三峡大学化学与生命科学学院微生物学教学组

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1 三峡大学化学与生命科学学院微生物学教学组
微生物学实验 Lab work on Microbiology 三峡大学化学与生命科学学院微生物学教学组 实验指导老师：涂 璇

2 实验七、酵母形态观察、死活细胞鉴别和显微镜直接计数法
一、目的和要求 二、实验原理 三、实验器材 四、实验步骤 五、实验报告

3 酵母形态观察及死活细胞鉴别 一、实验目的 1 观察酵母菌的形态和出芽生殖方式 2 学习区分酵母菌死活细胞的实验方法

4 二、基本原理 酵母菌是单细胞真核微生物，通常以出芽方式进行无性繁殖，有的进行分裂繁殖；通过接合产生子囊孢子进行有性繁殖，有性繁殖要在特定培养条件下才能进行。 染料美蓝氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞分泌的还原酶，能使美蓝由蓝色的氧化型转变为无色的还原型。借此即可对酵母菌的死活细胞进行鉴别。

5 三、实验器材 1 菌种：酿酒酵母 2 仪器：显微镜、载玻片、盖玻片等

6 四、实验步骤 美蓝浸片的观察 在载玻片中央加一滴0.1％吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。（染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。） 用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。镜检。 将制片放置约3min后再次镜检并对照，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。 滴加染液－涂片－加盖玻片－镜检－3min后再次镜检

7 五、实验报告 绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征 思考题 1、酵母死活细胞鉴别的基本原理是什么？

8 显微镜直接计数法 一、实验目的 1 明确血细胞计数板计数的原理 2 掌握用血细胞计数板进行微生物计数的方法

9 二、基本原理 显微镜直接计数法 血球计数板的结构： 四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格
网，每个方格网共分为九个大方格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小方格，无论哪种每个大方格中的小方格都是400个。

10 每一个大方格边长为1mm，高0. 1mm，所以计数室的容积为0
每一个大方格边长为1mm，高0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。计数时，通常只用5个中格内的菌体(孢子)数即可。然后求出每个中方格的平均值，再乘上25或16，得出一个大方格中的总茵数，再换算成1ml菌液中的总菌数。若设5个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B， （1）如果是25个中方格计数板，则计算方法为： 1ml菌液中的总菌数=（A/5)×25×104×B=50000A·B(个) （2）如果是16个中方格计数板，则计算方法为： 1ml菌液中的总菌数=(A’/4) ×16×104×B=40000A·B(个)

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12 三、实验器材 1 菌种：酿酒酵母 2 仪器：血球计数板、显微镜、载玻片、盖玻片等

13 四、实验步骤 1.菌悬液制备，以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。 2. 取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖玻片。
3. 取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。 4. 静止5min后，用低倍镜观察并将计数室移至视野中央。

14 5. 在高倍镜下计数：随机计数五个中格的平均值，然后求得每个中格的平均值。乘上16（或25）就得出一大格中的总菌数，最后再换算到每mL菌液中的含菌数。
6.清洗血细胞计数板 计数完毕后，血球计数板要立即清洗干净，并用吸水纸吸干，最后用擦镜纸擦干净，并放回盒内。

15 五、实验报告 实验结果 第1次 第2次 第3次 平均值 计算 次数 各中方格中细胞数 中方格中细胞总数 稀释 倍数 菌浓度 （个/ml）
左上 右上 右下 左下 中间 第1次 第2次 第3次 平均值

16 结 束 请注意实验台面清洁！ 请值日生留下来打扫卫生！