阪 崎 肠 杆 菌 梁 敏 华.

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1 阪 崎 肠 杆 菌 梁 敏 华

2 2011年12月21日美国媒体曝出消息，密苏里州两名婴儿在食用美国美赞臣（Mead Johnson）生产的婴儿配方奶粉Enfamil之后生病，其中一名婴儿不幸死亡。医院初步测试显示，他患上了一种罕见的细菌感染死亡的婴儿经剖验后证实被阪崎肠杆菌（ Enterobacter sakazakii ）感染。

3 12月27日 美国俄克拉荷马州一名婴儿被检测出对阪崎肠杆菌（ Enterobacter sakazakii ）呈阳性反应。

4 简 介 阪崎肠杆菌( Enterobacter sakazakii ) 分类在肠杆菌科，肠杆菌属， G-b，无芽胞，有周身鞭毛，兼性厌氧，棒状或球杆状，长 0.6~6.0μm，宽 0.3~1.0 μm。 生长特性：经过适宜的条件培养后在营养琼脂或血平板上形成圆形，光滑，突起，直径 2~3 mm，黄色菌落，黄色素在 25 ℃ 时更为明显。 生化特性与阴沟肠杆菌相似，故1980年以前被称为黄色阴沟肠杆菌，后更名为阪崎肠杆菌。

5 简 介 自然界分布广泛，在水、土壤、植物根茎、加工食品、动物排泄物等都能检出。细菌不耐热，加热到72℃持续15秒就可以杀灭。细菌不在人与人之间传播。 常见于生产婴儿配方奶粉的设施和家居环境中。 对干燥、渗透压和抗生素等有很强的抗性 。

6 奶粉？隐形杀手？

7 简 介 危害性：阪崎肠杆菌已被世界卫生组织和许多国家确定为引起婴幼儿死亡的重要条件致病菌

8 简 介 阪崎肠杆菌属条件致病菌，在一般情况下，不对人体健康产生危害,成年人感染常为轻度的胃肠道症状。
简 介 阪崎肠杆菌属条件致病菌，在一般情况下，不对人体健康产生危害,成年人感染常为轻度的胃肠道症状。 新生儿(出生28天或以下)和不足2个月的婴儿，尤其是早产儿、体重不足2.5公斤和免疫力较弱（母亲HIV）的婴儿的感染风险最高。可致严重脑膜炎，败血症，坏死性小肠结肠炎，死亡率可高达50%～80%。 新生儿(尤其是早产婴儿)胃的酸性较成年人低（PH高），这可能是阪崎肠杆菌可在婴儿体内生存的一个主要因素。

9 简 介 2004年2月25日FAO/WHO在日内瓦召开有关婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌及其他病原微生物的专家咨询会，委员会认为：奶粉中污染的阪崎肠杆菌是导致婴幼儿感染、疾病和死亡的主要原因，即使只有微量的污染（<3CFU/100g），阪崎杆菌也可在食品的冲调、放置过程中大量繁殖而引起感染。

10 简 介 由于发展中国家低体重婴儿和免疫缺陷婴儿的人群比例高于发达国家，因此其导致婴幼儿感染阪崎肠杆菌疾病的风险比发达国家更高。

11 简 介 1961年，英国的Franklin等人首次报道了2例阪崎肠杆菌脑膜炎，此后相继出现阪崎肠杆菌致人类感染的散发和暴发的病例报告。
简 介 1961年，英国的Franklin等人首次报道了2例阪崎肠杆菌脑膜炎，此后相继出现阪崎肠杆菌致人类感染的散发和暴发的病例报告。 统计到2004年，全球各地报道的确诊病例在60例以上，导致多起商业婴儿配方奶粉被广泛召回。

12 简 介 微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源，但许多病例报告表明婴儿配方粉是目前发现的主要感染渠道。
简 介 微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源，但许多病例报告表明婴儿配方粉是目前发现的主要感染渠道。 以下3 种主要途径可以导致婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的污染: A 通过生产婴儿配方奶粉的原料; B 在巴斯德杀菌后,配方粉污染或其他添加剂干粉带入; C 喂养婴儿前被污染

13 简 介 2002年美国FDA（食品和药物管理局 ）在本土某些国际乳业巨头生产的婴儿配方奶粉中检出阪崎肠杆菌。
简 介 2002年美国FDA（食品和药物管理局 ）在本土某些国际乳业巨头生产的婴儿配方奶粉中检出阪崎肠杆菌。 2003年又一家国际乳业巨头公司主动召回在美国生产的一批检出极微量阪崎肠杆菌的罐装早产儿特殊配方奶粉。 阪崎肠杆菌从此成为世界瞩目的焦点，得到世界多国相关部门的重视。

14 简 介 2005年以来，广州、中山、汕头检验检疫部门在食品工业用进口奶粉中已多次检出阪崎肠杆菌。
简 介 2005年以来，广州、中山、汕头检验检疫部门在食品工业用进口奶粉中已多次检出阪崎肠杆菌。 2008年10月17日，产自台湾的9.62吨配方奶粉从香港入境时被检验出阪崎肠杆菌超标 。不合格奶粉包括味全婴儿配方奶粉、味全幼儿成长配方奶粉和味全较大婴儿配方奶粉。

15 简 介 据FAO/WHO专家组的报告,目前缺乏发展中国家婴幼儿奶粉的阪崎肠杆菌污染资料。
简 介 据FAO/WHO专家组的报告,目前缺乏发展中国家婴幼儿奶粉的阪崎肠杆菌污染资料。 从2006年起，婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌的监测被列入我国食源性监测五类重点生物性危害监测之一。

16 简 介 阪崎肠杆菌的检验方法？标准化？

17 简 介 美国食品和药品管理局(FDA)的检测方法是国际检测阪崎肠杆菌的标准生化方法。此外，还有依据该菌生理生化特征的鉴定方法、PCR法检测和荧光PCR等分子检测方法。 2008年11月国家标准出台前，我国只有行业标准。

18 简 介 2005-5-20中国检验检疫科学研究院和天津出入境检验检疫局制定《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》行业标准。
该标准建立了阪崎肠杆菌改进的传统检测方法(经典方法)、普通PCR方法和荧光PCR方法(快速筛选方法)，其中改进的传统方法与FDA方法比较，检测结果一致，但效率大大提高，时间缩短1/3～1/2。

19 简 介 2006年2月，国际标准化组织(ISO)和国际乳品联盟(IDF)联合公布了“乳和乳制品中阪崎肠杆菌的检测”方法，即ISO/TS IDF/RM210

20 简 介 ，中华人民共和国卫生部联合国家标准化委员会发布GB/T 食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验， 新发布了GB/T 食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验， 实施。 解决了我国检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌无国家标准检测方法的问题。

21 国标适用范围 规定了食品中阪崎肠杆菌的检验方法 适用于婴幼儿配方食品，乳及乳制品，及其原料中阪崎肠杆菌的检验

22 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素mLST-Vm
培养基和试剂 缓冲蛋白胨水BPW 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素mLST-Vm 加入万古霉素目的是抑制革兰阳性细菌等杂菌的生长 注意：新鲜配制的mLST-Vm应该24h内使用， 万古霉素溶液可在4 ℃保存15d

23 培养基和试剂 阪崎肠杆菌显色培养基DFI 原    理： DFI中含有胆盐抑制革兰氏阳性菌，同时显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-ɑ-D 葡萄糖苷则与阪崎肠杆菌中的α-葡萄糖苷酶发生反应，水解底物，释放出5-溴-4-氯-3-吲哚基显色基团，在深黄色平板上产生绿-蓝绿色的菌落。 注意要避光, 4℃ 保存

24 阪崎肠杆菌显色培养基DFI 微生物 菌落颜色 阪崎肠杆菌 蓝绿色 大肠菌群 无色菌落 金黄色葡萄球菌 被抑制不生长                                              

25 检样100g(100ml)+BPW900ml 1ml+mLST-Vm 10ml DFI琼脂 挑取蓝绿色菌落 TSA 挑取黄色菌落 生化鉴定
36 ℃+ 1 ℃，18h + 2h 1ml+mLST-Vm 10ml 44℃+0.5 ℃，24h + 2h DFI琼脂 36 ℃+ 1 ℃，24h + 2h 挑取蓝绿色菌落 TSA 25 ℃+ 1 ℃，48h + 4h 挑取黄色菌落 生化鉴定 报告 阪崎肠杆菌检验程序

26 操作步骤 前增菌：预热900ml BPW至44 ℃，称样100g(100ml)，加入后缓缓摇动至充分溶解， 36 ℃+ 1 ℃培养18 h + 2 h。 增菌: 移取前增菌液1ml种于10ml mLST-Vm肉汤， 44 ℃+0.5 ℃培养24 h + 2 h。

27 操作步骤 分离： 混匀经过培养的mLST-Vm，各取一环，分别划线2个DFI平板， 36 ℃+ 1 ℃培养24 h + 2 h。
可疑菌落特征（直径1mm~3mm , 蓝绿色），挑取1~5个划线接种于TSA板（胰酪胨大豆琼脂平板），25 ℃+ 1 ℃分纯培养48 h + 4 h。

28 阪崎肠杆菌在DFI上的菌落生长特征

29 操作步骤 鉴定 TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定 可选择 生化鉴定试剂盒 或 全自动微生物生化鉴定系统。

30 表一 阪崎肠杆菌的主要生化特征 生化试验 特征 黄色素产生 + 氧化酶 - L-赖氨酸脱羧酶 L-鸟氨酸脱羧酶 （+） L-精氨酸双水解酶
柠檬酸水解 发酵 D-山梨醇 （-） L-鼠李糖 D-蔗糖 D-蜜二糖 苦杏仁苷 注：“+”>99%阳性；“-” >99%阴性；“（+）”90%~99%阳性；“（-）”90%~99%阴性

31 生化鉴定试剂盒 阪崎肠杆菌 API 20E 生化鉴定

32 快速检测方法 普通PCR方法 荧光定量PCR方法 环介导等温PCR方法(LAMP) 阳离子磁珠捕集法

33 荧光定量PCR方法 普通PCR基础上，加入一条特异的寡核苷酸荧光探针。该探针5‘端标记FAM荧光素，3’端标记TAMRA荧光素，FAM的荧光被TAMRA淬灭，仪器检测不到其荧光信号。 PCR延伸阶段，Taq DNA聚合酶发挥其5‘→3’外切酶功能，将探针切割，与此同时标记在探针上的FAM游离出来，其所发出的荧光不再为TAMRA所淬灭而被仪器检测到。

34 荧光定量PCR方法 PCR过程中对目的片断进行一次有效的扩增，同时对探针进行了一次切割以及对FAM进行了一次检测。仪器检测到的FAM的增量，可以间接地反映目的片段的扩增量。

35 荧光定量PCR方法 引物 探针 5'-CCGTTCGACGTAGCACTGC-3'
5'-CATAGAATTCACGACGACGAACTTC-3‘ 探针 FAM-5'-TTCAAACGTTCCTGCGAGAAAGCGG-3'-TAMRA

36 快速检测方法 快速检测方法特点(以荧光定量PCR方法为例）： 灵敏度高（2.5-5.2CFU/100g) 特异性强（与18种近缘菌株无交叉）
检测时限缩短（比较传统分离培养鉴定方法减少2/3时间)

37 分子分型方法 脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型
利用限制性内切酶XbaⅠ酶切阪崎肠杆菌染色体DNA进行PFGE分析,利用软件进行聚类分析，应用于阪崎肠杆菌的分子分型和溯源。 核糖体分型 16SrDNA全序列分析 随机扩增多态性DNA分型(RAPD)

38 食品安全，宝宝健康，责任重大

39 谢谢！