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抗体工程研究进展 沈倍奋 军事医学科学院基础医学研究所
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13% % % %
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治疗性抗体的研发阶段 靶标发现 抗体制备 抗体筛选、确认和优化 中试工艺研究 临床前研究 临床研究
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主要研究进展 靶抗原的发现 抗体人源化改造及人源抗体制备 提高抗体效应功能 提高抗体表达量 其他
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靶抗原的发现
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TRAIL: TNF-related apoptosis-induced ligand
TRAILR: DR4、DR5、DcR1、DcR2、OPG
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Proteomics Mass Control/Healthy Spectrometer Treated/Sick
Protein extraction and digestion Peptides HPLC Mass Spectrometer Control/Healthy Treated/Sick Protein peptides KKYAAELHLV KAVQQPDGLA QFHFHWGSLDQPDGLA identification MS spectra quantification and MS/MS spectra Phosphorylation P Oxidation characterization O … post translational modifications (PTM)
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功能单抗识别表位可能是一个新的药靶？ C5a新功能表位的确定 20a5-6 Light Chain 20a5-6 Heavy Chain
20a5-6 Fab 20a5-6 Fab/C5a 20a5-6 Heavy Chain
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主要研究进展 靶抗原的发现 抗体人源化改造及人源抗体制备 提高抗体效应功能 提高抗体表达量 其他
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治疗性抗体产生抗－抗体的比例
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抗体人源化的主要技术 嵌合抗体 CDR移植, FR移植, SDR移植 表面氨基酸残基人源化 抗原表位定向选择
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嵌合抗体、CDR移植抗体
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SDR人源化方法
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表面氨基酸残基人源化 鼠抗体（红）和人源化抗体（绿）Fv结构的叠合图
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鼠源抗体/抗原作用的复合物模型 人源化抗体/抗原作用的复合物模型 人源化抗体识别的抗原表位与親本抗体相同
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L H 高亲和力人抗体 抗原亲和筛选 + 人抗体轻链文库 人-鼠抗体库 鼠抗体 人抗体重链文库 抗原表位定向选择 L H
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人源抗体制备技术 人х人杂交瘤技术 EB病毒转化技术 人源抗体库 噬菌体抗体库 合成抗体库 核糖体展示抗体库 转基因动物
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大容量抗体库 >109 抗体亲和力 抗体库容 10-8~10-9 109 10-7~10-8 108~9 10-6~10-7
107~8 108~9 抗体亲和力 10-6~10-7 10-7~10-8 109 抗体库容 >109 10-8~10-9
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合成抗体库
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核糖体展示scFv文库
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各种抗体库筛选方法
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感染性筛选
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抗原库对抗体库筛选方法
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提高抗体特异性和亲和力 Chain shuffling 计算机模建技术 定点突变技术
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chain shuffling 原理示意图 L H + L L L L H L H + L H H H H L H 亲本抗体 轻链文库
建抗体库 + L L L L H 亲和筛选 高亲和力抗体 L H 建抗体库 重链文库 + L H H H H 亲和筛选 chain shuffling 原理示意图 更高亲和力抗体 L H
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计算机模建预测抗体亲和力和识别表位 HA2 HA4 HC4 H22 Z12 -378.2 -402.5 -435.6 -434.2
结合自由能 分子间氢键 识别区域 表位是否漂移 Z12 -378.2 -402.5 -435.6 -434.2 -431.6 18 21 28 38 34 20-32 23-30,70-89 76-92 是 否
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抗体H22计算机分子设计与直接进化 抗体 分子间氢键 相互作用能（KJ） 主要识别区域 mCH22 38 -427.44 136-149
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抗体CH22m亲和常数测定 Items Antibody affinity Ka~ 6x1010L/mol B/F
[S]-[B] (10-11M) Items Antibody affinity Z Ka=8×107M /750 CH Ka=9×109M /6.5 mCH Ka=6×1010M Remicade® Ka=1×1010M /6
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移植人免疫球蛋白的小鼠
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抗体结构信息具有重要的研究价值
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本地数据库 抗体分析系统主界面 抗体专家分析系统 抗体分类 PDBView 抗体结构分析 抗体序列分析 抗体表达分析 抗体分类管理
BLAST 系统日志管理 用户权限管理 Kabat 本地数据库 抗体分类 系统参数设置 系统字典设置 外部数据接口 PDB GENE BANK Swiss-Prot TRRD KABAT 本实验室抗体数据库 抗体分析系统主界面 抗体专家分析系统
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Her2靶点人源抗体（HF)的设计与验证 抗原抗体复合物结构信息分析 人源化抗体设计、虚拟筛选 HF人源抗体基因合成、构建、表达
D4 SDS-PAGE非还原电泳 155KDa HF人源表达抗体的纯化和功能鉴定 HF人源抗体基因合成、构建、表达 人源化抗体设计、虚拟筛选 抗体专家分析系统 抗原抗体复合物结构信息分析 HF SKVO3 –Her2+++ MCF7 - Her2+ Herceptin HF人源抗体对Her2靶点的特异性识别 HF人源抗体对Her2+ +细胞的ADCC杀伤效应分析
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新抗体或抗体类似物的设计 以抗原－抗体复合物的晶体结 构设计新抗体 以人抗体Fc为支架设计类抗体 以全人抗体为支架设计小抗体
以抗原－抗体复合物的晶体结 构设计新抗体 以人抗体Fc为支架设计类抗体 以全人抗体为支架设计小抗体 以非Ig的人蛋白为支架设计功能分子
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拮抗肽－linker－Fc融合蛋白设计 PT4－Linker－FC融合蛋白的构象 PT4-Linker-FC与TNF-α相互作用复合物的构象
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抗体可变区框架作为支架 VH结构域能够保持一定的刚性； VH在空间上能够将几个短肽展示在一定的区域内；
抗体可变区骨架展示的外源肽段长度可以改变。 CDR3 CDR1 CDR2 FR FR FR FR4
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单域抗体（PTVH5）设计 PTVH5与TNF形成的复合物模型
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单链抗体（TSA1、TSA2）设计 单域抗体 单链抗体(scFv)
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主要研究进展 靶抗原的发现 抗体人源化改造及人源抗体制备 提高抗体效应功能 提高抗体表达量 其他
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提高抗体 效应功能 偶联细胞毒物质 双特异性抗体 抗体Fc突变 改变抗体糖基化 细胞内抗体 抗体融合蛋白
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抗体药物的作用机理 直接效应 诱导凋亡 抑制增殖 阻断生长因子或生长因子受体 干扰血管生成 间接效应 依赖补体的细胞毒（CDC）
直接效应 诱导凋亡 抑制增殖 阻断生长因子或生长因子受体 干扰血管生成 间接效应 依赖补体的细胞毒（CDC） 依赖抗体的细胞毒（ADCC) 作为毒素、放射性同位素和细胞 毒药物的载体 形成抗独特型抗体 通过双特异性抗体靶向效应细胞
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抗体偶联细胞毒物质
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抗体融合蛋白
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双功能抗体作用原理
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（a), BsAb桥连效应细胞和靶细胞；(b), 连接的触发分子启动细胞毒反应；(c) , 效应细胞对靶细胞产生致死性杀伤反应。
抗HER2/neu×抗CD16 BsAb BsAb HER2/neu 膜表面分子 触发受体 CD16 NK细胞 效应细胞 肿瘤细胞 靶细胞 细胞毒反应 BsAb BsAb 双特异性抗体介导的杀伤作用机制 （a), BsAb桥连效应细胞和靶细胞；(b), 连接的触发分子启动细胞毒反应；(c) , 效应细胞对靶细胞产生致死性杀伤反应。
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细胞内抗体：在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体
EGFR EGFR 细胞核 EGFR
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抗体的ADCC和CDC效应
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提高ADCC和CDC的策略 抗体Fc突变 改变抗体糖基化
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Rituximab Fc的三维结构
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Rituximab突变体与C1q的结合
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主要研究进展 靶抗原的发现 抗体人源化改造及人源抗体制备 提高抗体效应功能 提高抗体表达量 其他
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提高表达量的方法 应用扩增系统 GS/DHFR 弱化选择标记基因 应用有利于基因表达的元件 位置效应（position effects)
强启动子 强增强子 反式作用元件 位置效应（position effects)
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Cre-LoxP定点整合系统
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‘Hotspot’-taged FRT 工程细胞株 可扩增 转录活性位点 lacZ-Zeocin bla pSV40△ FRT dhfr
Genomic DNA Ori
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抗体的糖基化
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主要研究进展 靶抗原的发现 抗体人源化改造及人源抗体制备 提高抗体效应功能 提高抗体表达量 其他
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抗体可变区和框架区的影响 抗体稳定性 可溶性 折叠动力学 表达
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PEG化的抗体或抗体片段
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重组多克隆抗体
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重组多克隆抗体 优点： 可大量生产，批间稳定性好 结合抗原的亲合力高 识别多个抗原表位，对复杂靶抗原的 治疗效果好 对于易变的抗原也能有效
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谢谢
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