免疫细胞功能的测定 上海交通大学医学院 胡翊群 教授.

Presentation on theme: "免疫细胞功能的测定 上海交通大学医学院 胡翊群 教授."— Presentation transcript:

1 免疫细胞功能的测定 上海交通大学医学院 胡翊群 教授

2 免疫细胞功能的测定 T细胞增殖功能测定 基础理论 本技术用于评估T细胞对各种刺激的增殖能力。T细胞增殖能力是反映T细胞功能的一个重要指标。

3 T细胞功能的测定 刺激T细胞增殖的因素及意义 1. 特异性抗原： 引起寡克隆活化增殖。
2. 丝裂原：多克隆。 3. 刺激信号转导分子：多克隆。

4 T细胞增殖功能测定 T细胞增殖测定方法 1. 显微镜下观察细胞形态与细胞计数。 2. 放射性核素掺入试验。
细胞增殖时，DNA复制，须从培养液中补充核苷酸。用放射性核素标记培养液中提供的胸腺嘧啶（3HTdR），当DNA复制时， 3HTdR掺入正在分裂的细胞的DNA中。细胞增殖程度与细胞内掺入的3HTdR的量成正比。通过用液闪仪定量测定培养细胞中的放射性强度，就可以确定T细胞增殖的能力与强度。

5 丝裂原诱导的增殖反应 诱导T细胞增殖反应的丝裂原 1. PHA（植物血凝素） 2. Con A（刀豆蛋白 A） 3. PMN（美洲商陆）

6 丝裂原诱导的增殖反应 技术方法 1. 用RPMI－10将PBMC配成1x106/ml的悬液。
T细胞增殖功能测定 丝裂原诱导的增殖反应 技术方法 1. 用RPMI－10将PBMC配成1x106/ml的悬液。 2. 用100g/ml的PHA配制1:10、1:20和1:40稀释液。 3. 96孔板中选择一行（共12孔），每孔中加入100µl细胞。指定每相邻3孔为一组。前3组分别加入一种稀释度的PHA溶液，最后一组加培养液（对照组）。 4. 37°C ，5％CO2，54h。 5. 配制浓度为50µci/ml的3HTdR。

7 丝裂原诱导的增殖反应 6. 每孔加入50µci 3HTdR，继续培养18h。
7. 用多孔自动收集仪分别收集每孔细胞于一小管中。溶解细胞，将DNA过滤到滤纸上，洗去未掺入的3HTdR，最后用100％的甲醇洗涤，以利滤纸干燥。 8. 将滤纸放入液闪管内，自动计数，打印结果。 9. 扣除本底，计算每一组3个复本的平均数。

8 丝裂原诱导的增殖反应 影响因素 1. 细胞活力：冷冻技术影响细胞活力，复苏后应检查细胞活力。
T细胞增殖功能测定 丝裂原诱导的增殖反应 影响因素 1. 细胞活力：冷冻技术影响细胞活力，复苏后应检查细胞活力。 2. 培养液中添加的血清：有些血清可能激活或抑制细胞增殖。如欲测定人体细胞增殖能力，可采用灭活的AB血清。 3. 细胞培养板类型：根据细胞数量采用不同形状底部的培养板。 4. 微生物污染：可降低细胞增殖能力。

9 T细胞增殖功能测定 单向混合淋巴细胞培养反应 原理 T细胞受体能够识别同种异型MHC分子。当把2个不同个体的单个核细胞在体外混合时，可以相互刺激，引起增殖。增殖的强度与两者之间MHC的差别的程度成正比。所以同种异型混合淋巴细胞反应的强度反映2个个体之间MHC差别的程度，并且因为相互识别与增殖，结果是2个个体的淋巴细胞增殖能力的总和。这种试验就是双向混合淋巴细胞培养试验。 将参加反应之一方的单个核细胞用放射性核素照射，使其失去反应能力，但仍保存刺激能力，成为刺激细胞，则此时的反应结果仅反映另一方（反应方）的增殖能力。在实质性器官移植时，只需了解受者淋巴细胞对供者MHC的反应能力，所以适合采用单向混合淋巴细胞培养反应。

10 单向混合淋巴细胞培养试验 方法 1. 分离宿主与供者的PBMC，调整细胞浓度为1 x 106/ml。
T细胞增殖功能测定 单向混合淋巴细胞培养试验 方法 1. 分离宿主与供者的PBMC，调整细胞浓度为1 x 106/ml。 2. 刺激细胞灭活：用丝裂霉素（终浓度25µg，37 °C， 5％C，30min）或放射性核素照射（2000 rad）的方法处理刺激细胞。 3. 96孔板中，每孔加入1x105的刺激细胞和1x105反应细胞。 37°C，5％CO2，4～6d。加3HTdR，继续培养18h。阳性对照孔加反应细胞和丝裂原，不加刺激细胞。阴性对照孔只加照射的自身细胞。3复本。 4. 收集细胞，液闪仪计数，打印结果。

11 单向混合淋巴细胞培养 5. 计算相对反应（RR） （实验组cpm－阴性对照组cpm） RR＝ 阳性对照组cpm－阴性对照组cpm
T细胞增殖功能测定 单向混合淋巴细胞培养 5. 计算相对反应（RR） （实验组cpm－阴性对照组cpm） RR＝ 阳性对照组cpm－阴性对照组cpm

12 单向混合淋巴细胞培养 注意点 1. 细胞活力：使用冷冻细胞时，复苏后应检查细胞活力。
T细胞增殖功能测定 单向混合淋巴细胞培养 注意点 1. 细胞活力：使用冷冻细胞时，复苏后应检查细胞活力。 2. 培养液中添加的血清：有的血清可能会刺激或抑制反应。 3. 本底应小于2000 rpm，阳性对照组应大于20000 rpm。

13 T细胞增殖功能测定 抗原诱导的特异性增殖反应 原理 本试验测定T细胞在体外对某一特定抗原的特异性免疫应答能力。所用抗原可以是初次接触的抗原，也可以是曾经免疫过的抗原。常用的测定回忆反应的抗原有纯化蛋白衍生物（PPD）和破伤风类毒素（TT）。这2种抗原都被常规列入计划免疫接种范畴，成人应该对它们有回忆反应。在某些免疫缺陷病中，对它们的特异性回忆反应可减弱或消失。

14

15 抗原诱导的特异性增殖反应 方法（以T细胞对破伤风类毒素刺激的增殖反应为例） 1. 分离PBMC和APC，APC用丝裂霉素或放射性核素处理。
2. 96孔板中每孔加入1x105 PBMC和1x104 APC。 3. 每孔中加入系列稀释的破伤风类毒素溶液，不同孔中抗原终浓度分别为0、1、5、10和20µg/ml。每一种浓度设3复本。 4. 37C°，5％CO2，6天。 5. 加3HTdR，继续培养18小时。计数。

16 T细胞增殖功能测定 抗原诱导的特异性增殖反应 结果解释 1. 对于接种过破伤风疫苗者来说，本试验结果呈低反应反映患者对破伤风类毒素特异性应答能力低下或全身免疫缺陷。 2. HIV感染者反应低下反映CD4+T细胞减少导致的免疫缺陷。

17 抗原诱导的特异性增殖反应 注意点 1. 培养液中最好用人AB血清。
T细胞增殖功能测定 抗原诱导的特异性增殖反应 注意点 1. 培养液中最好用人AB血清。 2. 此T细胞增殖反应需要APC。如使用纯化T细胞，需加5％～10％自身APC。

18 抗原诱导的特异性增殖反应 应用实践 1. 丝裂原诱导的增殖反应
T细胞增殖功能测定 抗原诱导的特异性增殖反应 应用实践 1. 丝裂原诱导的增殖反应 临床上用于评估T细胞对多克隆刺激剂的增殖能力，反映T细胞基本免疫功能，即T细胞群总体的信息，不能反映个别T细胞克隆的情况 PHA常用于测试人T细胞增殖能力，Con A常用于测试小鼠T细胞增殖能力。

19 抗原诱导的特异性增殖反应 应用实践 2. 单向混合淋巴细胞反应 1）本方法主要用于估计器官移植前供体与受者之间MHC相配程度。
T细胞增殖功能测定 抗原诱导的特异性增殖反应 应用实践 2. 单向混合淋巴细胞反应 1）本方法主要用于估计器官移植前供体与受者之间MHC相配程度。 2）如培养时间超过96 小时，可制备细胞毒性T细胞（CTL）。

20 抗原诱导的特异性增殖反应 应用实践 3. 抗原诱导的特异性增殖反应 用于估计机体对特异性抗原的应答能力和机体总体免疫应答能力。
T细胞增殖功能测定 抗原诱导的特异性增殖反应 应用实践 3. 抗原诱导的特异性增殖反应 用于估计机体对特异性抗原的应答能力和机体总体免疫应答能力。

21 B细胞产生抗体能力的测定 基础理论 B细胞受到多克隆激活剂或特异性抗原刺激后，活化、增殖，最后分化成为浆细胞，产生抗体。抗体可以在血浆和其他体液中检出，检测抗体是测定B细胞功能的最重要的方法。 B细胞分类：B1细胞和B2细胞。两者发生学不同、接受刺激的抗原不同，对T细胞的依赖性不同。 由于B2细胞对抗原的应答依赖T细胞，所以，B细胞产生抗体能力的低下，其缺陷也可能起源于T细胞缺陷。

22 丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定 基础理论
B细胞产生抗体能力的测定 丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定 基础理论 人B细胞具有PWM受体，在体外受到PWM刺激时，发生多克隆激活，产生多克隆抗体。B细胞产生抗体的能力可以用ELISA测定培养上清中抗体的量估计，也可以用ELISPOT方法测定产生抗体的B细胞数量估计。

23 丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定 技术方法与评价
B细胞产生抗体能力的测定 丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定 技术方法与评价 1. 分离PBMC96孔板中每孔加入1x105细胞和PWM终浓度（1：100）。阴性对照孔内不加pWM。每一实验设2 复本。 2. 37C°5％CO2培养10天（ELISA）或7天（ELISPOT）。 3. 收集上清，用ELISA法测抗体。收集细胞，用ELISPOT法测产生抗体的B细胞。

24 丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定 应用实践 1. 用于确定B细胞活化和分化的信号转导机制，以及细胞因子和其它银子对B细胞分化的影响。
2. 因为B2细胞产生抗原需要T细胞辅助，所以又可以用于检测T细胞的辅助功能。 3. 临床上用于研究免疫缺陷病和自身免疫病患者B细胞分化异常的机制。

25 丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定 注意点
B细胞产生抗体能力的测定 丝裂原诱导多克隆抗体产生能力的测定 注意点 采用以抗体为基础的技术（如磁珠法、淘洗法和流式细胞仪）分离的B细胞，需考虑抗体对B细胞产生抗体的影响（促进或抑制作用）。

26 B细胞产生抗体能力的测定 ELISPOT法 基础理论 ELISPOT全称为酶联免疫斑点试验（enzyme－linked immunospot assay），可用于测定产生IgG和IgM抗体的B细胞。其方法是用抗原包被固相，然后加入抗原特异性B细胞。如果B细胞产生抗体，抗体与板上的抗原结合。加入酶标二抗和显色剂就会显色。一个斑点就代表一个产生抗体的细胞。

27 ELISPOT法 技术方法 1. 抗原包被：37C°2h，或4C°过夜。固相载体可用聚苯乙烯平皿、亚硝酸纤维膜、96孔板。
B细胞产生抗体能力的测定 ELISPOT法 技术方法 1. 抗原包被：37C°2h，或4C°过夜。固相载体可用聚苯乙烯平皿、亚硝酸纤维膜、96孔板。 2. 抗体生成细胞培育：加入适量抗体生成细胞，37C°，5％CO2，3～4h，或过夜。洗涤，去除为与固相结合的细胞。 3. 测定斑点产生细胞：加二抗， 37C°，5％CO2，2～3h。加辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶和底物显色。 4 计数：24h后用10～30倍显微镜下计数斑点形成细胞。

28 ELISPOT法 评价 1. 在操作中应使用无关抗原作阴性对照；病应排除细胞标本终抗体污染。 2. 硝酸纤维素膜灵敏度高于聚苯乙烯。
B细胞产生抗体能力的测定 ELISPOT法 评价 1. 在操作中应使用无关抗原作阴性对照；病应排除细胞标本终抗体污染。 2. 硝酸纤维素膜灵敏度高于聚苯乙烯。 3. 与ELISA联合使用，可以估计单个细胞的抗体产量。 4 当淋巴细胞受到严重污染时，也可以使用本法，所以适用于测定组织中抗体生成细胞。 应用实践 用途同ELISA法。本方法可用于任何可溶性抗原。

29 B细胞产生抗体能力的测定 ELISA测定各类免疫球蛋白 基础理论 B细胞受抗原刺激后，最初产生IgM抗体，然后在Th细胞产生的各种细胞因子的作用下，可转类成为IgG、IgA、IgE类抗体。应用不同的单抗，结合ELISA方法，可以测定B细胞产生的抗体的类别。

30 B细胞产生抗体能力的测定 ELISA测定各类免疫球蛋白 方法 1. 包板：96孔板用浓度为10µg/ml的特异性单抗包被。盖上盖板，37C°，5％CO2，2h，或4C°过夜。常规洗板，封闭。 2. 上样：每孔内加入1:10或1:20 稀释的细胞培养上清液100µl。阳性对照为标准品，阴性对照为培养液。每试验设2复本。室温培育2h，或4C°过夜。 3. 加酶标二抗：每孔加100µl碱性磷酸酶标记的羊抗人IgM或IgG或IgA二抗。室温培育2h，或4C°过夜。 4. 显色：洗板，每孔加100µl底物（p－nitrophenyl phosphate）。 5. 自动酶标仪读数，从标准曲线读出抗体浓度。

31 ELISA测定各类免疫球蛋白 评价 应用实践
B细胞产生抗体能力的测定 ELISA测定各类免疫球蛋白 评价 ELISA法灵敏、简单、快速、特异性高、重复性好，是测定上清和体液中Ig的首选方法。碱性磷酸酶标记的二抗显色明显，不必用碱中止反应，尤其适用于测定体外产生的抗体。 应用实践 ELISA可测定各种体液中的抗体，其结果反映被检个体B细胞功能。测定免疫球蛋白各种亚类的水平有助于鉴定免疫缺陷病。

32 CTL杀伤功能的测定 基础理论 CTL为细胞毒性T淋巴细胞的简称。是CD8＋T细胞识别APC表面MHC I类分子递呈的肿瘤或病毒特异性抗原肽后，分化形成的。当CTL遇到相应的肿瘤细胞或病毒感染细胞时，能够通过细胞接触机制或裂解机制杀伤靶细胞。

33 CTL杀伤功能的测定 1. 细胞接触机制 CTL表达FasL，靶细胞表达Fas，FasL与Fas的配接，通过Fas传入的信号激活靶细胞内细胞凋亡途径，导致靶细胞死亡。 2. 细胞裂解机制 CTL激活后，胞质内颗粒向2个细胞接触点移动。颗粒膜与细胞膜融合通过外吐释放颗粒内容物。穿孔素插入靶细胞膜后聚合，喜爱细胞膜上形成孔，造成细胞裂解。颗粒酶诱导靶细胞凋亡。

34 CTL杀伤功能的测定 51Cr标记法原理 如在将靶细胞与CTL混合之前，先用放射性核素51Cr培育， 51Cr能穿过细胞膜进入胞浆，与胞浆中小分子蛋白质牢固结合，不能自由从细胞内释放。当靶细胞膜被CTL破坏后， 51Cr被释放进入上清。因为上清中放射性强度与细胞杀伤程度呈正比，通过测定上清中放射性强度，就可以判定CTL杀伤能力。

35

36 CTL杀伤功能的测定 技术方法 1. 从肿瘤组织中分离淋巴细胞和肿瘤细胞。 2. 51Cr标记肿瘤细胞。
4. 37C°，5％CO2，4h。 5. 收集上清，计数器测定放射活性（cpm）。

37 CTL杀伤功能的测定 计算公式 试验组平均CPM值－自发释放组平均cpm值 注意点
％溶解＝ 最大释放平均cpm值－自发释放平均cpm值 注意点 由于CTL杀伤靶细胞受MHC限制，所以靶细胞必须来自自身，或选用表达适当MHC的肿瘤细胞系。 评价 优点：方法简单、快速，能定量。 缺点：自然释放率较高，需要的靶细胞量多。使用放射性核素。

38 CTL杀伤功能的测定 应用实践 这一方法常用于评估肿瘤患者CTL杀伤肿瘤的能力，可作为判断雨后和观察疗效的指标之一。

39 NK细胞毒性测定 基础理论 NK细胞存在于外周血、淋巴组织中，尤以脾脏最为丰富。因细胞体积大和胞浆内含大量颗粒，故称大颗粒淋巴细胞。表型特征是CD16（FcRIII A）和CD56（神经细胞粘附分子）。当NK细胞识别肿瘤细胞活病毒感染细胞时，CD16分子被交联，引起脱颗粒，并分泌IFN－和TNF。颗粒中含有穿孔素、颗粒酶和proteoglycans，引起靶细胞溶胀性死亡和凋亡。NK细胞的CD16与IgG1和IGg3结合，可介导ADCC作用。 NK细胞表达一种能识别HLA－A、－B、－C抗原的受体，向细胞发出一致性信号，阻止NK细胞的杀伤活性。当靶细胞不表达或低表达HLA I类分子时，抑制解除，NK细胞活化，杀伤靶细胞。 K562细胞系不表达HLA分子，对NK细胞杀伤作用敏感，常用作NK细胞的靶细胞，用于检测NK细胞的活性。

40 NK细胞毒性测定 技术方法 1. NK细胞的分离：用抗CD3、CD19、CD14单抗和淘洗法，去除T细胞、B细胞和Mo，获取NK细胞。
2. 加板： 方法同CTL杀伤试验。不同的是，靶细胞为K562细胞。最大释放组为靶细胞中加去污剂，自发释放对照组中不加Nk细胞。37C°，5％CO2，4h。 3. 收集上清液，计数器测各孔cpm值。 4. 计算％溶解值：方法同CTL法。

41 NK细胞毒性测定 评价 1. 本方法稳定，但51Cr污染环境。
2. 从外周血中 分离的NK细胞是静止细胞，只能杀死对峙敏感的K562细胞系，不能杀伤其它肿瘤细胞。 3. 冷冻保存影响NK细胞活性，故宜采用新鲜分离的NK细胞。 4. 人血清中含有的IgG会抑制NK细胞的杀伤活性，故培养液中宜使用小牛血清。

42 NK细胞毒性测定 应用实践 检测NK细胞免疫活性。在疾病状态下，NK细胞的功能会受到影响。

43 LAK细胞毒性测定 基础理论 LAK细胞是淋巴因子激活杀伤细胞的简称。NK细胞在大剂量IL－2刺激下扩增并分化成为LAK细胞。LAK细胞对新鲜分离的肿瘤细胞或肿瘤细胞系具有非特异性杀伤作用。临床上用LAK细胞过继性治疗某些肿瘤患者，例如肾细胞癌、黑色素瘤合霍奇金病，有一定疗效。

44 LAK细胞毒性测定 技术方法 1. 制备：抽取患者外周血20ml，分离PBMC。培养皿中加入重组IL－2，是终浓度为100U/ml。37C°，5％CO2，培养，每3～4天换液；细胞数增加时分瓶。 2. 培养7～10天。收集细胞，计数。细胞需要量为109～1010。 3. LAK细胞毒性检测：方法同NK细胞毒性检测，不同的是，本方法使用的靶细胞为肿瘤细胞系 Daudi细胞。

45 LAK细胞毒性测定 应用实践 1. 用于检测NK细胞的功能：正常人NK细胞在大剂量IL－2作用下能够分化成为LAK细胞。NK细胞功能缺陷者，分化能力降低。检测LAK细胞活性可以作为衡量NK细胞功能活性的指标。 2. 检测LAK细胞的细胞毒性：预测LAK细胞功能活性。