植物基因工程 史仁玖.

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1 植物基因工程 史仁玖

2 植物基因工程技术主要应有：提高农作物的抗逆能力（如抗除草剂，抗虫，抗病，抗干旱和抗盐碱等），以及改良农作物品质和利用植物生产药物等方面

3 抗虫转基因植物 大量使用化学农药严重污染环境，损害人类健康，大大增加了生产成本。
原理：从某些生物中分离出具有杀虫活性基因，将其导入作物中，使其具有杀虫性。 杀虫的主要基因：Bt毒蛋白基因（转基因抗虫棉），蛋白酶抑制剂基因，淀粉酶抑制剂基因，植物凝集素基因等。

4 已问世转基因抗虫植物：水稻，棉，玉米，马铃薯，番茄，大
豆，蚕豆，烟草，苹果， 核桃，杨，菊花和百花 三叶草等。

5 抗病转基因植物 病原微生物：引起植物生病的微生物 主要有病毒，真菌和细菌等
已获得的抗病转基因植物：抗烟草花叶病毒的转基因烟草和抗病毒的转基因小麦，甜椒，番茄等

6 抗病转基因植物所采用的基因：病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因
抗真菌转基因植物所采用的基因：几丁质酶基因和抗毒素合成基因

7 抗逆转基因植物 环境条件对农作物的生产会造成很大的影响。例如，盐碱、干旱、低温、涝害等不利的环境条件，是造成低产、减产的常见因素。目前，全球的盐碱和干旱地区分别占的面积的1/3，还有许多地区属于高寒地区。这些不利的环境也会对农业生产造成影响。 由于盐碱和干旱对农作物的危害与细胞内渗透压调节有关，目前科学家们正在利用一些可以调节细胞渗透压的基因，来提高农作物的抗盐碱和抗干旱的能力，这在烟草等植物中已获得了比较明显的成果。

8 抗逆转基因植物 例如，将鱼的抗冻蛋白基因导人烟草和番茄，使烟草和番茄的耐寒能力均有提高。此外，将抗除草剂基因导人大豆、玉米等作物，喷洒除草剂时，杀死田间杂草而不损伤作物。

9 利用转基因改良植物的品质 科学家将必需氨基酸含量较多的蛋白质编码基因，导入植物中，或者改变这些氨基酸合成途径中某种关键酶的活性，以提高氨基酸的含量。例如，我国科学家将富含赖氨酸的蛋白质编码基因导入玉米，获得的转基因玉米中赖氨酸的含量比对照的含量比对照提高30%。

10 利用转基因改良植物的品质 提高植物的光合作用效率
改造光合作用中起关键作用的CO2固定酶，能提高植物对CO2的固定效率；还可以通过增强植物对光能吸收与转化的功能来提高光合作用效率，提高作物的产量。

11 利用转基因改良植物的品质 提高观赏价值

12 （一）、转基因生物的概念 转基因生物：将一种生物的基因导入另一种生物, 定向改造生物,定向改造生物,使之向着有利于人类需要的方向发展。
世界第一例转基因植物---烟草1983年在美国问世。1986年,首批转基因植物--抗虫和抗除草剂棉花进入田间试验。1992年中国成为世界上第一个转基因植物商品化种植的国家，开创了转基因植物商品化应用的先河；当时种植的是一种抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒双价转基因烟草。

13 植物外源基因转化 方法及检测

14 一、 植物细胞培养技术 植物细胞培养：单个细胞经过培养，通过愈伤组织器官分化或体细胞胚胎分化途径再生出完整的植株。
植物组织培养：不同来源的外植体或不同器官经过培养也可以形成完整的植物。

15 二、植物转基因技术的基本路线 1）分离目的基因 2）将目的基因与载体连接，形成重组DNA 3) 利用细菌繁殖扩增重组DNA
5）筛选转化细胞，并诱导产生转基因植株 6）转基因植株大规模种植

16 三、 转基因的受体系统 1）植物组织受体系统 受伤的组织，愈伤组织等，再生植株无性系变异较大，稳定性差。 2）植物细胞原生质体系统 原生质体在体外较易进行遗传操作，细胞融合，容易捕捉外源基因。难度大。

17 三、 转基因的受体系统 3）生殖细胞受体系统 生殖细胞如花粉细胞、卵细胞为受体细胞。单倍体培养作为受体，或直接在生殖细胞受精时进行基因转化。生殖细胞作为受体具有更强的接受外源DNA的潜能。 4）叶绿体转化系统 叶绿体作为植物受体系统进行基因转化有许多优点：①便于外源基因定位整合，②基因为多拷贝，表大量高，③导入的外源基因性状稳定高、安全性好，④能直接表达原核基因。

18 植物基因转化的受体 原生质体 悬浮细胞 胚性愈伤组织 胚状体 叶片切块
其它受体：如花、子房、离体条件下的子叶、胚轴、茎段、根和体细胞胚、花粉等

19 四、外源基因导入植物的方法 1. DNA直接转移法 1）化学刺激法
PEG、PNA、磷酸钙、氯化钙等化学试剂等处理原生质体，可使其捕获外源DNA。 2）电击法 在适当的外加电压下，细胞膜可能被击穿，使得外源DNA容易进入细胞内。原生质体不受伤害，而且膜孔可恢复。 3）显微注射法 借助显微注射仪，将外源DNA通过机械方法直接注射到受体细胞。 4）基因抢法 基因枪法，也称微粒轰击法，是将DNA包被到金粒或钨粒中，然后把这些粒子加速推进靶细胞。优点是转化受体迅速简单、取材广泛，不受基因型限制，金属微粒的喷射面广，植株可育性高，转化频率高等。

20 四、外源基因导入植物的方法 5）脂质体介导法
是将DNA或RNA包裹于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合导入细胞。转化效率较高，简单易操作，重复性好。 6）微激光束法 利用激光微束脉冲引起细胞膜可逆穿孔，从而将外源DNA导入受体细胞。 7）花粉通道法 将外源DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，外源DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化不具备细胞壁的受精卵，合子或早期胚体细胞。

21 2. 载体介导法 1）农杆菌介导法 2）植物病毒DNA介导法

22 植物转基因的方法 外源基因的间接转化法（载体介导法） 农杆菌介导法 病毒介导法 外源基因的直接转化法
化学诱导DNA直接转化:PEG 介导转化方法和脂质体法 物理法诱导DNA直接转化 :基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法等 花粉管通道法介导基因转化（种质系统介导法） 花粉管通道法、生殖细胞浸染法、胚囊和子房注射法等

23 转化载体的构建 E.Coli转化，质粒 抽提与鉴定 农杆菌的转化与活化 浸 染 选择培养 共培养 移栽 继代繁殖 生理检测 纯化
目的基因的克隆与鉴定 转化载体的构建 E.Coli转化，质粒 抽提与鉴定 农杆菌的转化与活化 外植体制备 浸 染 选择培养 共培养 移栽 继代繁殖 分子检测 生理检测 纯化

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25 载体介导的转化方法----农杆菌介导法 农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方法。
它是利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti (Tumer induce)质粒和发根农杆菌(Agrobaterium rhizogenis)的Ri (Root induce)质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染植物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并插入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的遗传转化特性,可将外源基因置换T-DNA中的非必需序列即可使外源基因整合到受体染色体而获得稳定的表达。80％以上是利用根癌农杆菌转化系统产生。

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27 农杆菌: used extensively for genetic engineering of plants.
包含Ti质粒 Tumor inducing plasmid (bacterial plasmid) T-DNA (Transferred-DNA), 可以转移进入植物基因组. Tumor induced by A. tumefaciens

28 症状

29 番茄（左）和橄榄（右）

30 桃（左）和卫矛（右）

31 圆叶葡萄（左）和向日葵（右）                               

32 农杆菌附着在植物细胞表面

33 生物学特性 农杆菌细胞呈杆状，革兰氏染色呈阴性。 根癌农杆菌广泛存在于双子叶植物中，一般认为，单子叶植物对农杆菌无敏感性。 根癌农杆菌分为章鱼碱型、胭脂碱型 琥珀和农杆碱型。

34 Ti Plasmid 已知农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。T-DNA首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞。

35 根癌农杆菌（Ti质粒） T－DNA区 Ti质粒是约200-800kb的环状DNA分子，Ti质粒具有四个主要功能区域，它们分别是
质粒转移(plasmid transfer) T－DNA区 复制原点(ori) 毒性区域(vir)。

36 Ti质粒的构成 T－DNA区：农杆菌感染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，该DNA片断上的基因与肿瘤的形成有关。 Vir区(virulence region) ：该区段上的基因能激活T－DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称为毒区。 Con区（encoding cojugations region）：该区段上有着与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。 Ori区（origin of replication）：该区段基因调控Ti质粒的自我复制，称为复制起始区。

37 T-DNA上共含有tms、tmr和tmt 3 套基因。
tms基因组由iaaH和iaaM 2 个基因组成，控制由色氨酸产生生长素吲哚乙酸的生物合成途径； tmr 基因组中的iptZ 负责由异戊烯焦磷酸和AMP 合成分裂素的反应；

38 tmt 基因的编码产物可催化合成冠瘿碱(Opines)。冠瘿碱的代谢产物为氨基酸和糖类，是根癌农杆菌生长必需的物质，供根癌农杆菌作为营养使用。此外，
在T-DNA 的两端还含有左右2 个边界，左边界(left border, LB)和左边界(right border, RB)是长为25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。

39 野生型Ti 质粒的改造和中间载体的构建 Ti 质粒是植物基因工程的一种天然载体。但野生型Ti 质粒不能直接用作克隆外源基因的载体。
②野生型Ti 质粒上分布着各种限制型核酸内切酶的多个酶切位点，不论用何种限制型核酸内切酶切割，都会切成很大片段。而且即使在T-DNA 上也很难找到可利用的单一的酶切位点；

40 ③T-DNA上的tms和tmr 基因产物将干扰受体植物内源激素的平衡，导致冠瘿瘤的产生，阻碍转基因植物细胞的分化和植株的再生；
④冠瘿碱的合成过程消耗大量的精氨酸和谷氨酸，直接影响转基因植物细胞的生长代谢； ⑤野生型Ti 质粒没有大肠杆菌(Escherichia coli)的复制起点和作为转化载体的选择标记基因。

41 对野生型Ti质粒的改造，主要包括以下几个方面：
①删除T-DNA上的tms、tmr和tmt基因； ②加入大肠杆菌复制起点和选择标记基因，构建根癌农杆根瘤菌-大肠杆菌穿梭质粒，便于重组分子的克隆与扩增； ③引入植物细胞的筛选标记基因，如细菌来源的新霉素磷酸转移酶II基因(neomycin phosphotransferase II, NPT II)等，便于转基因植物细胞的筛选；

42 ④引入植物基因的启动子和polyA化信号序列；
⑤插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆。 ⑥除去Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度。

43 为利用根癌农杆菌的Ti 质粒，发展了一元载体系统和双元载体系统。
一元载体系统就是指含有目的基因的中间表达载体与改造后的受体Ti 质粒通过同源重组所产生的一种复合型载体，通常又称为共整合载体(co-integrated vector)； 双元载体(binary vector)系统是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的系统。 目前以T-DNA转化植物细胞的标准方法大多采用Ti 质粒介导的双元载体系统。

44 共整合质粒 （1）首先构建中间载体，如将大肠杆菌pBR322质粒带上一段与Ti质粒T区同源的一个片段，它在大肠杆菌和农杆菌中均能复制；
（2）将目的基因插入该片段的适当位置，使目的基因两端带上与Ti质粒T-DNA同源的DNA序列； （3）然后将该质粒通过转化或接合引入含有Ti质粒的农杆菌中。 （4）引入的衍生质粒和原细胞中Ti质粒具同源性，因而可产生无性配对重组，通过交换，可将目的基因转到Ti质粒上，使之产生真正的具有外源基因的Ti质粒，称共整合质粒。

45 共整 合 载 体

46 双元载体 （1）双元载体，也称反式载体，是指由两个分别含T-DNA和Vir相容性Ti质粒构成的双质粒系统。
（2）其中之一含有为T-DNA转移所必须的Vir区的质粒，另一个则是含有T-DNA区段的寄主范围广泛的DNA转移载体质粒，后一种质粒较小，可在大肠杆菌中复制，因而易操作，可用来插入外源基因。 （3）两种质粒同时存在时可恢复T-DNA的转移功能。

47 双元载体系统:binary Ti vector system

48 从伤口侵入 根癌农杆菌一般生活在植物的根上或根周围，利用植物根组织分泌物作为营养存活，它们仅仅通过伤口侵染，不管是天然的伤口还是在种苗移植或农事操作时留下的伤口，这种对伤口的要求能够在实验室中很容易地得到证明。

49 Ti 质粒的转化机理 植物根部损伤部位分泌－－酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮－－诱导Ti 质粒上的vir基因＋根癌农杆菌染色体上的一个操纵子表达－－vir 基因产物将Ti 质粒上的T-DNA 单链切下＋根癌农杆菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA 结合形成复合物－－转化植物根部细胞

50 整个过程大致可分为以下几个步骤： ①根癌农杆菌对植物细胞的识别和附着； ②根癌农杆菌对植物信号物质的感受； ③根癌农杆菌Ti 质粒上的vir 基因以及染色体上操纵子的活化； ④T-DNA 复合体的产生； ⑤T-DNA复合体的转运； ⑥T-DNA整合到植物基因组中。

51 转化过程

52 叶盘转化法(leaf dish transformation)
是Monsanto公司Morsch等人(1985)建立起来的一种转化方法。该方法的优点是适用性广且操作简单，是目前应用最多的方法之一.步骤： 1.首先用打孔器从消毒叶片上取下直径为2--5mm 圆形叶片，即叶盘。 2.再将叶盘放入培养至对数生长期的根癌农杆菌液浸泡几秒钟，使根癌农杆菌浸染叶盘。

53 3.用滤纸吸干叶盘上多余的菌液，将这种经浸染处理过的叶盘置于培养基上共培养2～3d，再转移到含有头孢霉素或羧苄青霉素抑菌剂的培养基中，除去根癌农杆菌。与此同时在该培养基中加入抗生素进行转化体的筛选，使转化细胞再生为植株。 4.对这些再生植物进行分子检测就可确定它们是否整合有目的基因及其表达情况。

54 原生质体共培养转化法 原生质体共培养转化法是以原生质体作为受体细胞，通过将根癌农杆菌与原生质体作短暂的共培养，然后洗涤除去残留的根癌农杆菌后，置于含抗生素的选择培养基上筛选出转化细胞，进而再生成植株。与叶盘转化法相比，此法得到的转化体不含嵌合体，一次可以处理多个细胞，得到相对较多的转化体。 应用此法进行基因转化时，其先决条件就是要建立起良好的原生质培养和再生植物技术体系。

55 整株感染法 人为地在植株上造成创伤，然后把含有重组质粒的根癌农杆菌接种在创伤面上，或把含有重组质粒的根癌农杆菌注射到植物体内。使根癌农杆菌在植物体内进行浸染实现转化。

56 农杆菌的活化

57 挑单 克隆

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60 测OD600

61 收集 细胞

62 用液体MS培养基重悬细胞

63 将预培养的外植体放入菌液中共培养

64 100rpm, 30min

65 取出外植体在无菌滤纸上吸干菌液

66 共培养

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68 在含有选择压力的培养基上诱导细胞分化，形成转化芽

69 诱导芽生长

70 生根，形成转化植株

71 病毒介导法 病毒载体是最近新出现的一种用于植物转化的载体“植物病毒转基因系统是将外源基因插入到病毒基因组中,通过病毒对植物细胞的感染而将外源基因导入植物细胞。目前正在研究发展的植物病毒载体系统有3种: 单链RNA植物病毒载体系统,是以单链RNA为模板经反转录酶作用合成双链的cDNA,将其克隆到质粒或粘粒载体上,把外源基因插入到病毒的cDNA部分,通过体外转录,将带有外源基因的病毒DNA感染并进入植物寄主细胞。

72 单链DNA植物病毒载体系统,是由单链环状DNA分子组成,一般存在成对的2个病毒颗粒，这种二连基因组可以把外源基因插入其中1种DNA上而不影响另1种DNA基因组的复制。

73 病毒载体比较小,便于在实验中操作,而且这类载体只要与植物细胞共培养就可以较高地感染植物细胞,外源基因能在植物细胞中快速复制和高水平表达。
但是病毒载体的容量有限,不能包装大片段的外源DNA基因组,寄主范围窄,复制稳定性差,转录和复制机理复杂。

74 目前,用的较多的是花椰菜花斑病病毒(CaMV)和番茄金花叶病毒(TGMV)。此法需要注意的是其他病毒侵染植株后可能会跟所用的载体病毒之间发生信息交换,进而导致载体病毒重新获得其致病能力”因此,其潜在的危害性必须予以足够的重视。

75 DNA直接导入基因转化 农杆菌介导基因转化分子机制的阐明打开了利用自然的基因转化载体系统的大门，并已取得可喜的成果。DNA直接导入法一度被冷落，但有趣的是，发展到分子时代又回过头来重新利用先进的分子生物技术研究DNA直接导入的转化方法。这是由于农杆菌载体转化系统对单子叶植物的局限性所迫。 所谓DNA直接导入转化就是不依赖农杆菌载体和其他生物媒体，将特殊处理的裸露的DNA直接导入植物细胞，实现基因转化的技术。常用的DNA直接转化技术根据其原理可分为化学法和物理法两大类。

76 DNA直接导入基因转化 农杆菌介导基因转化分子机制的阐明打开了利用自然的基因转化载体系统的大门，并已取得可喜的成果。DNA直接导入法一度被冷落，但有趣的是，发展到分子时代又回过头来重新利用先进的分子生物技术研究DNA直接导入的转化方法。这是由于农杆菌载体转化系统对单子叶植物的局限性所迫。 所谓DNA直接导入转化就是不依赖农杆菌载体和其他生物媒体，将特殊处理的裸露的DNA直接导入植物细胞，实现基因转化的技术。常用的DNA直接转化技术根据其原理可分为化学法和物理法两大类。

77 化学诱导DNA直接转化 化学诱导DNA直接转化是以原生质体为受体，借助于特定的化学物诱导DNA直接导入植物细胞的方法。目前主要有2种方法：PEG介导法和脂质体介导法。 PEG介导基因转化 脂质体介导基因转化

78 PEG介导基因转化 PEG法的主要原理是化合物聚乙二醇、多聚L-鸟氨酸、磷酸钙及高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。
PEG通过电荷之间的相互作用,与DNA形成紧密复合物,植物细胞通过内吞作用吸收这些复合物，一般PEG浓度较低时,不会对原生质体造成伤害,而获得的转基因植株来自同1个细胞,避免了产生嵌合转化体,转化稳定性和重复性好,容易选择转化体，受体植物不受种类的限制，但对原生质体培养和再生困难的植物难以利用,且转化率低,一般在10-5~10-6。

79 PEG这种方法首先用在模式植物烟草上,转导象Ti质粒那样比较大的质粒。在添加PEG和外源DNA时,人们已成功地将外源基因整合到原生质体基因组,并得到表达，利用原生质体的全能性,目前此种方法已在多种禾谷类作物如水稻，大麦，玉米及一些双子叶植物中获得了转基因植株。

80 脂质体介导基因转化 脂质体法是用脂类化学包裹DNA成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把内含物转入受体细胞。
脂质体是由磷脂组成的膜状结构,用它包装外源DNA分子,然后与植物原生质体共保温,于是脂质体与原生质体膜结构之间发生相互作用,而后通过细胞的内吞作用而将外源DNA导入植物的原生质体.

81 这种方法具有许多方面的优点,包括可保护DNA在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用,降低了对细胞的毒性效应,适用的植物种类广泛,重复性高,包装在脂质体内的DNA可稳定地贮藏等。

82 物理法诱导DNA直接转化 物理转化方法是基于许多物理因素对细胞膜的影响，或通过机械损伤直接将外源DNA导入细胞。它不仅能够以原生质体为受体，还可以直接以植物细胞乃至组织、器官作为靶受体，因此比化学法更具有广泛性和使用性。常用的物理方法有电激法、超声波法、显微注射法和基因枪法。

83 电激法介导基因转化 电激法是利用高压电脉冲作用在原生质体膜上“电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。此法在动物细胞中应用较早并取得很好效果，现在这一方法已被广泛用于各种单、双子叶植物中，特别是在禾谷类作物中更有发展潜力。

84 电激法介导基因转化 电击的处理方式对转化率有着决定性的作用，有两种不同的处理方式：一种是较低的电压，处理较长的时间（350V/cm 54s）；另一种是高电压，短时间处理（1－1.25kV/cm,10s)。一般常用第二种处理方式。

85 电击法的转化效率与化学法相似。它除了同样具有PEG原生质体转化的优点外，还具有操作简便，DNA转化效率高，特别适于瞬时表达的研究。缺点是造成原生质的损伤，且仪器也较昂贵。

86 超声波介导基因转化 超声波基因转化的基本原理是利用低声强脉冲超声波的物理作用,击穿细胞膜造成通道,使外源DNA进入细胞。
操作过程：取无菌的试管苗中部展开的叶片，切成小块，并在叶片上针刺若干小孔，放入超声小室中。同时加入5%DMSO缓冲液3ml，质粒DNA20μg/ml 及鲑鱼精DNA40μg/ml ，室温下超声处理30分钟。

87 超声波所特有的机械作用，热化作用和空化作用，穿透力大，在液体和固体中传播衰减小，界面反射造成叶片组织受超声波作用的面积较大等特点，可能是高效短暂表达和稳定转化的重要原因，这些特点使该方法有以下优点，操作简单，设备便宜，不受宿主范围限制，转化率高等。与其他方法相比具有更大的潜力，但该转化系统尚待进行深入研究，使之完善。

88 显微注射介导基因转化 显微注射进行基因转化是一种比较经典的技术，其理论和技术方面的研究都比较成熟。特别在动物细胞或卵细胞的基因转化，核移植及细胞器的移植方面应用很多，并已取得重要成果。植物细胞的显微注射在以前使用很少，但近年来发展很快，并在理论技术上有所创新。

89 显微注射介导基因转化 其原理比较简明，是利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体细胞质或细胞核中。显微注射的一个重要问题是必须把受体细胞进行固定。 转化的成功率高 可以省去选择性标记的麻烦

90 基因枪法 基因枪法又称微弹射击法。 其基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的DNA进入细胞后整合到植物染色体上得到表达，从而实现基因转化。 是继农杆菌介导法之后的第二大基因转化法。 在禾本科作物上应用较广泛。

91 基因枪转化的操作步骤 靶细胞或组织的预处理 微粒子弹的制备 装备基因枪 轰击 过渡培养 进行筛选培养或直接分化再生植株

92 PDS-1000 | He System

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94 便携式基因枪

95 基因枪法转化的优点有： 无宿主限制：农杆菌介导法只对双子叶植物敏感，限制了它的应用范围。而基因枪没有物种限制。 靶受体类型广泛：可以是原生质体，叶片，悬浮细胞，茎或根切段，种子胚，愈伤组织，花粉等。 操作简单快速

96 但该方法转化率低，由于基因枪轰击的随机性，外源基因进入宿主基因组的整合位点相对不固定，拷贝数往往较多，这样转基因后代容易出现突变、外源基因容易丢失，容易引起基因沉默等现象的发生，不利于外源基因在宿主植物的稳定表达。 而且基因枪价格昂贵、运转费用高。

97 花粉管通道法 花粉管通道法是将外源的DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，使外源DNA沿花粉管通道进入胚囊，转化受精卵或其前后细胞。这一技术可以应用于任何开花植物。该方法是我国科学家周光宇等（1983）建立并在长期科学研究中发展起来的。

98 花粉管通道法 微注射法：一般适合于较大花的农作物如棉花等。利用微量注射器将基因溶液注射进入受精子房
柱头滴加：在授粉前后，将转基因溶液滴加在柱头上 花粉粒携带：即用基因溶液处理花粉粒，让花粉粒吸入基因，然后授粉。

99 优点：利用整体植株的卵细胞、受精卵或早期胚细胞转化DNA，无需细胞、原生质体等组织培养和诱导再生植株等一套人工培养过程。方法简便；单、双子叶植物均可应用；育种时间短。

100 常用植物基因转化方法特点比较 转化方法 农杆菌法 PEG法 电击法 微针注射法 基因枪法 花粉管通道法 受体材料 完整细胞 原生质体 卵细胞
宿主范围 有 无 有性繁殖植物 组培条件 简单 复杂 嵌合体比例 多 操作复杂性 设备要求 便宜 昂贵 工作效率 高 低 单子叶植物应用 少 可行 广泛

101 植物基因转化系统的选择原则 对农杆菌敏感的植物应首先试用农杆菌载体转化系统，因为农杆菌转化是在理论和技术操作上都比较成熟的转化系统，而且转化效率高，转化植株的遗传稳定性最好。 原生质体培养容易的植物应该选择直接转化系统，因为其优点是既能获得高的转化率，又能克服转基因植株嵌合体的难题。

102 多胚珠植物可试用花粉管通道法，因为涂抹在柱头上的外源DNA可以随着许多花粉管进入子房，分别导入各卵细胞中，提高转化率。

103 转化难度大的植物，即对农杆菌转化不敏感，原生质体培养困难的植物，应采用基因枪法。
根据供试外植体的特点选择相应的转化方法，如以整体植株为试材，则应采用注射法和花粉管通道法；以叶片为外植体，则应用农杆菌载体叶盘法或基因枪法。

104 转基因植物的检测鉴定方法 报告基因的表达检测 转基因植物的PCR检测 外源基因整合的Southern杂交鉴定
外源基因转录的Northern杂交检测 外源基因表达蛋白的检测 生物学鉴定

105 转基因植物的检测鉴定 进行基因转化后，外源基因是否进入植物细胞，进入植物细胞的外源基因是否整合到植物染色体上，整合的方式如何，整合到染色体上的外源基因是否表达，这一系列问题仍需回答。只有获得充分的证据后才可以认为被检材料是转基因的。

106 转基因生物的鉴定 一、个体水平鉴定 个体水平上鉴定利用遗传学和育种学方法，即种植或诱导转化体表现其性状特征或生理特征。

107 转基因生物的鉴定 二、细胞和组织水平鉴定 报告基因：指其编码产物能够被快速的测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）,并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。 一个理想的报告基因，最基本的要求是在转化的寄主细胞中应不存在相应的内源等位基因的活性，其表达产物不仅不会损害寄主细胞，而且应该快速、灵敏、定量和可重复的检测特性。

108 报告基因的表达检测 1. 抗生素抗性基因： npt, 新霉素磷酸转移酶基因，对卡那霉素、G418，巴龙霉素及新霉素等具有抗性；
aphIV, 潮霉素磷酸转移酶基因，对潮霉素具有抗性； spt, 链霉素磷酸转移酶基因，对链霉素具有抗性； cat, 氯霉素乙酰转移酶基因，使氯霉素丧失抗菌素活性。 Aacc3和aacc4, 庆大霉素3－N-乙酰转移酶基因，对庆大霉素有抗性； ble，博来霉素抗性基因，对博来霉素有抗性。

109 报告基因的表达检测 2. 抗除草剂抗性基因 bar, 编码膦化麦黄酮乙酰转移酶（PAT），使PPT（膦化麦黄铜）的自由氨基乙酰化而对PPT解毒。抗除草剂草丁膦和双丙氨膦； epsps, 草甘膦抗性标记基因，抗草甘膦； als；绿黄隆抗性标记基因。

110 报告基因的表达检测 3. 显色或发光报告基因： （1）GUS酶活性检测
GUS使β－葡萄糖苷酶，能催化裂解一系列的葡萄糖苷，产生一系列具有发色基团或发荧光的物质，可用分光光度计、荧光计或组织化学法对GUS活性进行定量和空间定位分析，检测方法简单灵敏。 （2）荧光素酶活性检测 荧光素酶催化的底物使6－羟基喹啉类似物，在镁离子、ATP及氧的作用下酶使底物脱羧，生成激活态的氧化荧光素，发射光子后，转变成常态的氧化荧光素。 （3）绿色荧光蛋白检测 GFP产生绿色荧光蛋白，在395nm和490nm的波长下发出独特的绿色荧光。

111 1、新霉素磷酸转移酶（NPT-Ⅱ）基因 目的 ：检测Npt-Ⅱ基因在植物组织中的表达
原理： Npt-Ⅱ使ATP分子上的Ύ-P转移到抗生素分子上，影响抗生素与核糖体的结合，从而使抗生素失活。检测时使用放射性标记的[Ύ-32P ]ATP，通过Ύ-磷酸基团转移，生成放射性的卡那霉素来检测。 检测方法：点渍法，层析法，凝胶原位检测法 Npt- Ⅱ提取物 + [Ύ-32P ]ATP→ 32P磷酸化的卡那霉素→放射自显影

112 2、氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因 CAT基因是由大肠杆菌易位子Tn9所编码的，它可以催化乙酰CoA转乙酰基到氯霉素分子的某些基团。 CAT 基因 —乙酰氯霉素 CoA ＋ 氯霉素 —乙酰氯霉素 氯霉素失效 3—乙酰氯霉素 氯霉素可选择性地与原核细胞核糖体50S亚基结合，抑制肽酰基转移酶的活性，从而阻碍肽键的形成，使蛋白质合成受到抑制，最终抑制植物的生长。而乙酰化的氯霉素就会失去与核糖体50S亚基结合的能力，所以携带有CAT基因的转基因植株就具有了对氯霉素的抗性。

113 检测： cat基因活性可以通过反应底物乙酰CoA的减少或反应产物乙酰化氯霉素的生成来测定，常用的方法有硅胶G薄层层析法及DTNB分光光度法。 缺点：信号没有NPT-II强 优点：克服了受体细胞非特异性酶本底较高的缺点，且CAT酶定量分析很准确。

114 3．潮霉素磷酸转移酶（HPT） 潮霉素的生物学功能是与70S和80S核糖体结合，从而抑制生物蛋白质的合成，最终导致生物生长受到抑制。
HPT酶能催化ATP上的γ-磷酸基因转移至潮霉素分子上，磷酸化的潮霉素就失去了抗生素的抗性，因而携带有Hpt基因的转化体就会表现出对潮霉素的抗性。

115 4、β-葡萄糖酸苷酶（GUS）基因 的检测 gus基因编码 ß-葡萄糖苷酸酶，该酶是一种水解酶，能催化许多ß-葡萄糖苷酯类物质的水解。
检测常用底物有3种： 5-溴-4-氯-3-吲哚-ß-D-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc） 4-甲基伞形酮酰- ß-D-葡萄糖醛酸苷酯（4-MUG） 对硝基苯-ß-D-葡萄糖醛酸苷（PNPG） 检测方法： 组织化学染色定位法 荧光法测定GUS活性 分光光度法测定GUS活性

116 X-gluc————————————————→ 蓝色物质 (5-溴-4-氯-3-吲哆葡萄糖醛苷酸) （5，5’-二溴-4，4’-二氯靛蓝）
GUS X-gluc————————————————→ 蓝色物质 (5-溴-4-氯-3-吲哆葡萄糖醛苷酸) （5，5’-二溴-4，4’-二氯靛蓝）  4-MUG MU（4-甲基伞形酮）＋β-D-葡萄糖醛酸 （4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸） GUS 荧光物质 优点： （1）GUS基因的检测十分简单、方便和灵敏。 （2）绝大多数植物中没有检测到该酶的背景活性。 （3）GUS基因还可用来进行嵌合基因的构建和分析。

117 5、荧光素酶（LUC）基因 来源：北美荧光虫和叩头虫的cDNA文库中克隆 功能：LUC基因所编码的荧光素酶是生物体催化自身发光的一种蛋白质。该酶在有ATP、Mg2+、O2和荧光素存在的条件下可发射出荧光，荧光持续数秒到数分钟即消失，可用微光测定仪检测到非常微弱的荧光素酶分子。

118 荧光素酶基因是一个灵敏的报告基因,检测的灵敏度比CAT高100倍,而且没有背景，
荧光素酶基因的最大特点是不损害植物,即在整体植物或离体器官内,基因产物都可测定， 但荧光素酶基因产物易在过氧化物酶体中积累,在植物体内产生光的部位不一定能反映荧光素酶基因的特定表达部位。

119 荧光酶素基因的检测 优点：（1）LUC测定灵敏度非常高 荧光素酶可以催化生物体自身发光。
检测方法：取被检材料置小容器内，加入适量的组织培养液体培养基、ATP、荧光素，置暗室中放置，用肉眼观察荧光。 优点：（1）LUC测定灵敏度非常高 （2）LUC检测法成本低 （3）免于放射性同位素检测对人体健康和生态环境所造成的危害 （4）该酶的活性不需要转录后修饰，无二硫键，不要求辅酶因子 和结合金属，因此可以在几乎所有的宿主细胞中表达。

120 6、绿色荧光蛋白（GFP）基因 绿色荧光蛋白是一些腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白。生物荧光素蛋白是指存在于生物体内，能在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。它可与目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表达了解目的基因表达情况。 功能：GFP Cdnad开放阅读框架长度约740bp，编码238个氨基酸残基，其肽链内部第65～67位丝氨酸-脱氢酪氨酸-甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基团，在长紫外波或蓝光照射下发出绿色荧光。

121 gfp基因的检测 检测方法：可在荧光显微镜或流式细胞仪中直接观察基因的表达。
对于转化细胞可用蓝光照射，在显微镜下分拣发出强烈绿色荧光的细胞。对于转化植株，可在激发光照射下利用解剖照相系统进行绿色荧光蛋白检测和定位。

122 7、抗除草剂Basta（bar）基因 除草剂Basta（膦丝菌素），它是L-谷氨酸的类似物，能够抑制谷氨酰胺合成酶的活性，从而使植物体的积累大量的氨，最终导致植物死亡 bar基因是从链霉菌中分离出来的，具有抗除草剂的功能。 机理：bar基因编码的膦丝菌素乙酰转移酶会使得Basta部分乙酰化，从而解除了Basta的毒性。这样，如果转基因植物中转入了bar基因，就会使植株表现出对除草剂Basta的抗性。

123 转基因植物的PCR检测 PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达到ng水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺序。这项技术可用于转化后外源基因的鉴定和植物基因组的分析 但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩增，因而对外源基因是否整合需要进行扩增产物的Southern杂交。

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126 外源基因整合的Southern杂交鉴定 Southern杂交技术是1975年发明）
原理：利用两条单链DNA的碱基互补性，来检测外源DNA的转化结果 DNA水平的鉴定 检测内容：是否整合、拷贝数、整合位置。 Southern杂交(外源目的基因序列为探针)

127 Southern杂交法的步骤 提取转基因植物的DNA 限制性内切酶消化 琼脂糖凝胶电泳 碱性溶液中使DNA解离成单链
与探针杂交 洗膜 显影

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130 特异性PCR检测外源基因整合到受体

131 外源基因转录的Northern杂交检测 通过Southern杂交可以得知外源基因是否整合到植物染色体上。但是，整合到染色体上的外源基因并不一定表达。 转基因植株中外源基因的转录水平可以通过细胞总RNA或mRNA与DNA探针的杂交来分析，称Northern杂交。它是 RNA-DNA异质双链杂交。 步骤同Southern杂交法 mRNA水平

132 Northern blot hybridization
应用举例 3kb 0.4 kb Nt 3638 2604 623 28S 18S RNA琼脂糖凝胶电泳 Northern blot hybridization

133 Northern blot 杂交分析mRNA的表达
GAPDH 0d 2d 4d 6d 8d 靶 mRNA Northern blot 杂交分析mRNA的表达

134  1%琼脂糖RNA电泳

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136 外源基因表达蛋白的检测 外源基因编码蛋白在转基因植物中能够正常表达并表现出应有的功能是植物基因转化的最终目的。表达蛋白应具有一定的稳定性，不被细胞内的蛋白酶迅速降解，同时应对植物细胞无毒性。 外源基因表达蛋白检测主要利用免疫学原理，ELISA及Western杂交是经典的方法。

137 Western杂交 是将外源基因转录并翻译的蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶中转移至固相支持体上，然后对固定化蛋白质进行免疫学测定，是根据蛋白质（抗原）可以和该蛋白质的特异抗体相结合的原理而进行的。 蛋白质区带-----抗体（同位素标记） 蛋白质水平

138 图 缺氧过程中大鼠大脑皮质线粒体COXⅠ、 Ⅳ的Western Blot 显色结果

139 Far Western blot of FTZ polypeptides expressed in bacteria

140 生物学鉴定 表型鉴定 稳定性鉴定 最终鉴定 抗病 抗虫 抗除草剂 花色改变 品质改良

141 改进转基因的技术 一、转基因植物中外源基因的沉默
所谓植物转基因沉默，是指导入并整合到受体植物细胞核基因组上的外源基因，在当代或后代转基因植株中的表达活性受到抑制的现象。

142 1.位置效应 位置效应是指转基因在寄主染色体基因组上插入部位及其周围的核苷酸组成对转基因表达活性的影响。 2. DNA甲基化 转基因植物中DNA甲基化却严重影响了转基因的正常表达。

143 3.重复序列诱发基因沉默 4.共抑制 共抑制是指在外源基因沉默的同时，与其同源的内源基因的表达也受到抑制。 共抑制属于转录后抑制。转录后水平基因沉默的特点是，外源基因能够转录成mRNA但不能积累

144 二、 提高外源基因表达水平的策略 1.改进转化方法 重复序列容易引起基因沉默。 如采用农杆菌介导法产生的拷贝数相对较少，可以在一定程度上避免这个问题。 2.选择强启动子和诱导型启动子

145 部分用于植物遗传转化的组织特异性启动子 表达组织 启动子来源 目的植物 作者 花药 烟草Ta29 烟草 油菜 Mariani （1990）
种子 菜豆植物凝集素基因PHA-L 烟草 Altabella （1990） 叶片 PEPC （Pepcarboxylase Gene of Maize） 玉米 Kozial （1993） 韧皮部 水稻蔗糖合酶基因RSs1 Shi （1994） 果实 ovary tissue （patent） 番茄 Martineau （1995） 胚乳 玉米淀粉合酶基因GBS Russell （1997） 根系 发根农杆菌的rolD启动子 Varvara （2001） 髓部 玉米pGL2 水稻 Datta （1998） 部分用于植物遗传转化的组织特异性启动子

146 3.强终止子 在植物遗传转化中，最常用的终止子是CaMV35S终止子和根瘤农杆菌T－DNA胭脂氨基酸合成酶的nos终止子

147 4. 使用植物偏爱的密码子 使用植物偏爱密码子,减少DNA甲基化 5.使用基质结合区序列 细胞核基质 结合区(matrix attachment region MAR) 是真核细胞核去除核小体中核心蛋白与连接蛋白后，牢固地附着在细胞核基质上的大量伸展成环状结构域的DNA 。

148 6.使用增强子 7.外源基因的修饰与改造 （1）避免基因间的同源性 （2）避免重复序列的出现 （3）在载体上增加增强翻译序列和核糖体结合位点 8. 以叶绿体作为转化受体

149 植物基因工程的应用 抗病基因工程 抗虫基因工程 抗除草剂基因工程 抗逆境基因工程 提高果实耐贮性和切花寿命基因工程
提高产量和改良品质基因工程 提高生物活性物质基因工程 生产药用物质物因工程

150 1 抗病虫害转基因植物 1）抗虫转基因植物 全球每年作物因虫害造成的损失约占总产量的13%，而目前对作物害虫的防治主要依赖于化学农药，它不仅造成了严重的环境污染，而且给人类的健康带来巨大的威胁。基因工程技术的发展为培育抗虫作物、增加作物产量提供了广阔的前景。目前已有多种途径获得抗虫转基因植物，包括利用苏云金杆菌的δ-内毒素基因、蛋白酶抑制剂基因、外源凝集素基因、α-淀粉酶抑制剂基因和几丁质酶基因等转化植物细胞获得抗虫转基因植物。

151 苏云金杆菌是革兰氏阳性细菌，在芽孢的形成过程中能产生大量的拌胞晶体，拌胞晶体主要由130 kD的δ-内毒素蛋白组成。多数苏云金杆菌能同时产生几种不同的晶体蛋白（cryproteins），每种蛋白均有高度特异的杀虫活性。 δ-内毒素被昆虫摄食后进入昆虫中肠，在消化酶的作用下将原毒素降解为60kD具有毒性的多肽，毒素结合到中肠上皮细胞特异性的受体，导致细胞膜穿孔、细胞肿胀裂解，最后细胞死亡。 Bt毒素对哺乳动物无毒害作用，被广泛地用来构建抗虫转基因作物。

152 蛋白酶抑制剂转基因植物 蛋白酶抑制剂发现于1938年，其成分为6460 kD的多肽或蛋白质，它广泛存在于植物中。
蛋白酶抑制剂能与昆虫消化道的蛋白消化酶结合，形成酶-抑制剂复合物，从而阻断或降低蛋白酶对外源蛋白的水解作用，导致外源蛋白不能被正常消化。同时酶-抑制剂复合物也能刺激昆虫分泌过量的消化酶，引起昆虫厌食反应。此外，蛋白酶分子还能通过消化道进入血液和淋巴系统，干扰昆虫的蜕皮过程和免疫功能，影响昆虫的正常发育。 植物中存在丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂等

153 植物凝集素转基因植物 植物凝集素（lectin）是一种糖蛋白或结合糖的蛋白质，存在于多种植物中，特别是富含于植物种子和储藏器官。
昆虫摄取含凝集素的食物后，植物凝集素与昆虫肠道食膜上的糖配体结合，从而影响营养物质的吸收。 目前成功用于植物抗虫基因工程的凝集素基因有雪花莲凝集素基因、豌豆凝集素基因、麦胚凝集素基因、半夏凝集素基因等。Gatehous等报道，将雪花莲凝集素基因转移到马铃薯中可以延缓桃蚜的发育期，降低其生殖力并抑制种群的生长。

154 淀粉酶抑制剂转基因植物 α-淀粉酶抑制剂（α-amylase inhibitor）广泛存在于植物种子和块茎中，尤其是在豆类和禾本科植物种子中含量丰富。它能抑制昆虫消化道淀粉酶的活性，使昆虫摄入的淀粉无法消化和水解，从而阻断昆虫的能量来源，最终导致昆虫发育不正常或死亡。 Schroeder等将菜豆的α-淀粉酶抑制剂基因与种子特异表达的菜豆植物血凝素基因的调控序列组合在一起，转化豌豆后能正常表达，且对豆象甲虫等害虫有明显的抗性。 Altabella等将该基因转移到烟草中，也获得了能稳定表达的转基因植株，淀粉酶抑制剂能在种子中积累，体外实验表明，它对黄粉虫α淀粉酶具有显著的抑制作用。

155 2） 抗病毒转基因植物 植物病毒病害已成为植物病害的最大类群之一，随着基因工程技术的发展，为培育抗病毒的植物品种开辟了新的途径。目前已有多种方法获得抗病毒转基因植物。 利用植物自身编码的抗病毒基因培育抗病毒植物。 病毒外壳蛋白转基因植物 病毒复制酶转基因植物。 移动蛋白转基因植物。植物病毒系统侵染宿主包括两个重要的过程，病毒通过胞间连丝在细胞间移动和通过微管束系统在组织器官间的移动。 核糖体失活蛋白转基因植物

156 3） 抗真菌转基因植物 植物对真菌等病害微生物的防御主要包括机械防护和生物学保护两个方面。当致病菌入侵植物时，植物细胞壁的结构发生变化，细胞壁的强度和硬度增加。另一方面，植物细胞被诱导合成多种活性物质如硫堇、抗毒素和几丁质酶等，以抑制真菌的生长和入侵。

157 几丁质酶转基因植物 几丁质酶（chitinase）广泛存在于植物和微生物中，它能降解几丁质，该酶一般由单基因编码。
几丁质是许多植物病原真菌细胞壁的主要成分，因而利用几丁质酶转基因植物在防治植物真菌病害中有重要意义。几丁质酶对真菌的抑制作用是通过水解菌丝尖端新合成的几丁质而发挥的。正常的植物中几丁质酶的活性很低，但当病原真菌侵染植物时能诱导产生很高的几丁质酶活性。 Broglie等将菜豆几丁质酶的cDNA与CMV 35S启动子重组，导入烟草和番茄中，转化株对立枯丝核菌的抗性显著提高

158 植物抗毒素转基因植物 植物抗毒素是植物对病原真菌侵染抵抗所产生的有毒性低分子化学物质。不同的植物可产生不同的抗毒素，
目前已从不同的植物中鉴定了200多种植物抗毒素，它们大多数是类黄酮与类萜类物质。病原真菌对非寄主植物抗毒素比较敏感，植物抗毒素的合成和积累与植物的抗病性密切相关。 抗毒素3,4,5-三羟芪（stibene）存在于花生、葡萄等植物中，将合成该抗毒素的关键酶3,4,5-三羟芪合成酶基因克隆并导入烟草中，转化株对病原菌的抵抗能力大大提高

159 2 抗逆转基因植物 植物的生活周期中会遇到各种各样不利环境条件如盐碱、旱、寒和热等的挑战，面对这些不利的逆境，植物只能通过机体自我调节而生存下去。随着基因工程技术的发展，人类可以有目的地改造生物的特性，使之能在某些恶劣的环境下生存，从而为解决人类的生存与环境问题提供新的途径。

160 1）抗盐转基因植物 土壤盐碱化是影响农业生产的重要问题之一，全球盐碱地约占陆地面积的1/3，在我国15亿亩耕地中约有1亿亩为盐碱地，此外还有5亿多亩为盐碱荒地。土壤盐渍化是限制植物生长、导致农作物减产的重要因素。 植物的耐盐是在一系列酶的调节下而发挥作用的，这些酶或蛋白分别参与植物的渗透调节、离子区域化和离子的选择吸收。参与植物细胞内渗透调节的是一类小分子有机化学物如脯氨酸、甜菜碱等，这些小分子的合成酶是耐盐相关基因研究的一个重点。

161 2）抗旱转基因植物 世界上有近三分之一的地区属于干旱地区，即使在雨水充足的地方也会经常出现短期缺水的现象，干旱给全球农业和林业带来了严重危害。随着全球气候的变化，干旱和沙漠化现象也越来越严重，并已经威胁到人类的生存和发展。 脯氨酸是一种主要的渗透调节物质，在植物体中它可由谷氨酸转变而来，其中的一个关键酶即’二氢吡咯-5-羟酸还原酶催化脯氨酸的最后形成，将麦脯氨酸合成酶基因克隆并转移到烟草中，转化株能在高渗透势的溶液中生活，表明转化株可在相对缺水的条件下生活。

162 3）抗冻转基因植物 培育耐寒和抗冻的植物品种是一种抗冻得最佳选择。
抗冻蛋白（antifreeze protein, AFP）是一种能降低冰点和减少冰晶生长速度的蛋白质，在许多生物包括动物和植物中都存在抗冻蛋白。 目前研究的最多的是鱼类动物的抗冻蛋白，生活在两极的海洋鱼类主要靠血液中的AFP来降低体液的冰点，以防止因体液冻结而死。

163 4）抗除草剂转基因植物 在大田中杂草能与农作物争夺空间、阳光和各种养分，导致农作物减产。发达国家每年使用化学除草剂的费用高达百亿美元，然而除草剂对农作物的生长会造成一定的影响，这就限制了除草剂的应用。 解决除草剂对作物的伤害可从两方面考虑：一是使用对作物伤害较小的除草剂，二是将抗除草剂的基因导入作物中。 将矮牵牛花的EPSPS cDNA重组到CaMV 35S启动子控制下的表达载体中并导入矮牵牛细胞中，转化的愈伤组织中EPSPS的含量增加了20-40倍，由愈伤组织再生的转基因植株在施加高浓度草甘膦的田间实验中全部成活并能生长到成熟，而对照株在施加除草剂后十多天就全部死亡。

164 3 药用转基因植物 目前许多蛋白类药物是通过微生物发酵和动物细胞培养等方法获得的，其成本高，产量远不能满足市场的需要。利用转基因植物为生物反应器生产蛋白类药物和疫苗是解决这一问题的一条较好途径。利用转基因植物已生产出动物抗体、疫苗、生长因子和生长激素等多种具有药用价值的蛋白或多肽。 转基因植物表达抗体：抗体IgG1及其Fab基因片段导入拟南芥和烟草中，结果都得到了表达。 转基因植物表达疫苗：利用转基因烟草表达出乙肝疫苗、疟疾孢子虫抗原、霍乱和腹泻疫苗等，利用转基因马铃薯表达乙肝病毒表面抗原等，利用转基因番茄表达狂犬病毒糖蛋白和天花病毒表面抗原等，利用转基因香蕉表达乙肝病毒表面抗原等。

165 4 转基因植物食品 随着全球人口不断增加，人口过多与粮食相对不足的矛盾越来越突出，如何提高粮食的产量以满足人类不断增长的需要是新世纪农业面临的重要问题。另一方面，随着人们生活水平的不断提高，人们越来越关注食物的口味、口感、和营养价值等因素。这些实际需要为植物基因工程的发展提供了广阔的空间，另一方面，植物基因工程也为提高作物产量、改良作物品质提供了一条崭新的途径

166 5 其它转基因植物 抗早衰转基因植物。植物叶片是进行光合作用的器官。叶片的过早衰老会引起作物产量和质量的严重下降，利用基因工程技术，使转基因植物抑制乙烯的合成或促进细胞分裂素的合成，可达到延缓植物衰老的结果。 改变花色、花型的转基因植物。色素决定花的颜色，花冠中色素主要为黄酮类色素。3,5-羟氧化酶基因是编码合成蓝色色素花翠素的关键酶，将该基因转移到蔷薇等不含该酶的切花植物中，使得转基因植株开放蓝色的花朵。

167 谢 谢