酶标准化及其在临床实验室应用 齐志宏 Tel:69157381 2015-3-20.

Presentation on theme: "酶标准化及其在临床实验室应用 齐志宏 Tel:69157381 2015-3-20."— Presentation transcript:

1 酶标准化及其在临床实验室应用 齐志宏 Tel:

2 主要探讨内容 酶标准化的发展历程 酶标准化的途径 参考测量程序 酶参考物质 酶参考实验室网络 酶标准化在临床实验室的应用 2017/3/22

3 血清酶的测定方法 免疫学方法 测定酶的实际含量 动力学方法 测定酶的催化活性 2017/3/22

4 酶催化活性测定的影响因素 酶蛋白的分子结构 催化反应条件 反应方向和温度 底物的性质与浓度 缓冲液的PH值与离子强度 指示剂的性质与浓度
激活剂与抑制剂的存在 测定波长，加样量等 2017/3/22

5 Results of EQAS PROLARIT (6° event) (Lyophilized materials)
2017/3/22

6 Results of EQAS PROLARIT Lyophilized material)
2017/3/22

7 97年卫生部室间质评结果 酶项目 实验室数 平均变异(%) 一般项目 ALT 401 18.0 Glu 408 9.6 AST 398
14.5 Urea 407 11.2 ALP 25.9 TP 406 4.0 A2AMS 384 36.9 Alb 6.1 CK 393 20.9 Cho 405 8.6 LD 395 14.4 Ca 7.7 2017/3/22

8 动力学测定酶活性存在的问题 实验室间结果缺乏可比性 室间质评的靶值难以确定 同一酶项目存在多种参考范围 2017/3/22

9 临床酶标准化的发展历程 70年代之后 制定参考方法 70年代之前 90年代之后 单位定义不一致 建立参考系统 温度 底物 反应方向 缓冲液
2017/3/22

10 国外推荐方法 Recommendations of the German Society for Clinical Chemistry (1972) Scandinavian standardization of enzyme determinations (1974) Società Italiana di Biochimica Clinica, Commissione per gli enzimi. Metodi proposti per la determinazione di quattro attività enzimatiche (1980) Société Francaise de Biologie Clinique, Commission Enzymologie (1982) ECCLS Document n. 3 – 4 (1988) IFCC methods for the measurements of catalytic concentrations of enzymes ( ) IFCC methods for the measurements of catalytic concentrations of enzymes (2002) 2017/3/22

11 国内推荐方法 1993年中华医学会据IFCC在70年代公布酶活性浓度测定推荐方法总则相应总则
发布了”中华人民共和国卫生行业标准 WS/T 临床酶活性浓度测定方法总则” 目前参考了IFCC 2002年各种酶推荐方法 临检标委会讨论通过 2017/3/22

12 标准化-全球性的话题 人口流动性增加 使用共同参考范围 不同实验室结果比较 临床决策需要 1.医学决定水平 2.危险评估 3.治疗监测
2017/3/22

13 标准化的基础-量值溯源 溯源的原理 溯源的概念
指测定结果或标准量值通过连续的比较链与给定的标准相联系的属性，给定的标准通常是国家或国际标准，比较链中的每一步都有给定的不确定度。 溯源的原理 临床检验在内的化学分析质量保证的基本原理。 2017/3/22

14 欧盟关于体外诊断器具的指令(Directive 98/79/EC)
量值溯源的法规 欧盟关于体外诊断器具的指令(Directive 98/79/EC) 校准物和/或质控物的定值 ISO 体外诊断医学器具 校准物质和质控物质定值 ISO 体外诊断医学器具 酶催化浓度校准物质和质控物质定值 2017/3/22

15 产品校准物(及正确性质控物产品)定值-厂家
临床检验量值溯源性的要求 产品校准物(及正确性质控物产品)定值-厂家 EU Directive ISO 17511 ISO 18153 临床检验结果-临床实验室 ISO 17025 ISO 15189) 2017/3/22

16 酶催化活性浓度的溯源性 相同测量条件下酶活性具有可比性 单位
SI单位（mol/s）/m）：“每立方米溶液中每秒中能转化的克分子底物量”。也可以用 kat/m。它处在图的上端或者是最后溯源终点 目前普遍使用酶活性单位（U）：即每分钟能转化一个微克分子底物的酶量） 1U=1umol.min=16.667×10 kat 相同测量条件下酶活性具有可比性 2017/3/22

17 性质明确并经纯化的酶 参考测定程序（IFCC） 二级参考物（含有基质） 厂家标准测定方法 厂家生产用校正品 常规测定方法 常规样本 测定结果
认证 验证 校正 溯源性 传递性 2017/3/22

18 酶标准化的途径-建立酶的参考系统 参考测量方法（ISO15193） 参考物(ISO15194) 参考实验室网络(ISO15195) 允许校准
2017/3/22

19 参考测量方法的用途 评价由测量仪器、辅助设备和试剂组成的测量系 统的性能 证明测量同一量的不同常规测量程序的功能的可 互换性
为参考物质赋值，赋值的参考物质用于常规测量 程序的校准和控制 检测患者样本中的分析影响量 2017/3/22

20 一级参考测量方法的原理 同位素稀释法 – 质谱分析 电量分析 重量测定 依数性测量(如凝固点降低) 2017/3/22

21 参考测量方法的类型 一级参考测量方法 二级参考测量方法 国际传统的参考测量方法 2017/3/22

22 C-RSE:37℃酶催化活性浓度测量的一级参考方法
第一部分 酶催化活性浓度测定参考方法的基本原理 第二部分 肌酸激酶催化浓度测定参考方法 第三部分 乳酸脱氢酶催化浓度测定参考方法 第四部分 丙氨酸氨基转移酶催化浓度测定参考方法 第五部分 天门冬氨酸氨基转移酶催化浓度测定参考方法 第六部分 γ-谷氨酰基转移酶催化浓度测定参考方法 第七部分 用于测定γ-谷氨酰基转移酶、乳酸脱氢酶、丙 氨酸氨基转移酶和肌酸激酶酶活性的四种参考物质的鉴定 第八部分 碱性磷酸酶催化浓度测定参考方法 2017/3/22

23 ALT参考测量程序的建立 Reaction principle Measurement conditions 2017/3/22

24 试剂 1. Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) (C4H11NO3), Mr=121.1
2. L-Alanine, free acid (C3H7NO2), Mr=89.09 3. 2-Oxoglutaric acid, crystallized disodium salt, dihydrate (C5H4O5Na2 · 2 H2O), Mr=226.1 4. β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced form (NADH) (C21H27N7O14P2Na2), disodium salt, Mr=709.4 5. Pyridoxal-5’-phosphoric acid, monohydrate (C8H10O6NP · H2O), Mr=265.2 6. Lactate dehydrogenase (LDH, EC ), from pig skeletal muscle, in glycerol 7. Sodium chloride (NaCl), Mr=58.44 8. Sodium azide (NaN3), Mr=65.01 9. Hydrochloric acid (HCl), Mr=36.46, 1 mol/l 10. Bovine serum albumin, Fraction V, Mr=68 000 2017/3/22

25 Solution 1 1.47 g (121.2 mmol/l) Tris 5.61 g (630.0 mmol/l) L-Alanine, free acid g (8.00 mmol/l) Sodium azide – Dissolve in about 80 ml water. – Adjust pH (37°C) 7.15 with 1 mol/l hydrochloric acid. – Transfer to a 100 ml volumetric flask. – Equilibrate the volumetric flask and water to 20°C. – Fill the water (20°C) up to the calibration mark of the volumetric flask. Stability at 2 °C – 8 °C: 3 months 2017/3/22

26 Solution 2 1.47 g (121.2 mmol/l) Tris g (8.00 mmol/l) Sodium azide – Dissolve in about 80 ml water. – Adjust pH (37°C) 7.15 with 1 mol/l hydrochloric acid. – Transfer to a 100 ml volumetric flask. – Equilibrate the volumetric flask and water to 20°C. – Fill the water (20°C) up to the calibration mark of the volumetric flask. Stability at 2 °C – 8 °C: 3 months 2017/3/22

27 Solution 3 16.7 mg (6.300 mmol/l) Pyridoxal-5’-phosphoric acid, monohydrate – Dissolve in about 6 ml Solution 2. – Transfer to a 10 ml volumetric flask. – Equilibrate volumetric flask and Solution 2 to 20°C. – Fill Solution 2 (20 °C) up to the calibration mark of the volumetric flask. – Store protected from light (e.g. in a brown bottle). Stability at 2 °C – 8°C: 1 week 2017/3/22

28 Solution 4 16.1 mg (11.34 mmol/l) NADH, disodium salt
– Dissolve in 2.00 ml Solution 2. – Store protected from light (e.g. in a brown bottle). Stability at 2 °C – 8°C: 1 week 2017/3/22

29 Diluent for reagent enzymes
1.20 g Bovine serum albumin 0.90 g (154 mmol/l) NaCl – Dissolve in about 80 ml water. – Transfer to a 100 ml volumetric flask. – Equilibrate the volumetric flask and water to 20°C. – Fill the water (20°C) up to the calibration mark of the volumetric flask. Stability at 2 °C – 8 °C at least 1 month 2017/3/22

30 Solution 5 Lactate dehydrogenase solution [3.57 mkat/l (214 kU/l) at 37°C] – Dilute the LDH stock solution with diluent for reagent enzymes (see above) so that the dilution exhibits a catalytic LDH concentration of 3.57 mkat/l (214 kU/l) at 37°C. 2017/3/22

31 Start reagent solution
0.407 g (180.0 mmol/l) 2-Oxoglutaric acid, disodium salt, dihydrate – Dissolve in about 6 ml water. – Transfer to a 10 ml volumetric flask. – Equilibrate the volumetric flask and water to 20°C. – Fill the water (20°C) up to the calibration mark of the volumetric flask. Stability at 2 °C – 8°C: 1 week 2017/3/22

32 Reaction solution 10.0 ml Solution 1 0.200 ml Solution 3
– Mix thoroughly and store protected from light. Stability at 2 °C – 8°C: 1 day 2017/3/22

33 Measurement procedure
Equilibrate only an adequate volume (0.4 ml) of the start reagent solution at 37°C in preparation for the measurement procedure. The remaining volume of the start reagent solution should be stored at 2°C – 8 °C Pipette the following volumes one after another into the cuvette 2017/3/22

34 C-RSE: IFCC 参考方法修改 温度从 30° 到 37°C pH 根据温度系数调整 预温时间  某些酶做了修改
2017/3/22

35 C-RSE: “新” 参考方法特性 2017/3/22

36 参考物质 用于获得这种跨时间、空间和不同测量程序的溯源性的物质即参考物质 包括物质描述、测量结果、使用说明、稳定性资料和贮存条件等
概念 用于获得这种跨时间、空间和不同测量程序的溯源性的物质即参考物质 支持性文件 包括物质描述、测量结果、使用说明、稳定性资料和贮存条件等 2017/3/22

37 参考物质的特性 共性 特性 附加特性 来源, 生产方法, 物质状态, 均匀性, 添加剂, 储存条件和稳定性
来源, 生产方法, 物质状态, 均匀性, 添加剂, 储存条件和稳定性 特性 分子组成, 分析物技术条件 & 基质, 纯度, 定值, 和测量的不确定度 附加特性 评价均匀性和稳定性的方法, 定值和不确定度定义, 说明生产者和供应商, 使用说明和预期功能 2017/3/22

38 参考物质的用途 验证或控制一个实验室或一组实验室的测量值的正确性 校准一个测量系统的示值或另一种参考物质的值 评价一个新的测量程序的性能
参考物质的正确使用有赖于参考物质说明 2017/3/22

39 参考物质的类型 一级参考标准 二级参考标准 有证参考物 校准品 质控物 2017/3/22

40 不同类型参考物的特征 Primary standards CRM Routine calibrators Controls Purity
++++  - Stability +++ ++ Accuracy of the target Commutability +(+++) (+++) 2017/3/22

41 物质的互通性 用两种测量程序测量有一定值的指定物质所得结果间的数学关系,这种数学关系在人血清中获得[prEN ISO 17511: 2002, 3.9] 简言之,替代性是标准物质在不同测定方法中与真实样本反应的一致性;是标准物质进行溯源的前提 2017/3/22

42 缺乏互通性的原因 基质效应 结果引起偏移和分析浓度不相关 分析特异性 2017/3/22

43 评价互通性的方法 测量新鲜血清 测量参考或校准品 2017/3/22

44 Uncertainty of the values assigned to CRMs
Between- bottle variation Uncertainty of stability Uncertainty of characterization Combined expanded uncertainty IRMM/IFCC 452 (GGT) 0.21% 0.78% 0.61% 2.0% IRMM/IFCC 453 (LDH) 0.11% 0.36% 0.49% 1.2% IRMM/IFCC 454 (ALT) 0.27% 1.9% IRMM/IFCC 455 (CK) 1.26% 1.44% 0.58% 4.0% 2017/3/22

45 CK certification of CRM 608 (IRMM/IFCC 455)
2017/3/22

46 LDH certification of CRM 404 (IRMM/IFCC 453
2017/3/22

47 GGT certification of CRM 319 (IRMM/IFCC 452)
2017/3/22

48 ALT certification of CRM 426 (IRMM/IFCC 454)
2017/3/22

49 IRMM/IFCC reference materials Certification at 37°C
2017/3/22

50 实验室的层次 国家计量机构 得到认可的参考实验室 大学 医院 厂商 厂商的校准实验室 常规实验室 2017/3/22

51 参考实验室网络功能 参考物质认证 为室间质控品定值 验证常规测量方法 与NMI合作 与 EQAS 组织者和厂商合作 与厂商合作
2017/3/22

52 ISO15195对参考实验室管理体系的要求 组织和管理 判断的独立性 应明确所有有关人员的责任、权力和相互关系 指定质量负责人 质量管理体系
质量手册:目标、质量方针和质量控制程序 人员 测量文件和记录 合同 2017/3/22

53 ISO15195对参考实验室技术条件要求 场所和环境条件 样品处置 仪器 参考物质 参考测量程序 计量学溯源性 – 测量不确定度 质量保证
报告结果 2017/3/22

54 建立酶学参考实验室-设备 分光光度计 pH 计 分辨率 0.001 pH 单位 2 或 3 点定标 自动比色池 比色杯恒温装置
温度不确定度 (k = 2)  0.1°C 高信号稳定 (仪器预温后在0 Abs高于 0.4 mAbs/h) 低噪音 (在 0 Abs and 580 nm 0.2 mAbs) 狭缝宽度  2 nm 双波长 pH 计 分辨率 pH 单位 2 或 3 点定标 2017/3/22

55 建立酶学参考实验室-设备（续1） 分析天平 重量 精确度 0.5 mg to < 5mg 0.0001 mg
恒温水浴箱 用于试剂预温和 比色杯部件的恒温 附带外部制冷系统避免温度漂移 大量水保证温度恒定 2017/3/22

56 建立酶学参考实验室-设备（续2） 自动稀释器 Hamilton Microlab 1000 Plus 样品量: 10 – 500 L
试剂量: 0.05 – 2.5 mL 程序控制的吸样和速度 1 mm内径 样品容积 / 采样管容量 <1/3 样品和试剂之间气泡隔开 Hamilton Microlab 1000 Plus Partial volume Accuracy Precision > 30% < 1 % < 0.2% > 10% < 0.4% 2017/3/22

57 建立酶学参考实验室-设备（续3） 标准温度计 低热容的很薄的温度计探针 精密度高的加样器 2017/3/22

58 关键步骤-加样混匀 比色杯内可以附带磁力搅拌棒 手工搅拌 2017/3/22

59 控制变量保证酶法分析的准确性 分光光度计性能 波长准确性 光度测量的准确性 散射光 加样量 温度 pH 称量 2017/3/22

60 称量仪器的校准 溯源到国家级标准 必须用标准物质校准 分析天平至少 一年校准一次 使用天平前清洁砝码避免灰尘 不要用手触摸砝码
2017/3/22

61 我们使用的设备 分光光度计: SHIMADZU UV-1700 Varian Cary100 分析天平: Sartorius RC210D
点温度计: FLUKE 1504 比色杯恒温装置 SHIMADZU TCC 自动稀释器: Hamilton Microlab 500 series pH 计: Fisher Scientific Accumet model 10 bench pH1100 水浴箱:华恒万仪 2017/3/22

62 酶催化活性浓度测量不确定度的报告 总不确定度包括: 检查不同变量: 只有知道参考测量方法所有步骤的不确定度,才能 知道整个测量的精确度
样品和试剂加量 温度 pH 波长和光度的精确度 试剂批号和稳定性 检查不同变量: pH: 0.01 pH 偏差测量 amylase 引起最后结果 1% 变化; GT 却 没有大变化. 只有知道参考测量方法所有步骤的不确定度,才能 知道整个测量的精确度 2017/3/22

63 参考实验室满足的条件 2017/3/22 测量能力试验(ring trials) 经过ISO 17025或ISO 15195认可
使用JCTLM公布的参考测量程序 2017/3/22

64 IFCC 参考实验室网络为IRMM/IFCC 参考物质定值
2017/3/22

65 谁来做? 国际组织 政府 国际国内科学社团 厂商 临床实验室 2017/3/22

66 国际组织 2017/3/22

67 2017/3/22

68 国际酶学参考实验室网络 2017/3/22

69 开展酶测定的标准化 建立参考测量系统 保证常规系统由参考系统溯源 开展有效的室间评价计划 2017/3/22

70 2017/3/22

71 2017/3/22

72 2017/3/22

73 2017/3/22

74 2017/3/22

75 2017/3/22

76 2017/3/22

77 2017/3/22

78 2009年 2010年 2011年 2012年 2013年 2014年 2017/3/22

79 临床实验室酶的标准化 可以溯源的配套检测体系 参考方法校准常规方法 2017/3/22

80 研究全过程 常用方法 参考方法 校准品 新鲜患者标本 参考结果 常用方法结果 可比性良好 4检测调整校准品 3校准 1检测 5校准 6检测
2得出 7得出 参考结果 常用方法结果 可比性良好 2017/3/22

81 AST参考方法与加入PLP常规方法比较 参考方法双份测定均值（U/L） 2017/3/22

82 ALT参考方法与加入PLP常规方法比较 2017/3/22

83 结语 “随着计量学概念的引用,参考测量系统的参考测量 方法,参考物质和参考实验室网络的应用,酶测定准 确性和可比性的时代已经来临了.”
[Panteghini M. et al. Clin Chem Lab Med 2001:39: ] 2017/3/22

84 Thank You !