蛋白质组学的解决方案.

Presentation on theme: "蛋白质组学的解决方案."— Presentation transcript:

1 蛋白质组学的解决方案

2 内容 蛋白质组学概要及其Thermo Fisher的解决方案 高通量蛋白质组鉴定技术
生物标志物发现技术 Biomarker Discovery 翻译后修饰PTMs 自由地解离技术 Freedom of Dissociation

3 The goal of Proteomics “The goal of proteomics is a comprehensive, quantitative description of protein expression and its changes under the influence of biological perturbations such as disease or drug treatment.” Leigh and Norman Anderson, Electrophoresis 19, 1853 (98))

4 蛋白质组学研究 vs 传统的单个蛋白研究 蛋白质组学研究和单个的蛋白研究不同，它的特征是研究一个细胞、细胞器、组织、甚至器官中的整体蛋白质，比较特殊条件（如人及模型动物杂病理条件下）和正常条件下的细胞内蛋白质表达的差异已成为发现基于蛋白质的新药物靶点的重要方法。 方法学 Bottom－Up从下而上 Top－Down从上而下

5 蛋白质组学的任务 和 “Bottom-Up”从下而上的方法学要求
要在复杂的体系中 鉴定蛋白Identify 测出不同体系中蛋白表达组分的差异 测出不同体系蛋白表达量的不同quantitation 测定翻译后的修饰PTMs 蛋白质组学的任务 对复杂体系强大的分离能力 是否可鉴定出？足够的信息量 鉴定的速度和通量 痕量～丰量的动态范围 定量 鉴定的可靠性，消除假阳性 Bottom-Up方法学的要求

6 近年来，二维或多维毛细液相分离非常成熟并被广泛使用。
Bottom-Up基础：分离手段 SDS-PAGE：生物学家常用的工具，然后用“拍照”法观察图谱，或离线提取后检测 HPLC：反相色谱常用来分离肽/蛋白，可以在线接检测器(如质谱)检测 对于更复杂的体系……… 2D PAGE双向电泳：第一维按照pI点分离，第二维按照分子量分离 MD LC：第一维离子交换柱，第二维按照反相分离 近年来，二维或多维毛细液相分离非常成熟并被广泛使用。

7 Bottom-Up基础：鉴定手段，如何用质谱鉴定一个蛋白质 ？
先决条件：先有一个蛋白及其序列的数据库！ 测定一个蛋白的分子量，然后搜索数据库：所有生物质谱都有该基本功能，但该方法可靠性很差 蛋白酶解后，测定多个肽段的质量：蛋白质组学的筛选法，由于没有序列信息，可靠性仍不高。这类仪器比如：MALDI-TOF 除了提供前两条功能，还提供大量的肽序列信息：可靠性很高，一般国际认为一个蛋白被测定2个肽序以上，可靠率>99%，多种类型的串联质谱都可以做。 如果没有数据库，只能用de novo测序，即从头测序法， 但注意：de novo测定的是短序列，它的测序结果国际并不公认，蛋白测序仪的结果是公认的。De novo为我们发现新蛋白提供帮助，但蛋白质组学的绝大部分工作需要依靠数据库检索。

8 基础：在质谱的序列谱中能看到什么？质谱中的肽段断裂方式
电荷带于N端的是abc离子，电荷带于C端的是xyz离子 最常见的是b离子、y离子

9 ESI/MS/MS/TurboSEQUEST
生物大分子研究对质谱技术的要求 蛋白/肽的精确质量 丰富的序列信息 全扫描MS/MS方式高灵敏度 快速 直接分析蛋白质混合物shotgun proteomics 给出翻译后修饰的信息 Phosphorylation Glycosylation 定量（蛋白表达） 易用性 信息量 高通量 Focus on Ion Trap ESI/MS/MS/TurboSEQUEST

10 Top-Down测序——新方法，是Bottom-Up的一个有力的补充
需要依靠超高性能的傅立叶变换质谱：比如FTICR MS或Orbitrap，但这类型仪器仍极为昂贵。 这种质谱需同时具备： 多级MSn功能、超高质量精度（LCMSn联用常规工作中<2ppm）、多种解离方式（CID、ECD、IRMPD、ETD etc）、强大功能的解析软件，Etc. 目前只有少数实验室可以具备该条件。而且，国际上所有具有该种水平的实验室，都有许多其它类型的串联质谱，并有丰富的蛋白质组学研究经验和基础。

11 从上～下测序 翻译后修饰 从下～上 高通量鉴定 发现生物标记物

12 Thermo Fisher蛋白质组学解决方案
ProteomeX LTQ LTQ FT Hybrid LTQ Orbitrap LTQ/LXQ vMALDI LTQ Product range: Traps, Triples, & MALDI ToF. New additions which strengthens the range of products include the second generation ProteomeX and the vacumm MALDI based on the LTQ. From our customers perspective these products meet specific needs for many applications in drug discovery & development and environmental analysis. ProteomeX Dec XP MAX Deca XP MAX

13 Thermo Fisher离子阱系列对蛋白质组学研究的贡献
世界各地的实验室大约有8,000台LCQ/LTQ/LXQ/Orbitrap/LTQ FT；超过1000家实验室正在进行蛋白质、蛋白质组等大分子的相关研究 Thermo Fisher在San Jose的蛋白质组学研究组 Thermo Fisher的BRIMS生物标志物发现研究小组 发表的大量Nature、PANS、Blood等文献 国内的863、973、11.5蛋白质组学项目组，使用大量Thermo Fisher的技术

14 著名的、购买多套的用户 BIG Names Don Hunt Graham Cooks John Yates Steven Gygi
Dan Liebler Vern Reinhold Mark Sanders 购买多台的用户： Novartis Merck Pfizer UC Davis Vanderbilt Scripps Roche GSK BMS Amgen Astra Zeneca Aventis U VA L’ Oreal Wyeth Ayerst FDA EPA Indiana Ctr Applied Protein Science (INCAPS) Max Planck Mayo MIT U Toronto U Sussex Washington U Dupont Harvard Eli Lilly Bayer ETH 上海生化细胞所 军事医学科学院 Samsung Don Hunt是美国最著名的质谱“祖师爷”，在Virginia Univ., John Yates是“鸟枪法”蛋白质组学的发明者，目前在Scripps研究所，他多次来中国，目前有17套Thermo的各种离子阱，和Orbitrap；Cooks在普度大学，也是全美最有名的质谱专家之一，对离子阱、线性离子阱的发展具有重要的贡献，并发明了Orbitrap；Steven Gygi在Harvard医学院，也是质谱方面的著名学者。

15 中国的蛋白质组学用户 中科院上海生化所蛋白质组学国家重点实验室，共8套 军事医学科学院放射医学研究所，共3套 复旦大学
中科院药物研究所 杨一鸣教授 3套。 国家人类基因组北方研究中心 中科院过程工程研究所生化工程国家重点实验室 中科院基因组信息中心（华大基因） 中国医学研究院基础医学研究所蛋白质组学平台 中科院青岛海洋所海洋生物国家重点实验室 中科院动物所生物膜与膜蛋白国家重点实验室 中科院遗传与发育研究所，染色体国家重点实验室 病毒基因工程国家重点实验室， 同济医科大学， 山东师范大学逆境植物重点实验室 中科院植物生理所 中科院微生物研究所 天津大学 北京大学 北京生命科学研究所 上海疾病预防控制中心 白求恩国际和平医院 上海中医药中央研究院 中科院生物物理所国家蛋白质组学重点实验室 中国科技大学 上海检测中心 大连化物所 中国林科院林研所 清华大学博奥芯片

16 中国科学院蛋白质组学重点实验室（上海生化细胞所）
                                                              中国科学院蛋白质组学重点实验室（上海生化细胞所） 该实验室各课题组自98年至今共发表论文190多篇，其中被SCI收录的文章142篇，IF值超过5的论文19篇，IF值超过2的文章65篇。获得1999年国家自然科学三等奖1项，2000年中科院自然科学一等奖1项，申请国内外发明专利11项，授权专利4项。 8套Finnigan的各种离子阱！

17 北京蛋白质组研究中心 3套Finnigan的离子阱！

18 Thermo Fisher 的Lab-Free技术在2007 ABRF PRG定量研究中表现极为出色

19 B和C一样 样品 A 样品 B 样品 C PRG2007 实验样品设计 在不同的水平和比率上添加回收
100 µg E. coli lysate 共计添加回收12种蛋白 - 10 Non-E. coli 蛋白 - 2 E. coli 蛋白 100 µg E. coli lysate 共计添加回收12种蛋白 - 10 Non-E. coli 蛋白 - 2 E. coli 蛋白 100 µg E. coli lysate 共计添加回收12种蛋白 - 10 Non-E. coli 蛋白 - 2 E. coli 蛋白 在不同的水平和比率上添加回收

20 鉴定那些在样品间（A、B、C）改变了组成的蛋白。 测定样品间（A、B、C）蛋白的相对含量。
PRG2007 研究的任务 鉴定那些在样品间（A、B、C）改变了组成的蛋白。 测定样品间（A、B、C）蛋白的相对含量。

21 PRG2007 样品中的各蛋白及其含量 * * *E. coli Proteins

22 PRG2007 样品中的各蛋白及其含量

23 蛋白序列数据库 The file contains: 1) 4,346 protein sequences
>gi| |ref|NP_ | putative membrane protein [Escherichia coli K12] MKTLIRKFSRTAITVVLVILAFIAIFNAWVYYTESPWTRDARFSADVVAIAPDVSGLITQVNVHDNQLVK KGQILFTIDQPRYQKALEEAQADVAYYQVLAQEKRQEAGRRNRLGVQAMSREEIDQANNVLQTVLHQLAK AQATRDLAKLDLERTVIRAPADGWVTNLNVYTGEFITRGSTAVALVKQNSFYVLAYMEETKLEGVRPGYR AEITPLGSNKVLKGTVDSVAAGVTNASSTRDDKGMATIDSNLEWVRLAQRVPVRIRLDNQQENIWPAGTT ATVVVTGKQDRDESQDSFFRKMAHRLREFG Was converted to: >PRG_seq_5 ABRF_PRG2007_Protein_5 MKTLIRKFSRTAITVVLVILAFIAIFNAWVYYTESPWTRDARFSADVVAIAPDVSGLITQVNVHDNQLVK The file contains: 1) 4,346 protein sequences 2) common contaminants (e.g. keratins, trypsin, etc...) 3) an equal number of decoy sequences

24 Demographics of the Participants
返回定量数据结果的 = 35 返回实验结果的 = 43 87 个实验室申请了样品: 49% 的返回率

25 各个实验室应用的技术 基于2D gel的技术 稳定同位素标记的技术 Stable Isotope 不用同位素标记的技术Label Free

26 结果：检出和定量对的 True Positives vs 错误的False Positives
26 ABRF PRG 2007

27 结果：检出和定量对的 True Positives vs 错误的False Positives
27 ABRF PRG 2007

28 定量的精密度和准确度 举例: Ubiquitin
2D Gels Label Free Stable Isotope Labeling A = 5 pmol B = 23 pmol 8 Anticipated Mole Ratio 4.6 6 B/A Ratio Color Indicates Method Used iTRAQ ICPL ICAT 18O Labeling Label Free Label Free + targeted SRM 2D-Gels (nonDIGE) 2D-DIGE 4 2

29 Summary 样品中含有的12个蛋白，有2个是E. Coli蛋白，因基质就是E. Coli，所以大家都没有鉴定出来。剩余的10个是添加的外源蛋白。 排名最高（检出对的最多）的前3位全用的是Label-Free和Orbitrap（有精确质量），Thermo蛋白实验室还使用了H-SRM，结果也很好。 第一名——Label Free：10个对的，0个错的 第二名Thermo和Harvard医学院合作的BRIMS实验室——Label Free：9个对的，0个错的 第三名Thermo的蛋白实验室——Label Free：8个对的，1个错的

30 Summary续 稳定同位素标记的iTRAQ或ICAT结果并不好，16个实验室用了iTRAQ，只有1个比较好（7个对的，0个错的），其余15个都不好，最差的是（0个对的，15个错的）。证明iTRAQ常出现错误，同时，iTRAQ的准确度和精密性也不理想。 花费巨大的iTRAQ——对标准样品可能还可以，但对复杂基质的真实样品却无能为力。 10个实验室用基于2D gel的技术，结果都不理想，最好的一个是（6个对的，2个错的），其中5个给出的结果全是错的，最差的是（0个对的，15个错的）。证明：不用质谱只用2D gel的技术在定量方面很不理想 对比各公司： Thermo的RIMS实验室： 9个对的，0个错的；Thermo的蛋白组实验室：8个对的，1个错的 Bruker：4个对的，0个错的； ABI一个实验室：4个对的，4个错的， ABI另一个实验室：4个对的，5个错的 GE的DIGE技术（使用荧光和2D gel）：2个对的，11个错的 其它公司未参与或未返回结果 结果排名最高的3个实验室全用的是Orbitrap， BRIMS (9 true positives (TP), 0 false positives (FP)) and Proteomics Marketing (8 TP, 1 FP) results were excellent .. very best result (10 TP, 0 FP) came from Lab 67483, a non-Thermo Fisher lab which used Orbitrap LC/MS and label-free differential expression software (not SIEVE) for their analysis. Of the 12 spiked proteins, 2 were E. Coli proteins (tryptophanase, glycerokinase), which complicated the analysis, given that the spiked proteins were present in a background of E. Coli lysate. Most groups failed to identify either of these proteins. Of the 10 exogenous proteins, the best lab got them all, BRIMS got 9/10 and Proteomics Marketing got 8/10. Label-Free Quantitation Works (accurate mass helps): The 3 best results all used Orbitrap LC/MS accurate mass data and label-free quantification based on MS peak area. Note that both approaches – SIEVE and H-SRM - gave excellent results. As the poster and slides show, label-free analytical precision was quite good. Also note that there were some awful label-free results from other labs (1 TP, 13 FP). It is the combination of Orbitrap accurate mass, SIEVE, H-SRM, and skilled scientists which allowed Thermo Fisher teams to perform so well. iTRAQ Doesn’t Work: Given the hype surrounding iTRAQ, it is not surprising that, presented with a differential expression analysis sample, 16 labs (almost half of those who submitted results) used iTRAQ isobaric mass tagging. Of these 16 labs, there was one credible result (7 TP, 0 FP). The remainder of the 15 iTRAQ study results ranged from marginal (8 TP, 6 FP) to disastrous (0 TP, 15 FP). The iTRAQ analyses were generally plagued by false positive protein identifications. This is likely a consequence of using less capable mass specs (QSTARS?) and the inherent variability in iTRAQ response, making definitive differential analysis difficult. Further, as the poster and slides show, iTRAQ accuracy and precision were poor. Note – while the study organizers went to great lengths to explain that the study population was too small to draw statistically meaningful conclusions, 16 data points lead us to a relatively unambiguous conclusion – if your customers are using iTRAQ, they are spending a lot of money and they need to be very good and very careful. iTRAQ may perform reasonably well with standards, but this study points to serious potential issues when probing complex matrices such as E. Coli lysate or human plasma. Other Vendor Approaches? Lab 27960v is a vendor submission using ICPL, Bruker’s mass tag reagent. This lab performed OK (4 TP, 0 FP). Labs 14359v and 55649v are vendor labs which used iTRAQ (ABI? I doubt that they will admit it…). These labs performed poorly (4 TP, 4 FP & 4 TP, 5 FP). Lab 21543v used 2D gels and fluorescence (DIGE?). This lab performed very poorly (2 TP, 11 FP).

31 LC-MSn测定翻译后修饰PTMs

32 LCQ/LTQ翻译后修饰文献 糖基化化修饰 Proteomics
糖基化修饰 Molecular & Cell Proteomics 2007,May 6, 686~701 磷酸化修饰 Nature Biotech 2001,Vol 19, 379~382 磷酸化修饰 Nature Biotech 2001,Vol 19, 375~378

33 Data Dependent Neutral Loss Function 自动地中性丢失扫描功能
在确定MS/MS碎裂存在中性丢失后，自动触发做 MS3 扫描——自动磷酸化位点的分析 MS 扫描 MS survey scan MS/MS 扫描 是否有中性丢失? 否 Yes 该中性丢失是最强的N个峰之一么？ 是 MS/MS/MS 扫描 SEQUEST鉴定

34 为测定磷酸化肽设定的Data Dependent 参数
判断MS/MS是否有中性丢失： 单电荷，丢失m/z=98 双电荷，丢失m/z=49 三电荷，丢失m/z=32.7 判断是否最强的3个峰之一 满足以上两个判断，自动做MS3

35 Casein Digest——10 fmol on column
基峰色谱 MS RT: 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Time (min) 10 30 40 50 60 70 80 90 100 Relative Abundance 20.32 17.26 22.22 21.41 19.28 15.98 25.08 14.80 17.88 15.28 alphabeta10fmole1_2msms # 3148 16.75 T: + c ESI Full ms [ ] 1000 1500 m/z 831.61 976.55 3149 + c ESI Full ms2 [ ] 500 782.10 882.15 981.20 680.28 567.19 339.24 3150 16.76 + c ESI Full ms3 [ 680.18 883.29 996.27 567.26 468.15 304.23 MS/MS MS/MS/MS

36 Casein Digest —— 三个磷酸化肽的MS/MS 和 MS3 谱
50 10 20 30 40 1168.4 584.9 922.3 675.9 316.3 1222.2 F: + c ESI Full ms3 [ ] m/z Relative Abundance 983.07 747.4 1233.4 1490.4 632.4 F: + c ESI Full ms2 [ ] 100 60 80 500 1000 1500 680.3 883.4 996.4 1125.4 468.4 1238.5 1366.5 F: + c ESI Full ms3 [ ] K.FQS*EEQQQTEDELQDK.I K.VPQLEIVPNS*AEER. K.TVDMEST*EVFTK.K. 684.9 1266.3 395.3 974.3 F: + c ESI Full ms2 [ ] 2000 782.1 882.2 981.3 1094.3 567.3 1336.4 F: + c ESI Full ms2 [ ] 4 8 12 16 1619.5 964.8 747.3 632.3 1332.3 1688.5 328.2 1088.4 1361.4 503.3 1817.6 F: + c ESI Full ms3 [ ]

37 超痕量的、复杂体系的磷酸化位点分析 FQS*EEQQQTEDELQDK 10 amol 25 amol
How low can you go? Casein_25amol # 3105 NL: 2.51E2 Full ms 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Relative Abundance 983.1 1013.9 977.6 974.1 859.5 1216.8 1361.7 390.4 1490.9 731.3 603.3 1014.9 1802.3 1556.8 1637.8 385.5 1934.3 3106 1.44E1 Full ms 672.8 632.4 328.1 1574.3 551.4 368.7 965.0 1602.8 844.9 1057.3 1106.0 439.1 1620.7 959.6 687.3 1216.7 1346.7 1671.6 1525.3 1233.1 943.6 791.3 Casein_10amol 2943 7.65E1 Full ms 982.7 983.8 990.9 845.1 974.7 1089.2 1561.9 1361.8 859.9 474.2 1218.5 632.5 833.7 335.6 1673.7 1785.8 2944 9.57 Full ms 837.4 1105.7 965.6 585.6 858.8 1586.1 369.4 1671.1 25 amol 10 amol MS2 MS3 This is how it happened. These are the MS2 and MS3 spectrum for both 10amol and 25amol beta-casein. From the spectra you can see that both MS2 and MS3 spectra are proportional for these two different level of beta-casein. And MS3 spectrum of 25 amol give enough fragmentation information for phosphorylation site identification. Both MS2 and MS3 showed the positive identification for peptide FQS*EEQQQTEDELQDK for 25 amol. These really demonstrate that this method is optimized to low level of phosphorylation peptide site analysis. you also can use this data dependent MS3 function to study phosphorylation peptide site not only for standards also for complex samples analysis.

38 Glycosylation糖基化

39 Glycosylation

40 Glycosylation

41 : G (Galactose; MW 162 addition)
建立人类糖的数据库 210 ( ) ( ) Fu 211 biantennary, 1 fucose, 1 sialic acid M/Z =1064 (+3) N Asn Peptide + GlcN ( ) ( ) ( ) 210-2G,GlcN ( ) N: Sialic acid (MW 292 addition) Since the fragment ions of the peptide containing glycoforms are not in the database, we need manually to add the peptide mass plus the potential glycoform masses and their likely corresponding fragment ion masses into the database to match the unidentified fragment ions. The example of T45 peptide with a glycoform of 211 mass ion (M/Z = 1064 in + 3 charge state) and its potential different fragment ions were illustrated here. : G (Galactose; MW 162 addition) : GlcN (N-acetyl glucosamine; MW 203 addition) : M (Mannose; MW 162 addition) Red color : core structure Fu: Fucose (MW 146 addition) M/Z was shown in parenthesis with the corresponding charge state

42 复杂体系中，自动地LC-MS1～MS5 Glycopeptide region MS from
RT: 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 Time (min) Relative Abundance 46.78 31.08 34.55 29.80 44.66 26.55 5.32 56.23 6.06 97.61 49.19 96.92 121.72 113.39 8.59 57.42 98.25 95.93 21.91 110.98 21.55 88.24 61.02 117.35 64.91 13.23 86.75 70.50 75.92 122.46 138.88 NL: 2.79E10 TIC MS # 583 RT: 15.57 AV: 1 7.23E8 T: + c Full ms [ ] 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z 5 10 15 20 Relative Abundance 527.5 217.0 575.8 1064.0 234.1 445.0 634.8 286.8 1095.7 762.3 1060.7 807.9 1267.6 1595.2 1780.2 1514.8 1987.9 Glycopeptide region MS from glycopeptide ion MS scan +3 +2 Asn Fu N 选择做 MS/MS 2 3 4 Other region perform only MS and MS/MS

43 自动多级MS——1个母离子扫描，接着自动2、3、4、5级MS扫描
RT: 34.3 34.4 34.5 34.6 34.7 34.8 34.9 35.0 35.1 35.2 35.3 35.4 35.5 35.6 35.7 Time (min) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 34.86 100 34.95 NL: 34.76 2.42E9 35.03 95 m/z= 34.68 35.14 200.0- 90 34.58 MS Carbo_BSA0 85 MS2 35.24 6_60min_10 34.48 0_4000_100 80 35.34 C 34.37 35.43 75 35.53 70 35.63 MS3 65 Relative Abundance MS4 MS5

44 自动MS/MS on 211 glycopeptide (m/z = 1064.4, +3 charge)
Carbo_BSA06_60min_100_4000_100C # 1432 RT: 34.81 AV: 1 NL: 2.87E5 T: + c d Full ms2 [ ] 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 m/z 2 4 6 8 10 12 14 16 Fu Fu 1267.8 56 Asn 54 Asn 52 自动选择最强的峰做 MS3 1187.1 50 48 46 44 Fu 42 40 38 36 N 34 Asn 32 30 Fu 28 Asn 1414.0 Relative Abundance Fu 26 Asn 24 22 1369.9 20 Even the parent ion intensity was low for this glycopeptide (as shown in Fig 4), we can still find the MS/MS fragment ions of this glycopeptide in the same run. This is the beauty of the dynamic exclusion software in this instrument, which can memorize the already fragmented higher parent ions and then automatically select the subsequent lower parent ions to fragment (up to 25 ranking orders). Thus, the fragment ions of this unidentified and low-intensity parent ion were obtained and their corresponding glyco-structures were identified through the match of our manually-added database. Note: the glyco-structure of 211 (biantennary, with 1 fucose (Fu) attached at the beginning of the N-acetyl glucosamine (o) and 1 sialic acid (N) attached at the end can be fragmented into many different glycoforms as shown in this figure. 18 1450.6 Fu Asn Asn Fu Fu 1369.0 Asn Fu Asn 1267.1 Asn 1332.6 Asn Fu 1480.5 Asn 657.1 1004.0 1085.0 1186.3 1194.7 T45 – NH3 1684.3 740.2 931.4 1113.2 1494.4 1607.0 1712.5 1844.6

45 MS3 on ion TPA_iontree_2_ # 585 RT: 15.61 AV: 1 NL: 4.09E5 T: + c Full ms3 [ ] 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 Relative Abundance 1333.2 1011.3 1478.3 666.6 1479.2 993.5 1537.6 1085.2 1334.6 1185.7 740.3 892.4 1987.5 528.0 551.2 768.6 1697.2 1460.4 586.1 930.3 1315.8 1859.1 Asn Fu +2 oxidized 选择作MS4 MS3 提供了糖苷的结构信息。 因为糖苷的键比氨基键弱，糖苷比肽要先碎裂，通过MSn一步步解析糖肽的结构

46 MS4 on 1333.2 ion C-T-S-Q-H-L-L-N-R Y7 Y7 B6 B7 y2 B6 选择作 MS5 B5
TPA_iontree_2_ # 586 RT: 15.63 AV: 1 NL: 8.63E4 T: + c Full ms4 [ ] 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z 728.4 1213.4 100 B6 Dehydro-alanine form Further CNH2 loss on N-terminal 95 选择作 MS5 B6 90 B5 B7 85 C-T-S-Q-H-L-L-N-R 80 75 Peptide only C-T-S-Q-H-L-L-N-R SCH2COOH y2 70 65 1130.7 Y7 60 (N-acetyl Glc) 55 Relative Abundance 50 506.2 45 40 Y7 -H2O Dehydro-alanine form 35 B7 -H2O C-T-S-Q-H-L-L-N-R 833.0 30 B5 1053.4 25 636.2 Y2 / Y6(+2) 823.4 1240.5 618.3 20 798.0 492.2 15 10 5

47 MS5 on 728.4 ion HOOC-HN-T-S-Q-H
TPA_iontree_2_ # 587 RT: 15.65 AV: 1 NL: 3.31E4 T: + c Full ms5 [ ] 412.2 100 95 90 HOOC-HN-T-S-Q-H (formyl Threonine derived from dehydro-alanine cysteine on the N-terminal) 85 80 75 70 65 60 55 Relative Abundance 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z

48 总结糖肽的断裂途径 (a biantennary glycopeptide) – 从母离子 (211) 到MS5
Asn Fu MS MS/MS N CTSQHLLNR 211 ( ) 210 ( ) MS to 4 and 5 Peptide only ( ) LCQ-deca (nanospray) LCQ-deca-xp (microspray) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) MS/MS/MS

49 结论 离子阱的LC-MSn功能是分析糖蛋白最强大的工具 在分析糖类和肽序中， MSn 是必要的 只有离子阱质谱能实现这种分析

50 如果要直接分析上千混合蛋白的体系，可增加液相的维度，采用多维液相－离子阱技术
完成上述功能，需要配置 一个毛细液相色谱泵 一个自动进样器 一个软件Bioworks 一套LCQ DecaXP或LTQ/LXQ 柱子和接头 如果要直接分析上千混合蛋白的体系，可增加液相的维度，采用多维液相－离子阱技术