种的衰退、复壮与保藏 一、菌种的衰退与复壮 1. 菌种退化(Degeneration ) ：生产菌株生产性状的劣化、遗传标记的丢失。 菌种退化可以是形态上的，也可以是生理上的。如产孢子能力、发酵主产物比例下降等。 退化的表现：减产；原有的典型性状变得不典型；最易察觉到的是菌落和细胞形态的改变；抗不良环境条件能力的减弱等。

95 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)的芽孢和伴孢晶体变得小而少、生长速度缓慢，产孢子越来越少；
细黄链霉菌（Streptomycesmicroflavus)“5406”在平板培养基上菌苔变薄、生长缓慢，不再产生典型而丰富的桔红色分生孢子层，有时甚至只长些浅黄绿色的基内菌丝；代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降； 赤霉素生产菌种藤仓赤霉（Gibberellafujikuroi）产赤霉素能力的下降； 枯草杆菌（Bacillus subtilis）“B.F.7658”生产α-淀粉酶能力的衰退； 白僵菌（Beauveriabassiana)对宿主致病能力的下降

96 菌种退化是发生在细胞群体中一个由量变到质变的逐渐演化过程。
首先，在细胞群体中出现个别发生负变的菌株，这时如不及时发现并采取有效的措施，而一味地移种传代，则群体中这种负变个体的比例逐渐增大，最后占据了优势，整个群体发生严重的退化。 所以，开始时，所谓“纯”的菌株，实际上其中已包含着一定程度的不纯因素。

97 遗传性变异是绝对的，它的稳定性是相对的； 退化性变异是大量存在的，而进化性变异则是个别的。
2. 菌种退化的原因 （1）基因突变 控制生产性状的基因发生负突变。 遗传性变异是绝对的，它的稳定性是相对的； 退化性变异是大量存在的，而进化性变异则是个别的。

98 （2）分离现象 遗传育种获得的菌种若是多核，或是单核但DNA双链之一发生突变，随着传代，其生产性状也将发生退化。
退化是菌种自发突变的结果，培养环境营养不良、发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化

99 同时，在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证获得菌株的“纯度”。
3. 菌种退化的防止 （1）从菌种选育时考虑 在育种过程中，应尽可能使用孢子或单核菌株，避免对多核细胞进行处理，采用较高剂量使单链突变的同时，另一条单链丧失了模板作用，可以减少出现分离回复现象。 同时，在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证获得菌株的“纯度”。

100 微生物都存在着自发突变，而突变都是在繁殖过程中发生或表现出来的，减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性。
（2）从菌种保藏角度考虑 微生物都存在着自发突变，而突变都是在繁殖过程中发生或表现出来的，减少传代次数就能减少自发突变和菌种退化的可能性。 （3）从菌种培养角度考虑 培养条件要有利于生产菌株，不利于退化菌株的生长。如控制碳源、氮源、pH和温度，避免出现对生产菌不利的环境，限制退化菌株在数量上的增加。

101 （4）从菌种管理的角度考虑 最有效的方法是定期使菌种复壮(rejuvenation)。菌种复壮：在菌种发生退化后，通过纯种分离和性能测定，从退化的群体中，找出尚未退化的个体，以达到恢复该菌种原有性状的一种措施。 广义的复壮：在菌种尚未退化之前，定期地进行纯种分离和性能测定，以使菌种的生产性能保持稳定。是一项积极的措施。

102 菌种保藏的目的：保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力，不被其它杂菌污染，形态特征和生理性状应尽可能不变异，以便今后长期使用。
二、菌种的保藏 菌种保藏的目的：保证菌种经过较长时间后仍然保持着生活力，不被其它杂菌污染，形态特征和生理性状应尽可能不变异，以便今后长期使用。 基本原理：选用优良的纯种，最好是休眠体（分生孢子、芽孢等），创造一个使微生物代谢不活泼，生长繁殖受抑制，难以突变的环境条件。 环境要素：干燥、低温、缺氧、缺营养以及添加保护剂。

103 影响微生物菌种稳定性的因素： a）变异； b）污染； c）死亡。

104

105 1. 定期移植保藏法 将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基，也可进行穿刺培养，待生长成健壮的菌体（对数期细胞、有性孢子或无性孢子）后，将菌种放置4℃冰箱保藏，每间隔一定时间需重新移植培养一次。 移种时间：芽孢杆菌3~6个月一次。其它细菌每月一次。如保藏温度高，则间隔的时间要短； 放线菌4~6℃保藏，每3个月移种一次； 酵母菌在4~6℃保藏，每4~6个月移种一次。某些种类酵母。如芽裂酵母、阿氏假囊酵母、棉病囊霉等，必须每1~2月移种一次； 丝状真菌在4~6℃保藏，每4月移种一次；担子菌4~6℃保藏，每3月移种一次。

106 缺点：保藏过程中微生物仍然有活动，所以，保藏的时间较短，菌种容易退化。采用橡皮塞代替棉塞，可以避免水分散发并且能隔氧，能适当延长保藏期。
优点：最早使用，普遍采用。在实验室和工厂中，即便同时采用几种方法保藏同一菌种，这种方法仍是必不可少的。该法简单易行，代价小，能随时观察保藏菌株是否死亡、变异、退化或染菌。 缺点：保藏过程中微生物仍然有活动，所以，保藏的时间较短，菌种容易退化。采用橡皮塞代替棉塞，可以避免水分散发并且能隔氧，能适当延长保藏期。

107 在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡，液面高出培养基1厘米，将其置试管架上以直立状态低温保藏
2. 液体石蜡保藏法 在斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡，液面高出培养基1厘米，将其置试管架上以直立状态低温保藏 优点：液体石蜡可以防止水分蒸发、隔绝氧气，延长保藏时间。 缺点：必须直立放在冰箱内，占据较大的空间。

108 3. 沙管保藏法、土壤保藏法 沙土管：取河沙过24目筛，用10~20%的盐酸浸泡除去有机质，洗涤，烘干，分装入安瓿管，加塞灭菌。需要保藏的菌株先用斜面培养基培养，再用无菌水制成细胞或孢子悬液，将10滴悬液注入装有洗净、灭菌河沙的沙管内，使细胞或孢子吸附在沙上，放到干燥器中吸干沙中的水分，将干燥后的沙管用火焰熔封管口。可以室温或低温保藏。

109 土壤法：以土壤代替河沙，不需酸洗，经风干、粉碎、过24目筛，分装灭菌后，同上制备。
特点：干燥、低温、隔氧、无营养物。保藏的效果较好，制作简单，比液体石蜡法保藏时间长。 适用对象：芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、放线菌和一些丝状真菌。 保藏时间：可达数年，甚至数十年。

110 4. 麸皮保藏法 麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌保藏。方法：将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀，加水或培养液与麸皮的比例为1:0.8或1:1或1:1.5，原则是按照不同菌种对水分要求不同而定。将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中，装入的麸皮应保持疏松，不要紧压。高温灭菌后，将菌种的孢子液接入。适宜温度下培养，直至长出菌丝。再放在干燥器中干燥后，20℃以下温度保藏。优点：操作简单，保藏时间长，不易退化。工厂中常用。

111 5. 蒸馏水保藏法 方法：每个试管中装5毫升灭菌的无菌水，用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞，接入蒸馏水中并使之悬浮，试管用无菌的橡皮塞塞紧，放置10℃低温保藏。需用时，可从管内移出一环接到培养基上，而原来的管加塞后仍可继续保藏。特点：该法为菌种创造了一个无营养的环境。适用对象：诡谲棒状杆菌（Cornebacteriuminsidiosum)、根瘤病土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)、假单孢菌（Pseudomonas sp.)等。也有人将其用于酵母菌保藏。

112 6. 冷冻干燥保藏法 将菌液在冻结状态下升华其中水分，最后获得干燥的菌体样品。它同时具备干燥、低温和缺氧的菌种保藏条件，可使微生物菌种得到较长时间的保存。冻干的菌种密封在较小的安瓿中，避免了保藏期间的污染，也便于大量保藏。它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法。但是，该法操作相对繁琐，技术要求较高。除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外，其它多数微生物，如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等都能冻干保藏。许多菌种用此法可保藏10年以上。

113 7. 液氮超低温保藏法 这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法，而其它方法又不能长期保藏，根据液氮保存精子和血液等先例的启发而发展起来的菌种保藏法。液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一。也是适用范围最广的微生物保藏法。几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏。只有少量对低温损伤敏感的微生物例外。液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏，不论孢子或菌体、液体培养物或固体培养物均可使用该法。

114 8. 甘油保藏法 该法与液氮超低温保藏法类似。菌种悬浮在10%（V/V）甘油蒸馏水，置低温（-70~-80℃）保藏。该法较简便，保藏期较长，但需要有超低温冰箱。 实际工作中，常将待保藏菌培养至对数期的培养液直接加到已灭过菌的甘油中，并使甘油的终浓度在10~30%左右。再分装于小离心管中，置低温保藏。基因工程菌常采用该法保藏。

115 三、国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种、菌株的基础上，把它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱和便于交换使用的目的。 国际上很多国家都设立了菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM） 美国典型菌种保藏中心（ATCC） 美国的北部地区研究实验室（NRRL） 英国的国家典型菌种保藏所（NCTC） 日本的大阪发酵研究所（IFO） 东京大学应用微生物研究所（IAM） 荷兰的真菌中心收藏所（CBS） 法国的里昂巴斯德研究所（IPL） 德国的科赫研究所（RKI）

116 中国微生物菌种保藏管理委员会 成立于1979年。该委员会下设六个菌种保藏管理中心，其负责单位、代号和保藏菌种的性质如下：
普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）： 中科院微生物所，北京（AS），真菌、细菌； 中科院武汉病毒研究所，武汉（AS-IV），病毒； 农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）： 中国农业科学院土壤肥料研究所，北京（ISF）；

117 工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）： 轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京（IFFI）； 医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）：
中国医学科学院皮肤病研究所，南京（ID），真菌； 卫生部药品生物制品检定所，北京（NICPBP），细菌； 中国医学科学院病毒研究所，北京（IV)，病毒； 抗生素菌种保藏管理中心（CACC）： 中国医学科学院抗生素研究所，北京（IA）； 四川抗生素工业研究所，成都（SIA）； 华北制药厂抗生素研究所，石家庄（IANP）； 兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC）： 农业部兽医药品检察所，北京（CIVBP）

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