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尖孢镰刀菌致病相关物质β-D-葡萄糖苷酶基因的克隆与序列分析
学 号： 姓 名 ：李燕丹 指导老师：许文耀 教 授 刘 波 研究员
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主要内容 A 研究背景与选题意义 B 研究内容、研究方法与技术路线 C 拟关键问题、预期成果与创新点 D 现有工作基础、工作计划
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研究背景与选题意义 尖孢镰刀菌(Fusarium Oxysporum f.sp cubense ) 对重要基因的克隆具有重要意义。 尖孢镰刀菌致病相关物质β-D-葡萄糖苷酶 研究发现，在尖孢镰刀菌致病过程中，果胶酶(PMG、PMTE)及纤维素酶(Cx、β-葡萄糖苷酶)起着重要作用，其在镰刀菌枯萎病程中起着降解细胞壁纤维素破坏植物细胞组织的作用。
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目前国内对其他真菌产β-D-葡萄糖苷酶的研究主要集中在对纤维素转化作用的研究，对β-D-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达方面已经有较多的研究。
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实验内容 以RNA为模板，RT-PCR，RACE,克隆香蕉枯萎病菌（F.oxysporum f.sp cubense ）致病相关物质β-D-葡萄糖苷酶基因，获得基因全长cDNA。 以DNA为模板，PCR,克隆香蕉枯萎病菌（F.oxysporum f.sp cubense ）致病相关物质β-D-葡萄糖苷酶基因，获得基因序列。 序列分析。
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技术路线 尖孢镰刀菌 总RNA提取 DNA提取 RT-PCR PCR 引物设计 RACE及拼接 克隆测序 克隆测序 基因全长cDNA序列
BLAST比对近缘种β-D-葡 萄糖苷酶基因序列 DNA提取 RT-PCR PCR 引物设计 RACE及拼接 克隆测序 克隆测序 基因全长cDNA序列 基因全长cDNA序列 基因序列 β-D-葡萄糖苷酶基因结构分析
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RNA为模板的克隆实验步骤 1. 菌株RNA提取 按照TRIZOL试剂盒提取RNA。
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2.RT-PCR以及RACE RNA为模板的克隆实验步骤
RT-PCR合成中间产物：按照 TAKAR PCR Kit(AMV)Ver3.0说明书操作，采用兼并引物进行扩增。 RACE： 3/RACE：GeneRaceTM Kit，按中间产物基因序列设计正向引物。 5/RACE：BD SMART RACE cDNA Amplication Kit，按3/端扩增产物序列设计反相引物。 全长序列拼接：将上面获得的中间、3/端、5/端片段进行序列拼接，比较分析，去掉重复序列，得到全长cDNA。
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RNA为模板的克隆实验步骤 3.克隆并测序 回收目的片段 与克隆载体连接 转化至感受态细胞 单菌落PCR筛选阳性克隆 测序分析
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回收PCR产物，连接，转化，筛选，测定基因序列
DNA为模板的克隆 根据近缘物种，设计兼并引物 用尿素提取法 DNA提取 PCR 回收PCR产物，连接，转化，筛选，测定基因序列 基因序列 克隆测序 上海英俊生物技术有限公司
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序列分析 利用DNAstar和Clustal软件进行序列拼接和分析。
序列分析的结果通过国际互联网进行序列同源性检索，检索主程序采用BLASTN和BLASTX，序列分析在NCBI进行。
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可能存在的关键性问题及其解决途径 ⑴β-D-葡萄糖苷酶基因兼并引物的设计
从NCBI上寻找与尖孢镰刀菌近缘性生物的β-D-葡萄糖苷酶氨基酸序列，设计兼并引物。 对策：下载多个不同种的序列，设计多种引物。 ⑵以DNA为模板时扩增不出目的片段 设计的兼并引物，不能扩增出目的片段。 对策：先进行RNA为模板，RT-PCR，RACE，扩增出基因全 长cDNA，设计特异性引物。再以DNA为模板设计合成引物并进行PCR。
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预期成果 获得全长基因序列 克隆β-D-葡萄糖苷酶基因 进行有效的序列分析
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创新点 从尖孢镰刀菌克隆到β-D-葡萄糖苷酶基因，为进一步研究β-D-葡萄糖苷酶的致病分子机制奠定基础。
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现有工作基础 在本实验室曾经成功地进行淡紫拟青霉几丁质酶基因的克隆。
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工作计划 08年7月-08年09月 查阅资料，构思论文题目； 08年9月-08年12月 查找资料，确定论文题目，撰写开题报告，准备材料；
08年7月-08年09月 查阅资料，构思论文题目； 08年9月-08年12月 查找资料，确定论文题目，撰写开题报告，准备材料； 09年1月-09年12月 β-D-葡萄糖苷酶基因克隆，序列测定； 09年12月-10年6月 基因结构分析数据分析，开始撰写论文，并准备答辩。
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