Alpha-lipoic acid protects cardiomyocytes against hypoxia/reoxygenation injury by inhibiting autophagy （LA通过抑制自噬保护心肌细胞抵御H/R的损伤） Cao X, Chen A, Yang P,

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1 Alpha-lipoic acid protects cardiomyocytes against hypoxia/reoxygenation injury by inhibiting autophagy （LA通过抑制自噬保护心肌细胞抵御H/R的损伤） Cao X, Chen A, Yang P, Song X, Liu Y, Li Z, Wang X, Wang L, Li Y. Biochem Biophys Res Commun Nov 29;441(4): doi: /j.bbrc Epub 2013 Nov 9. 2011级生物科学 胡斯琪

2 1.Introduction LA 冠心病 再灌注疗法 I/R损伤 H/R模型 自噬
治疗 冠心病 再灌注疗法 副作用 体外模型 I/R损伤 H/R模型 LA通过抑制自噬保护心肌细胞抵御H/R的损伤 增 强 保护剂 推测 抑制 LA 自噬 目的：（1）探究LA在心肌细胞的H/R时的保护作用。（2）确定在心肌细胞H/R时，LA和自噬的关系。

3 （1）冠心病 冠心病,包括严重的冠状动脉综合征是近年来一种高发病率和高死亡率的疾病，再灌注(reperfusion)疗法能有效的避免心肌梗塞和心力衰竭，并达到治疗该病的目的。但该疗法有一个严重的副作用，即引起缺血/再灌注损伤 （ischemia/reperfusion (I/R)），严重时甚至可以导致组织坏死和病理性心肌重构。所以有必要研究出一种方法使心肌免受I/R的损伤，从而使该疗法能更好的发挥作用。

4 （2）自噬 自噬指细胞通过捕获并消化自身胞质成分来调整细胞适量、品质及组织构成的生物学过程。研究发现，自噬与心脏疾病有很大关系，譬如I/R，自噬程度由局部缺血程度来控制，但是在I/R中，发现细胞的自噬行为是增强的。

5 （3）H/R Hypoxia/reoxygenation (H/R)，即细胞的缺氧/复氧模型，它是模拟I/R损伤的很好的体外模型。H/R通过氧化产物和线粒体损伤而产生炎症性细胞因子从而激活炎症的信号通路而对细胞造成损伤。近年来的研究发现，自噬在H/R中有重要作用，但是关于自噬水平的上调能否增强或减弱细胞生存力，还存在争议。

6 （4） LA alpha lipoic acid（1, 2-dithiolane-3-pentanoic acid）即硫辛酸，是一种存在于线粒体的酶，类似维他命，能消除加速老化与致病的自由基，是具脂溶性与水溶性的万能抗氧化剂。LA具有抗氧化和抗炎症的性能，近年来其在体外及临床试验中（包括I/R损伤中的)抗氧化性受到广泛关注，因此，它可以作为心血管疾病治疗的保护剂。研究发现，LA可以抑制自噬。

7 2.Abstract 模型：H/R缺氧/复氧模型是研究心肌细胞在缺血/再灌注时自噬的分子机制和功能的很重要的体外模型。
LA介绍：LA在心血管疾病的病因学（病理学）中起了很大的作用。 自噬与I/R关系：自噬与心肌的I/R损伤有很大关系。 实验方法：我们从以下几个方面来研究用LA预处理后的H9c2 细胞在H/R条件下的自噬水平：Beclin-1, LC3II/LC3I,和绿色荧光蛋白标记的LC3的表达量。用透射电子显微镜观察细胞中的自噬泡。 结果：用LA预处理可以抑制自噬程度并增强了细胞的存活率和减少了细胞的死亡总数。 结论：LA通过抑制自噬保护心肌细胞抵御H/R的损伤。

8 细胞被分为四组来研究: control:H9c2细胞在含氧量正常且未加LA的条件下培养。 LA：H9c2细胞在含氧量正常情况下加LA培养。 H/R：H9c2细胞被4h缺氧接着3h复氧处理。 LA + H/R：H9c2细胞在用300μM的LA处理后再经过4h缺氧以及3h复氧处理。

9 3.Results 3.1 LA通过抑制细胞死亡来保护细胞免受H/R的损伤
Fig.1 四组不同处理的H9c2 细胞在倒置相差显微镜下的形态。 可以观察到：对照组和LA组的细胞多为正常的梭型；而H/R组则出现大量空泡状细胞，细胞的存活率大大减少；相比H/R组，用LA预处理的H/R组的空泡数量大大减少，细胞存活率也显著增强。

10 3.2 LA能减弱H/R引起的细胞死亡数 Fig.2 图A：膜联蛋白V FITC/PI染色法量化的评估LA的抗凋亡作用。完整细胞为V−/PI−（左下象限），早期凋亡细胞为V+/PI−（左上象限），晚期凋亡细胞为V+/PI+（右上象限），坏死的细胞为V−/PI+（右下象限）。图B：流式细胞仪统计细胞死亡率图。 对照组和LA组表现正常的凋亡效应；H/R组的细胞死亡率明显增大；而用LA预处理组相比H/R组，死亡率明显下降。

11 3.3 LA增强H/R时细胞的存活率 Fig.2 图C MTT法鉴定的细胞存活率
由图可知：对照组和LA组细胞生存力几乎相同，H/R组细胞的生存力表现为明显的下降，LA预处理的组则显著的增强了细胞的生存力

12 3.4 LA降低了H/R时自噬标志产物的表达量 Fig.3 图A：用Western blotting 法测定自噬标志蛋白Beclin-1, LC3II 和 LC3I的表达量。图C和D:Beclin-1 和LC3-II/LC3-I 的表达量柱状图。 可以发现：对照组和LA组的自噬相关蛋白的表达量无明显差别，而H/R组的Beclin-1 和LC3-II/LC3-I 的表达量显著上调，但用LA预处理组的细胞中这些蛋白的表达量则明显下降。 说明当细胞在H/R条件下时，自噬程度会变大，用LA预处理后，自噬程度下降。 control LA+H/R control LA H/R LA H/R LA+H/R

13 3.5 LA抑制H/R时GFP-LC3融合蛋白的转移
Fig.3 图B：用荧光共聚焦显微镜观察染色（染料：Alexa Fluor 488，绿色斑点可代表自噬小体）后LC3B的量。图E：GFP-LC3蛋白量柱状图。 由图可知：GFP-LC3蛋白在对照组和LA组无明显差别，而在H/R组显著增加，在LA预处理组则明显下降。

14 3.6 LA抑制H/R时自噬小体的形成 Fig.4 图A：用透射电子显微镜（TEM）观察到的自噬小体数量。图B：自噬小体数量柱状图。
TEM观察到多数自噬小体都有双层或多层膜边界，并被线粒体或其他细胞器环绕。对照组和LA组自噬小体形态数量均差不多，而H/R组的自噬小体则显著变多，用LA预处理组的自噬小体数量相比H/R组则显著减小。

15 4.Discussion 4.1 研究意义：首次探究了LA在H9c2细胞的H/R损伤中的心肌保护作用，并推测其潜在机制可能为抑制自噬作用。
4.2 主要发现：（1）LA在H9c2细胞的H/R损伤中增强了细胞生存力并降低了细胞死亡率。（2）LA预处理组相比H/R组显著降低了自噬标志蛋白和GFP-LC3蛋白的表达。（3）LA在H9c2细胞的H/R损伤时抑制了自噬小体的形成。

16 4.3 总结实验过程及与其他研究对比 LA单独使用时并不影响细胞生存力 LA在心肌的缺血/再灌注中起到保护心脏的作用
4.3.1LA在心肌细胞H/R时的作用 在心肌细胞的H/R时，LA可能起到有利于心肌细胞（存活）的作用

17 H/R组的Beclin-1 和LC3-II/LC3-I 的表达量显著上调，但用LC预处理组的细胞中这些蛋白的表达量则明显下降。
4.3.2 探究LA是怎样调控H/R诱导的自噬 H/R组的Beclin-1 和LC3-II/LC3-I 的表达量显著上调，但用LC预处理组的细胞中这些蛋白的表达量则明显下降。 LA在人胶质瘤细胞中可以抑制三氧化二砷导致的自噬

18 GFP-LC3融合蛋白在H/R组显著增加，在LA预处理组则明显下降（相比H/R组）。

19 4.4 summary LA在H9c2细胞的H/R损伤中通过抑制自噬的程度从而增强细胞的生存力并降低细胞的死亡率。
LA通过抑制自噬的途径保护心肌细胞抵抗H/R的损伤。

20 4.5 展望 其潜在机制尚未研究清楚，后续可研究其调控的信号通路。
实验的不足：（1）实验所用的细胞系可能不是最理想的模型。（2）MTT法并不能准确分辨坏死和凋亡的细胞。（3）实验结果仅仅建立在体外实验的基础上，并没有进行体内实验。

21 5 我的理解 实验中所用的western的图不太完美，可以多做几次实验取最好的图。
设计实验时可加设“用自噬的抑制剂处理后测四组细胞的自噬效率”的实验。这样论据可能更充分。 实验中LA的处理方法是参考其他文献上而来的，可能对得到更好的实验结果有影响，可加设“梯度稀释及梯度培养选取最合适的LA量和作用时间”的实验。