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第三章 细胞生物学研究方法 第一节、细胞形态结构的观察方法 第四节、用于细胞生物学研究的模式生物 第二节、细胞组分的分析方法
第三节、细胞培养、细胞工程与显微操作技术 第四节、用于细胞生物学研究的模式生物
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第一节 细胞形态结构的观察方法 一、 光学显微镜技术（light microscopy）
第一节 细胞形态结构的观察方法 一、 光学显微镜技术（light microscopy） 二、电子显微镜技术 (Electro microscopy) 三、扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope )
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第二节 细胞组分的分析方法 离心分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性
放射自显影技术 定量细胞化学分析技术
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第三节 细胞培养、细胞工程 与显微操作技术 一、细胞的培养 二、细胞工程
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一、光学显微镜技术（light microscopy)
1、普通复式光学显微镜技术 2、荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） 3、激光共焦扫描显微镜技术 （Laser Confocal Microscopy） 4、相差显微镜（phase-contrast microscope） 5、微分干涉显微镜 （differential interference contrast microscope, DIC） 6、录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy）
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二、 电子显微镜技术 电子显微镜的基本知识 主要电镜制样技术 扫描电镜 （Scanning electron microscope，SEM）
电镜与光镜的比较 电镜与光镜光路图比较 电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术 超薄切片技术 负染色技术与金属投影 覆膜与冰冻蚀刻技术 电镜三维重构技术 扫描电镜 （Scanning electron microscope，SEM）
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三、 扫描遂道显微镜 Scanning Probe Microscope,SPM (80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器)
包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等 原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如 量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等， 并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。 装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。 特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。 （侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.01nm）； （2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息； （3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。 （4）可连续成像，进行动态观察 用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。
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利用扫描隧道电子显微镜观察到的DNA分子
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普通复式光学显微镜技术 光镜样本制作 分辨率是指区分开两个质点间的最小距离
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荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）
荧光显微镜的原理 荧光显微镜的应用 直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位：绿色荧光蛋白
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Green Fluorescence protein，GFP
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This photograph was made with white light with no exciter filter and no barrier filter.
This photograph was made with both the blue exciter filter and yellow barrier filter in place. This photograph was made with the NightSea blue exciter filter in place, but no barrier filter, The fluore-scence of the border appears pink and the center blue-green, and blue light is reflected from all other surfaces.
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利用GFP进行的蛋白质的 基因工程化改造
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直接荧光标记技术 利用直接荧光标记技术进行样品的观察，需要对样品进行荧光染色。标记荧光素的样品在荧光显微镜下经过不同波长的激发光激发后会发生不同颜色的荧光。 常用的荧光染料有以下几种： rhodamine，受到黄绿光激发后发红色荧光 Fluorescein，受到蓝光激发后发绿色荧光 Texas red，受到激发后发红色荧光 Cy3，受到激发后发橙色荧光
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间接免疫荧光标记技术 由于直接荧光标记后样品产生的荧光强度较弱，同时无法特异性地显示细胞内生物大分子，因此在此基础上发展起了间接免疫荧光标记技术。通过荧光标记的抗体与细胞内特异分子的结合来显示这些生物大分子在细胞中的分布。
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利用较短波长的光使样品受到激发产生较长波长的荧光，用来观察和分辨样品中产生荧光物质的成分和位置，这种显微镜称为荧光显微镜。
根据激发光的路径不同，可将荧光显微镜分为透射式和落射式两种类型。
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激光共焦扫描显微镜技术 （Laser Scanning Confocal Microscopy）
原理 应用： 排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率，可重构样品的三维结构。
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相差显微镜（phase-contrast microscope） 将光程差或相位差转换成振幅差，可用于观察活细胞 。
微分干涉显微镜（differential-interference microscope） 偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器。 录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy） 计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动。
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原理 : 暗视野显微镜是利用特殊的聚光器使照射到标本的光线不能直接进入物镜，而由聚光镜周围斜射到标本上，使标本的表面产生散射光，通过目镜进入眼中，因此在黑暗的视野中呈现明亮的像。这种特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高，用以观察未经染色的活体或胶体粒子 。
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利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化
电镜与光镜的比较 显微镜 分辨 本领 光源 透镜 真空 成像原理 LM 200nm 100nm 可见光（ ） 紫外光 （约200nm) 玻璃透镜 不要求真空 利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化 TEM 0.2nm 电子束 （ nm） 电磁透镜 要求真空 1.33x10-5～1.33x10-3Pa 利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差
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电镜与光镜光路图比较
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电子显微镜的基本构造 电子枪 阳极 聚光镜 样品室 物镜 中间镜 投影镜 观察窗 荧光屏
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主要电镜制样技术 超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备过程 负染色技术（Negative staining）与金属投影
超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备过程 超薄切片的要求 电镜样品的染色 负染色技术（Negative staining）与金属投影 复膜与冰冻蚀刻技术（Freeze etching）(技术示意图） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。 三种常见电镜样品染色技术的比较 电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。
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电镜样品的染色 电镜图像的反差实质上电子密度的差异，它是由于样品不同部分之间电子散射能力的差异所产生的。
由于生物样品主要由C、N、O等元素构成，这些元素原子序数低，散射电子的能力较弱，在电子散射能力上没有明显的差异，因此需要经过染色来增加样品的反差。利用重金属盐进行染色后，不同的结构成分上吸附不同数量的重金属原子，结合重金属较多的区域具有较强的电子散射能力，在电镜下呈现为电子密度的黑色，反之亦然。
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超薄切片的要求 细胞的精细结构保存完好； 切片的厚度应在50nm左右，较薄的切片分辨率好，但反差较差，较厚的切片分辨率差，但反差较好；
切片应耐受电子束的强烈轰击，包埋介质不发生变形或升华； 切片应具有良好的反差； 切片均匀。
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扫描电子显微镜 扫描电镜的原理 电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。
CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题
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离心分离技术 用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心：分离密度不同的细胞组分 密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离
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二、 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法
利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。
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DNA特异性的显示方法 多糖的显示方法 脂类物质的显示 细胞中各种酶的显示
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DNA特异性的显示方法 Feulgen反应：
利用酸水解去除细胞中的RNA，仅保留DNA，并且除去DNA嘌呤脱氧核糖核酸的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露，所暴露出的自由醛基与希夫试剂反应呈紫红色。
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多糖的显示方法 PAS（过碘酸希夫氏）反应
利用过碘酸的强氧化作用破坏糖分子的C—C键，使糖分子氧化产生双醛基，自由的醛基与希夫试剂作用形成紫红色产物。
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脂类物质的显示方法 对脂类物质的染色应用的是物理的扩散原理。苏丹类染料是脂溶性染剂，它溶于酒精但更易溶于脂肪，所以当含有脂肪的标本与苏丹染料接触时，它会脱离酒精而溶于脂类结构中从而显色。
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细胞中各种酶的显示方法 由于酶易受外界条件影响而变性失活。因此对酶的显示一般采取间接的方法进行，对可以与酶发生特异性结合的底物进行染色从而达到显示酶的目的。因此在实验的过程中需在尽量保持酶的活性。
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三、特异蛋白抗原的定位与定性 利用免疫学方法进行胞内蛋白质定位的原理 细胞外蛋白质的分析
免疫荧光技术： 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 （图） 免疫电镜技术：免疫铁蛋白技术 、免疫酶标技术、免疫胶体金技术 细胞外蛋白质的分析 蛋白电泳(SDS-PAGE) 免疫印迹反应(Western-Blot)
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细胞内对于蛋白质分子的定位技术包括免疫荧光、免疫印迹以及免疫电镜等，这些技术都是基于免疫学中抗原抗体特异性反应的原理而设计的。将抗体分子上加上不同的可供识别的标记，从而显示出某种蛋白质在细胞内的分布和定位。 抗原抗体 特异性结合 抗原 免疫荧光标记 免疫酶标记
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四、细胞内特异核酸的定位与定性 用核酸探针确立特殊核苷酸序列在染色体上或在特殊类型细胞中的位置的方法称为原位杂交技术(in situ hybridization)。 把凝胶电泳分离开的DNA片段，通过扩散或电泳转移到硝酸纤维素膜上，做成一个凝胶的复制品，这个过程叫做印迹。将硝酸纤维素膜与带有放射性标记的探针杂交，通过放射自显影就可以辨认出与探针互补的特殊的核苷酸序列。 利用标记的DNA探针检测某一特定的DNA序列的方法称为Southern blot，检测特定RNA序列的方法称为Northern blot。 PCR技术和DNA测序方法
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五、放射自显影技术 利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究； 实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。
原理及应用： 利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究； 实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。 步骤： 前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记） ———放射自显影
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六．定量细胞化学分析技术 细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）
利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括：紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法 流式细胞仪（Flow Cytometry） 主要应用： 用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量； 测定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； 分离DNA含量不同的中期染色体。
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一、细胞的培养 动物细胞培养 原代培养细胞（primary culture cell） 传代培养细胞（sub-culture cell）
细胞株（cell strain） 正常二倍体，接触抑制 细胞系（cell line） 亚二倍体，接触抑制丧失 组织培养的意义 植物细胞 类型： 原生质体培养 （体细胞培养） 单倍体细胞培养（花药培养）
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细胞培养的意义 可以在离体条件下观察研究细胞生命活动的规律； 观察细胞对于各种生物活性物质的反应；
通过细胞培养可以获得大量性状相同的细胞，是一种良好的实验材料。
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将动、植物细胞或组织从机体内取出分散成单细胞悬液，给予必要的生长条件，让其在培养基上继续生长繁殖的过程。
细胞培养： 将动、植物细胞或组织从机体内取出分散成单细胞悬液，给予必要的生长条件，让其在培养基上继续生长繁殖的过程。 动物细胞培养的基本过程： 取材 分离细胞 选择相同类型的细胞 贴壁培养 传代
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原代培养：从机体取出后立即进行的细胞培养。
传代培养：原代培养的细胞在生长一定时间以后，就会由于营养成分的消耗、代谢产物的积累以及接触抑制等因素而停止生长，因此必需将细胞传到新的培养瓶中去使其继续生长。
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细胞株：原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞生长出现停滞，但有极少数细胞可能渡过危机而传下去，这些细胞一般又可顺利传代40-50代，并且保持染色体的二倍体数量及接触抑制的行为。这种传代细胞称为细胞株。 细胞系：由细胞株传至50代后又出现危机不能再传下去，但是如果有部分细胞发生了遗传突变就有可能在体外培养的条件下无限制地传下去。这些细胞具有癌细胞的特点，这种传代细胞称为细胞系。细胞系的特点是染色体发生明显变化，失去接触抑制的特性。 实验室中常用的细胞系
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实验室中几种常用的细胞系 名称 类型 来源 3T3 成纤维细胞 小鼠 Hela 宫颈癌上皮细胞 Henrittal Lacks BHK21
叙利亚仓鼠 PtK1 上皮细胞 袋鼠 L6 成肌细胞 大鼠 PCI2 嗜铬细胞 SP2 浆细胞 SP2/0 骨髓瘤浆细胞 CHO 卵巢细胞 中国地鼠
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二、细胞工程 细胞工程是一种在细胞水平上运用细胞生物学 和分子生物学的方法改变生物遗传性状的生物工程。
细胞融合(fusion)与细胞杂交(hybridization)技术 单克隆抗体（monoclone antibody）技术 细胞拆合与显微操作技术 其它技术 遗传分析（mutant, knock out, knock in）
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石蜡切片的制作过程 取材 固定 冲洗 脱水 透明 包埋 切片 老化 脱蜡 复水 染色 透明 镜检
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为什么要对生物样品进行染色 由于生物组织是无色透明的，因此样品在进行观察前一般要经过染色。
不同的染料对某种细胞组分有特异的吸附，使样品产生足够的反差或产生不同波长的光谱以区分该种细胞组分。
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右图所示为荧光显微镜下观察到的小肠微绒毛的图像。
荧光显微镜技术包括荧光直接标记技术和免疫荧光技术。 利用Evans蓝进行染色，这种染料在荧光的激发下可发出红色荧光。黄绿色的荧光是GLT2（一种葡萄糖转移蛋白）荧光标记抗体的染色。
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利用不同的显微镜所观察到的神经细胞： 1）暗视野显微镜; 2）相差显微镜; c)DIC
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骨骼肌细胞放大4500倍。 左图切片厚度为1μm；右图切片厚度为0.025μm。
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电镜负染技术是20世纪60年代开始使用于英国试验室，当时人们发现一些重金属离子能在核蛋白体四周沉淀下来，形成一个黑暗的背景，在核蛋白体内部不能沉积而形成一个清晰的亮区，利用深色背景衬托出样品的精细结构，其图像如同一张照相的底片，因此称为负染色。是观察病毒等颗粒性样品的常用技术。 上图为利用磷钨酸钾进行的烟草病毒的负染色； 下图为铬金属投影。
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酵母的基因组于1996年测序完成，其基因组含1.2×108个碱基对，约有6200个基因。
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拟南芥的基因组于2000年测序完成，是人类搞清的第一个植物物种的基因组，共有1.25×109个碱基对，约有25000个基因。
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线虫的基因组于1998年测序完成，是人类得到的第一个动物物种的基因组,共有109个碱基对，约含18400个基因。
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果蝇的基因组于2000年测序完成，共有1.4×109个碱基对，约含13600个基因。
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小鼠的基因组测序工作预计到2007年完成，推测其基因组共有3.3×1010个碱基对，约含40000个基因。
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Hela细胞（左）、CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞 右）的培养
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