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题目：糖蛋白和药用蛋白表达系统 汇报人：王顺
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汇报提纲 一. 糖蛋白及其结构 二. 糖蛋白的药理 三.用于药用蛋白生产的外源表达系统
四.毕赤酵母X-33 OCH1基因敲除菌株的构建及其表达低糖基化蛋白GM-CSF 研究背景（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，迫切需要解决的关键科技问题） 四. 研究方案（包括研究方法、技术路线、实验手段、关键技术等
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一.糖蛋白及其结构 糖蛋白(glycoprotein)是由一个或多个寡糖链通过不同连接方式与蛋白质部分的多肽骨架共价相连而成的一类重要生理活性物质。 糖蛋白分子由多肽链和糖链两部分组成。糖和多肽链之间通过糖肽键连接而成。
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1.1 糖蛋白多肽链结构 在糖蛋白合成过程中,糖蛋白多肽链的合成与非糖基化蛋白质基本相同。所不同的是在多肽链合成的同时或之后,伴有肽链的糖基化作用。 不少糖蛋白一级结构已经测出,如桑蚕卵中的EaseA4由155个氨基酸残基组成。在第61位和150位两个半胱氨基酸残基之间形成一个二硫键,第22位至24位形成Asn-X-Thr的糖基结合部位。
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1.2 糖蛋白糖链结构 高甘露糖型 N-连接的糖链 复杂型 糖 链 杂合型 O-连接的糖链
杂合型 O-连接的糖链 N-糖链通常包含一个五糖核心结构,称为三甘露糖核心。 O-糖链存在多种形式，共同点是由一种或少数几种单糖与某些含羟基氨基酸连接，一般不存在共有的核心结构。
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1.3 糖肽键 是指糖基异头碳原子上的羟基与肽链氨基酸残基上的酰胺基或羟基脱水形成的糖苷键。分为N-糖苷键和O-糖苷键两大类。 参与糖肽键的氨基酸残基主要有:Asn、Ser、Thr、羟赖氨酸(Hyl)和羟脯氨酸(Hyp)。它们可以与N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、木糖、半乳糖及阿拉伯糖形成五种主要的糖肽键。此外,还发现罕见的以N-末端氨基酸残基为连接点的糖肽键,存在于小鼠血红蛋白A1c中。
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二.糖蛋白药物的药理 随着生物技术工业的发展，蛋白质药物的应用逐渐增多，其中大约有70％是糖蛋白类药物。
1 清除自由基——抗氧化、防疲劳、延缓人体器官的衰老。 2 增强免疫力 3 降血脂、降血糖 4 抗肿瘤
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三.用于药用蛋白生产的外源表达系统 3.1 植物表达系统 3.2 哺乳动物表达系统 3.3 昆虫表达系统 3.4原核表达系统
3.5酵母表达系统
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3.1 植物表达系统 核基因组转化 稳定表达系统 植物表达系统 叶绿体转化 瞬时表达系统
将表达的外源蛋白定位于植物细胞亚细胞结构如内质网、蛋白体、质体组或淀粉粒中，可以为外源蛋白的折叠、糖基化及二硫键形成等翻译后修饰提供场所。
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核基因组转化：将外源基因整合到宿主植物的基因组中，通过子一代、子二代的筛选获得可稳定表达外源蛋白的转基因株系，做法是将表达的外源蛋白定位在蛋白质来源最丰富的叶肉组织或贮藏器官如种子中。
叶绿体转化：外源基因整合到类似原核生物基因组的叶绿体基因组中。
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核基因组转化优缺点 优点：定位在种子中的外源蛋白稳定性较好，常温下长期贮存不会出现明显的降解或生物活性的丧失。 缺点：建立能够稳定遗传的高表达转基因株系非常耗时，且植物表达系统的大多数药用蛋白的表达产量都还很低。转基因在宿主基因组的插入位点、植株不同部位,发育时段不同会导致外源基因表达的不均一性，转基因植株大田栽培又会引发转基因逃逸等安全问题。
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叶绿体转化优缺点 优点：在一定程度上克服上述问题，可以大幅度提高表达产量，不会出现转基因沉默和转基因随花粉逃逸等安全问题。 缺点：获得稳定的叶绿体转化株系同样是一个非常耗时的工作(至少一年)，而且叶绿体不能对蛋白进行糖基化修饰、适用的宿主植物有限。
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3.1.2植物瞬时表达系统： 是将外源基因的表达载体 (质粒DNA或合成的RNA分子)直接导入植物组织，或通过农杆菌质粒的T-DNA将包含病毒基因组顺式作用元件的外源基因表达盒间接导入植物组织中。 优缺点：耗时短、表达量高、均一、检测方便、涉及环境的安全问题少。但外源基因在病毒传播过程中容易丢失、稳定性差、病毒载体对外源基因的长度有严格限制，同时病毒RNA在宿主体内可能会通过高频重组产生侵染能力强的的野生型重组病毒颗粒，从而带来较大的环境安全隐患。
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4.2 哺乳动物表达系统 从对外源蛋白进行加工修饰的能力看，较理想的药用蛋白表达系统是哺乳动物细胞表达系统，表达的重组蛋白与天然蛋白在结构和功能上都高度一致，迄今已经建立了多个优良的用于外源蛋白表达生产的细胞株系。但是，动物细胞培养条件困难，培养基复杂昂贵，易污染或携带人类病原物，建立大规模表达体系耗时耗资。
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常用动物细胞系： 中国仓鼠卵巢细胞(CHO)（最成熟、工业化生产应用最多） 叙利亚 / 幼仓鼠肾细胞系(BHK)（因容易感染病毒，在病毒培
各种杂交瘤细胞 养和疫苗生产上用途广泛） 犬肾细胞系MDCK 成年非洲绿猴肾的Vero细胞系 转基因技术获得永生化的人胎成视网膜细胞系Per.C6。（上三种主要用于生产流感疫苗，细胞系的糖基化因来源不同而略有异。）
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随着转基因技术和克隆技术的快速发展，利用转基因动物腺体表达生产外源蛋白已经成为可能，尤其是人α1-抗胰蛋白酶在转基因动物乳腺中成功表达且占宿主总乳蛋白50%的研究结果更让该领域研究者备受鼓舞。但是，此技术刚起步，还有许多问题。转基因动物的获得费时费力且耗资巨大，技术挑战性强，像哺乳动物细胞表达系统一样，存在潜在的人类病原物危险。
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3.3 昆虫表达系统 A、重组杆状病毒表达系统 B、昆虫细胞稳定转化表达系统
A的常用载体是多核多角体病毒（苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒），能在受感染的细胞内形成大量多角体蛋白衍生蛋白。它不是必需蛋白，可用外源蛋白的开放读码框(ORF)替代多角体蛋白ORF来构建表达载体。
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但杆状病毒分子量大(80～ 200 kb)，不能象质粒载体那样利用多克隆位点进行基因重组，只能利用杆状病毒和带有目的基因序列的质粒载体进行共转染，借助携带目的基因的质粒载体中人为引入的杆状病毒多角体蛋白两翼序列的同源序列，利用昆虫宿主细胞的相关酶系和蛋白质因子，通过同源重组实现目的基因对病毒多角体蛋白基因的取代。
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昆虫细胞稳定转化表达系统是基于对宿主细胞基因组进行稳定转化的昆虫细胞核基因转化表达系统。寄主细胞主要来自双翅目昆虫，通常是果蝇和蚊子。
昆虫表达系统也存在一些弊端，研究表明，昆虫细胞内表达的外源蛋白经常在富含Arg/lys的序列位点被蛋白内切酶切割，形成没有活性的表达产物。而且其糖基化修饰仅限于高甘露糖型寡糖链，不能形成包含果糖、半乳糖和唾液酸的复杂寡糖链结构。
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3.4 原核表达系统 原核表达系统中，大肠杆菌表达系统最成熟。但其不能糖基化、不能形成正确的二硫键和空间结构，故应用范围一直局限在非糖基化多肽的表达生产上。在外源蛋白生产中，常因过量表达而形成包涵体，需要复性(部分蛋白很难复性)、高密度培养过程中乙酸积累造成的细胞毒性、外源蛋白经常与内毒素相伴表达、内毒素和热源物质等杂质成分的去除，造成分离纯化成本的增加等缺陷迄今尚未完全克服。
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3.5 酵母表达系统 酵母表达系统既具有原核生物易于培养、繁殖快、表达量大、可分泌外源蛋白、可高密度培养、便于基因工程操作等优点，又具有真核表达系统对翻译后外源蛋白进行糖基化、磷酸化修饰等特点。先后被用于外源蛋白表达的系统有：酿酒酵母表达系统、毕赤酵母表达系统、裂殖酵母表达系统、乳酸克鲁维酵母表达系统和解酯耶氏酵母表达系统。
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酿酒酵母是最早建立的用于外源蛋白生产的真核表达系统。在生产临床药剂方面占有重要的地位，具有较高的安全性。但酿酒酵母不适合高密度培养，外源基因表达水平较低。且酿酒酵母缺乏强有力的受严格调控的启动子、分泌性能较差、翻译后加工修饰与天然蛋白存在差异(如重组蛋白常发生超糖基化)、传代不稳定等缺陷，限制了该系统的应用范围。
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毕赤酵母能在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基上高密度培养，利于工业化，具有目前已知最强的启动子—醇氧化酶AOX1强启动子，产物既可胞内表达也可分泌表达(易于纯化)、表达量高、遗传稳定、产物糖基化程度低于酿酒酵母、糖基化位点与哺乳类细胞相同的特点。因此，该系统建立后发展迅速，已从最初用于毕赤酵母表达的野生型菌株NRRL-Y-11430改造衍生出多种用于外源蛋白表达的毕赤酵母菌株。
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蛋白类药物中，糖基化位点和类型直接影响蛋白质的生物活性、药物的血浆半衰期和组织靶向。非人糖基化形式会影响药物代谢动力学性质、激活补体并通过对抗原递呈细胞的靶向作用而增强药物的免疫原性。毕赤酵母的N-寡糖链修饰作用与哺乳动物不同，虽然毕赤酵母的N-寡糖链与人的N-寡糖链的寡糖核心都是Man8GlcNAc2，但人N-糖基化的过程是由高甘露糖型经杂合型而形成末端为唾液酸的复杂型糖链结构，
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而在毕赤酵母中Man8GlcNAc2寡糖核心转入高尔基体，在一系列甘露糖转移酶的作用下添加甘露糖，形成高甘露型糖基，导致表达的外源蛋白空间结构被破坏，生物活性丧失且有明显的免疫原性，常发生副反应，尤其对过敏体质的人群可能会危及生命。已有资料显示：酵母可以进行类似于人体内的糖基化作用，加之酵母表达系统具有的突出优点，促使毕赤酵母的类人糖基化改造成为毕赤酵母表达系统近年来研究的热点。
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四. 毕赤酵母X-33 OCH1基因敲除菌株的构建及其表达低糖基化蛋白GM-CSF
酵母表达外源糖蛋白时会对蛋白进行过度N-糖基化修饰，产生高甘露糖型糖链，影响蛋白的活性，其中α-1，6-甘露糖转移酶( och1p) 在这一过程中起着关键作用。通过敲除毕赤酵母X-33的α-1，6-甘露糖转移酶(och1p)基因，获得一个对糖蛋白进行低糖基化修饰的毕赤酵母表达系统。
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采用双交换同源重组敲除目的基因的方法，首先敲除毕赤酵母X-33的URA3基因，获得一个尿嘧啶营养缺陷型的X-33(ura3-) 菌株;然后用URA3基因作为选择标记，敲除X-33(ura3-)的α-1，6-甘露糖转移酶(och1p)基因，获得OCH1基因敲除的X-33(och1-)菌株。用X-33(och1-)菌表达糖蛋白GM-CSF，分析GM-CSF蛋白糖链的变化。
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1 酵母细胞培养，基因组提取和PCR。 2 URA3基因的克隆及其同源置换DNA片段的构建:以毕赤酵母X-33基因组为模板，用引物URA5F、URA5R和URA3F、URA3R，分别PCR扩增URA3基因两端同源臂片段URA5’和URA3’，然后以URA5’和URA3’为模板，URA5F 和URA3R为引物，用重叠PCR扩增URA3基因同源置换DNA片段URA5-3，即PCR扩增的是URA3基因两端同源臂片段URA5’、URA3’和融合同源臂片段 。
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3 用同样的方法完成OCH1基因两个同源臂及融合同源臂的克隆。
4 质粒pYXZ的构建:以质粒pYES2为模板，用引物pYES2F、pYES2R PCR扩增其含URA3基因序列的部分，将产物回收纯化，用SalⅠ酶切后进行连接反应，自连形成质粒pYXZ，转化大肠杆菌JM109，用含氨苄青霉素的LB平板挑选阳性克隆。
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5 敲除质粒pYXZ-OCH1的构建:将OCH1两端同源臂融合片段OCH3-5以SalⅠ和NheⅠ酶切，克隆到用SalⅠ和NheⅠ酶切的质粒pYXZ 上，形成敲除质粒pYXZ-OCH1。
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6. 敲除毕赤酵母X-33的URA3和OCH1基因 6.1 URA3 基因的敲除和鉴定: 融合同源臂片段转入酵母后，与基因组中的URA3基因发生双交换同源重组，置换掉URA3基因编码框中700bp的序列。未发生同源重组的菌株由于携带URA3 基因而不能在含有5-FOA（5-氟乳清酸）的培养基上生长，因此可以在含5-FOA和尿嘧啶的MD培养基上筛选出ura3-菌株。
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挑选经过表型鉴定且性状稳定的菌株，用两端引物URA5F和URA3R进行基因组PCR鉴定，野生型X-33菌的URA3基因大小为2043bp，扩增产物为2000bp左
右;ura3- 菌的URA3基因编码框中约700bp的序列被置换掉，扩增产物应为1300bp左右，电泳结果如右图。
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6.2 OCH1基因的敲除和鉴定 敲除质粒pYXZ-OCH1转入X-33(ura3-)酵母细胞后，与OCH1基因发生双交换同源重组。敲除质粒含有URA3标记基因，因此能在MD培养基上生长的是发生同源重组的菌株;同时och1-菌在25℃生长良好而37℃不能生长，挑选符合上述两种性状的菌株，进行基因组PCR鉴定。 由于OCH1基因读码框中约1100 bp的序列被2800bp的选择标记序列取代，用外部引物OCH5F、OCH3R 鉴定，X-33菌PCR扩增产物为2.8 kb、X-33(och1-) 菌为4.4 kb;
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内部引物(in)5F、(in)3R中的(in)3R 位于被置换的读码框序列中，因此X-33菌株可扩增出1
内部引物(in)5F、(in)3R中的(in)3R 位于被置换的读码框序列中，因此X-33菌株可扩增出1.5kb的片段，而X-33(och1-)菌扩增不到片段 ，电泳结果如右图。
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7 GM-CSF 表达载体的构建及表达 7.1 表达载体的构建: 将从质粒pUC19 /GM-CSF（实验室供应）上酶切回收约425bp的GM-CSF片段连接到质粒pPICZαA上，构建成表达载体pPICZαA /GM-CSF。
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7.2 GM-CSF 在野生型X-33 菌中的表达和分析:
将基因组鉴定的阳性X-33/GM-CSF表达菌摇瓶发酵培养后，取培养上清进行SDS-PAGE 分析，X-33/GM-CSF表达菌可以高效表达GM-CSF蛋白，但表达的蛋白分子量主要分布在25-45kDa之间，明显大于其理论分子量15kDa，且表达条带发生了明显的拖尾。说明GM-CSF在野生菌X-33中的表达产物被过度糖基化修饰，且糖基化存在严重的不均一性。
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7.3 GM-CSF 在X-33(och1-)菌中的表达和OCH1基因敲除对蛋白糖基化的影响:
将基因组鉴定的阳性X-33(och1-)/GM-CSF表达菌摇瓶发酵培养后，取培养上清进行SDS-PAGE分析，同样GM-CSF可以在X-33(och1-)菌株中高效表达，表达蛋白的主带在25 kDa以下。与X-33菌表达的该蛋白相比，GM-CSF的分子量明显降低，说明X-33(och1-)菌株表达的是低糖基化的GM-CSF。
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