第九节 补料的控制 补料分批发酵(fed-batch culture，FBC)：

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1 第九节 补料的控制 补料分批发酵(fed-batch culture，FBC)：
第九节 补料的控制 补料分批发酵(fed-batch culture，FBC)： 又称半连续培养或半连续发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法，是分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方式，是一种控制发酵的好方法，现已广泛用于发酵工业。

2 1 FBC的作用 1） 可以控制抑制性底物的浓度 高浓度营养物抑制微生物生长： ① 基质过浓使渗透压过高，细胞因脱水而死亡；
② 高浓度基质能使微生物细胞热致死(themal death)，如乙醇浓度达10％时，就可使酵母细胞热致死； ③ 有的是因某种或某些基质对代谢关键酶或细胞组分产生抑制作用，如高浓度苯酚(3％～5％)可凝固蛋白； ④ 高浓度基质还会改变菌体的生化代谢而影响生长等。

3 有的基质是合成产物必需的前体物质，浓度过高，就会影响菌体代谢或产生毒性，使产物产量降低。如苯乙酸、丙醇(或丙酸)分别是青霉素、红霉素的前体物质，浓度过大，就会产生毒性，使抗生素产量减少。
有的底物溶解度小，达不到应有的浓度而影响转化率。如甾类化合物转化中，因它们的溶解度小，使基质的浓度低，造成转化率不高。 采用FBC方式，可以控制适当的基质浓度，解除抑制作用，得到高浓度的产物。

4 2） 解除或减弱分解代谢物的阻遏 有些合成酶受到迅速利用的碳源或氮源的阻遏，如葡萄糖阻抑纤维素酶、赤霉素、青霉素等多种酶或产物的合成。通过补料来限制基质葡萄糖的浓度，就可解除酶或其产物的阻遏，提高产物产量。 缓慢流加葡萄糖，纤维素酶的产量几乎增加200倍；将葡萄糖浓度控制在0.02％水平，赤霉素浓度可达905 mg／L；采用滴加葡萄糖的技术，可明显提高青霉素的发酵单位等。这都是利用发酵技术解决分解代谢物阻遏的实际应用。在植物细胞培养中，也采用该技术来提高产量。

5 3）可以使发酵过程最佳化 分批发酵动力学的研究，阐明了各个参数之间的相互关系。利用FBC技术，就可以使菌种保持在最大生产力的状态。 随着FBC补料方式的不断改进，为发酵过程的优化和反馈控制奠定了基础。 随着计算机、传感器等的发展和应用，已有可能用离线方式计算或用模拟复杂的数学模型在线方式实现最优化控制。

6 FBC的优点： ①解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏； ② 避免一次投料过多造成细胞大量生长所引起的一切影响，改善发酵液流变学性质； ③ 可提高发芽孢子的比例，控制细胞质量； ④ 不需要严格的无菌条件，产生菌不易老化变异，比连续发酵适用广泛。

7 2 补料内容 能源和碳源； 氮源； 微量元素； 诱导物；

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9 3 补料的原则 原则：根据菌体生长代谢规律； 生产需要； 环境条件 方法：充足而不过量（少量多次或分批流加）

10 4 补糖的控制 补糖时机 过早，刺激生长，加速糖利用； 过迟，所需能量跟不上。如谷氨酸发酵在对数生长期的末期补料。
4 补糖的控制 补糖时机 过早，刺激生长，加速糖利用； 过迟，所需能量跟不上。如谷氨酸发酵在对数生长期的末期补料。 判断：培养基条件，菌种，发酵状况（残糖，pH，菌形态等），在需要时加入；

11 补糖方式 连续流加：每次流加又可分为快速流加、恒速流加、指数速率流加和变速流加。 少量多次间歇补入 大量少次补入 以不引起发酵液成分剧烈波动为前提； 可与其他组分一起进行多组分补料。

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13 补糖量——加入与消耗平衡，维持稳定的糖浓度； 例：
a 四环素发酵还原糖维持在 % b 谷氨酸追加糖液发酵：在原工艺基础上，加大接种量到10%，增加生物素用量达5μg/L，减少初糖浓度（12%——7-8%）尽快获得大量的生产型菌体，当菌体处在生长对数期后进入产酸期，糖浓度在2%左右时，连续流加糖液，维持2%左右的糖浓度。 优点：低浓度发酵，以利于生长和发酵；      总糖浓度达20%，产酸高。

14 补糖开始时，不但二氧化碳释放率、摄氧率大幅度提高，连呼吸商也提高约10％，表明通过补糖不但提供了更多的碳源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代谢相关酶活力也提高，产能增加。
发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。

15 5 补偿氮源及无机盐 流加尿素，一方面调节pH，另一方面补氮。 谷氨酸发酵时，初次加入尿素量和补加量取决于菌种的脲酶活力强弱和耐尿能力。 脲酶活力低，耐尿素强，初次加入用量多2%，流加次数少 脲酶活力强，耐尿素低，初次加入用量少0.6%，流加以少量多次好

16 6 补料的控制 流加操作控制系统分为有反馈控制和无反馈控制两类。反馈控制系统是由传感器、控制器和驱动器三个单元所组成。根据控制依据的指标不同，又分为直接方法和间接方法。

17 间接方法：以溶氧、pH值、呼吸商、排气中CO2分压及代谢产物浓度等作为控制参数。对间接方法来说，选择与过程直接相关的可检参数作为控制指标，是研究的关键。通气发酵利用排气中CO2含量作为FBC反馈控制参数是较为常用的间接方法。 直接法：随着一系列技术障碍的克服，该法将会得到迅速普及。 反馈控制的FBC，常常是依据个别指标来进行，在许多情况下，并不能奏效，尚需进行多因子分析。

18 FBC还可采用“放料和补料”(withdraw and fill)方法：发酵一定时间，产生了代谢产物后，定时放出一部分发酵液(可供提炼)，同时补充一部分新鲜营养液，并重复进行。
维持一定菌体生长速率，延长发酵产物生产期，有利于提高产物产量，降低成本。注意染菌。

19 如控制青霉素生产所用的葡萄糖流加的质量平衡法，就是利用CO2的反馈控制。它是依靠精确测量CO2的释放率CRR和葡萄糖的流动速度，达到控制菌体的比生长速率和菌浓。
pH值也可用作糖的流加控制的参数。

20 注意事项： 适宜料液比 无菌操作 碳氮平衡，经济合理