3.1 全细胞DNA的制备 全细胞DNA是目的基因的材料来源，因此是必须得到的。我们通过学习细菌的全细胞DNA的制备，来了解DNA制备的基本知识。随后，我们再讲解质粒和噬菌体DNA的制备过程。

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1 Three distinct kinds of DNA are needed to be prepared: total cell DNA; plasmid DNA; phage DNA.

2 3.1 全细胞DNA的制备 全细胞DNA是目的基因的材料来源，因此是必须得到的。我们通过学习细菌的全细胞DNA的制备，来了解DNA制备的基本知识。随后，我们再讲解质粒和噬菌体DNA的制备过程。

3 从细菌培养物中制备全细胞DNA的步骤： （1）培养细胞的生长和收集（harvested）； （2）细胞的破碎及内含物(content)的释放； （3）从细胞抽提物（cell extract）中除去DNA外的其他所有成分； （4）DNA溶液的浓缩(concentrated)。

4 3.1.1 细菌培养物的生长和收集 培养细菌需要培养基（culture medium），M9和LB培养基是两种典型的细菌培养基。 M9是一种确定成分培养基（defined medium），其中的所有成分是可知的。这种培养基包含的无机营养成分（inorganic nutrients)的混合物为细菌的生长提供基本元素，如氮，镁和钙，葡萄糖(glucose)提供碳源和能量。在实际应用中，还必须向M9中添加额外的生长因子，如微量元素和维生素。需要添加何种成分要视情况而定。

5 Luria-Bertani（LB）培养基是一种不确定成分培养基(undefined medium)，胰蛋白胨(tryptone)负责提供氨基酸以及小的肽段，酵母提取物(yeast extract)负责提供氮源、糖以及其他有机和无机营养。类似LB的混合培养基不需要补充其他的营养成分，并且能够维持种类更多的细菌的生长。 当细菌培养物需要在严格准确的条件下进行生长时，必须使用确定成分培养基。然而，当培养物仅仅作为一种DNA的来源时，就没有必要用确定成分培养基，利用不确定成分培养基就更加合适。

6 利用LB培养基，在37 ℃、150～250 r/min的条件下，培养大肠杆菌细胞，大约每20 min分裂一次，直到培养基中的细胞达到2×109～3×109个/mL的最大密度。培养物的生长状况可以通过读取600 nm可见分光光度值（OD值）来监测，在该波长下，每个单位的OD值相当于0.8×109 个/mL。 通过离心可以收集细胞。相对较低的转速就能够使细菌在离心管（centrifuge tube）的底部聚集，这样一来上层的培养基就能够很容易到出。

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8 3.1.2 细菌提取物的制备 制备细胞提取物的第一步是使细胞裂解。裂解细胞的方法大体上可以分为两类：物理方法和化学方法。物理方法指的是以机械力(mechanical forces)的方法破碎细胞来释放内涵物。化学方法则是用化学药品(chemical agents)对细胞进行破碎。在制备DNA时通常以化学的方法破碎细胞。

9 在制备DNA时通常利用化学方法去破碎细胞。所使用的试剂通常包括一种能够破坏细胞壁的成分和一种能够去除细胞膜的成分。对于大肠杆菌来说，常常使用溶菌酶(lysozyme)或者乙二胺四乙酸盐（EDTA）破坏细胞壁，或者二者结合起来使用。溶菌酶是一种在鸡蛋清中存在的酶，它能够消化掉细胞壁中的多聚物。EDTA能够通过螯合除去对保护整个细胞外壁来说必不可少的钙离子，同时抑制细胞质中降解DNA的酶。在某些条件下，用溶菌酶或EDTA来削弱细胞壁足以导致细胞破裂，但通常还要加入一些去垢剂如十二烷基磺酸钠（SDS）导致细胞膜破裂，协助整个细胞外壁的溶解过程。

10 制备细胞提取物的最后一个步骤是通过离心去除细胞内的不溶性残余物。像部分消化的细胞壁碎片等成分能够通过离心的方式聚集在离心管的底部，而细胞提取物则以上清（supernatant）的形式得到分离。

11 从细胞提取物中纯化DNA 除了DNA，细菌提取物中还包含有大量的蛋白质和RNA，因此，要除去这些多余的成分后，才能得到纯净的DNA。 去除蛋白质的标准方法：加入苯酚和氯仿的混合物（1∶1）（phenol / chloroform ）。混合物能够沉淀出蛋白质但仍保留核酸（DNA和RNA）在水溶液中。把细胞提取物和有机溶剂逐渐混合并离心后，沉淀出的蛋白质分子会聚集在水溶液和有机溶剂的界面处形成白色的凝集物。这样一来，水溶液中的核酸分子就能够用吸管分离出来。

12 如果细胞提取物中的蛋白质过多，单用苯酚提取并不足以彻底纯化核酸。这时需要需要在苯酚抽提前，先用蛋白酶（proteinase），比如蛋白酶K，对细胞提取物进行处理，这些酶可以将蛋白质降解为短肽便于进行苯酚的提取。 一些RNA分子，特别是mRNA，会在苯酚处理过程中被除去，但是绝大多数RNA都和DNA一起保留在水溶液中。最有效的去除RNA的方法是使用核糖核酸酶，它能够迅速降解RNA分子。

13 DNA样品的浓缩 最常用到的DNA浓缩方法是乙醇沉淀(ethanol precipitation) 。在单价阳离子（如钠离子）存在的条件下，一定浓度的乙醇能够有效地使核酸分子沉淀出来。DNA沉淀能够通过离心得到，随后溶解在适量的水中。 对于浓的DNA溶液，乙醇能够在样品的上方形成一个分层，使得核酸分子在两相界面处沉淀出来，一个非常有效的技巧是，将一根玻璃棒穿过乙醇层伸入核酸溶液中。当棒子取出的时候，DNA分子就会呈纤维状黏附在玻璃棒上，并被取出。

14 3.1.5 DNA浓度的测定 在进行基因克隆实验时，确切知道DNA含量是十分关键的。DNA浓度能够通过紫外分光光度(ultraviolet absorbance spectrophotometry)测定法进行测定。被DNA溶液吸收的紫外线的量能够正比于样品溶液中的DNA含量。通常测定DNA在260nm处的吸收值，在该波长情况下，1.0的吸收值对应于每毫升50 ng双链DNA。 紫外吸收还能被用来检测DNA制备物的纯度。对纯净的DNA样品，在波长260 nm和280 nm的吸收值之比应为1.8。如果实际测量时，这个比例小于1.8的话，就表示样品被蛋白质或苯酚污染了。

15 从细菌以外的生物体制备全细胞DNA 对于大多数细菌细胞来说，细胞提取物的主要成分是蛋白质、DNA和RNA。利用苯酚抽提和蛋白酶降解可以除去其中的蛋白质成分，接下来用核糖核酸酶分解RNA就能够得到纯净的DNA样品了。如果细胞中还包含大量的其他生化成分，这些处理步骤并不能制备纯净DNA。例如，植物组织含有大量的碳水化合物，这些碳水化合物不能通过苯酚提取而除去，这样就需要使用一些不同的技术。

16 方法之一是使用一种称为十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的去垢剂，这种去垢剂能够和核酸一起形成不溶的混合物。当CTAB被加入到植物细胞提取液中时，核酸－CTAB混合物就能够沉淀出来，经过离心，沉淀混合物聚集在离心管的底部，而碳水化合物、蛋白质以及其他杂质仍然保留在悬液中。接下来，将混合物溶解于1 mol/L NaCl溶液，使CTAB与核酸分离。这样，核酸就能够利用乙醇沉淀进行浓缩，利用核糖核酸酶处理去除RNA。

17 方法之二需要用一种被称为异硫氰酸胍的化合物，这种化合物具备的一些特性对于DNA的纯化十分有用。第一，它能够使除了核酸以外的其他生化成分变性和溶解，因此可以用来从任何组织中分离DNA。第二，在异硫氰酸胍存在的情况下，DNA会牢固地结合在二氧化硅颗粒上。这使得将DNA从变性的生化成分中的分离变得十分简单。二氧化硅被被置于色谱柱中，DNA结合在二氧化硅上被保留在色谱柱中，而其他变性成分随着溶液流出色谱柱。在利用异硫氰酸胍洗掉柱中的杂质后，利用水将DNA从色谱柱中洗脱出来，因为水能够减弱DNA分子与二氧化硅之间的相互作用。

18 3.2 质粒DNA的制备 与全细胞DNA的制备一样，在制备质粒DNA时，首先要收集包含质粒的细胞培养物，并制成细胞提取物。接下来，要去除其中的蛋白质和RNA，DNA则用乙醇沉淀进行浓缩。在质粒制备过程中需要从大量的染色体DNA中分离出含量相对较少的质粒DNA。 质粒DNA通常以超螺旋的形式存在于细胞中。超螺旋是在质粒复制过程中在拓扑异构酶的作用下形成的。超螺旋分子很容易同其他非超螺旋DNA分子相分离，利用这一特点，通过下面两种途径可以从细胞粗提物纯化出质粒DNA。

19 3.2.1 碱变性（alkaline lysis procedure ）
这项技术的基础是在一个窄的pH范围内非超螺旋DNA被变性，而超螺旋DNA不发生变性。如果用氢氧化钠把细胞提取液的pH值调整到12.0～12.5的范围内，非超螺旋DNA的两条链相互分离。此时，如果加入酸，这些变性的DNA链会杂乱地聚集在一起相互交联，形成的网状物可以通过离心除去，悬液中只剩下纯净的质粒DNA。 这一处理方法的另一个优点是，在某些环境中（尤其是利用SDS溶解细胞以及醋酸盐（sodium acetate ）中和溶液时），绝大多数蛋白质和RNA也变成不容物，并在离心的步骤中被除去。

20 3.2.2 溴乙锭-氯化铯密度梯度（caesium chloride gradient ）离心
密度梯度是通过在非常高的转速下对氯化铯进行离心得到的。梯度的产生是因为在强的离心力的作用下，铯离子和氯离子向离心管的底部移动。这些离子在向下迁移的过程中通过扩散达到平衡态，这样自上而下氯化铯密度不断升高的浓度梯度就建立起来了。

21 氯化铯溶液中的大分子在离心的过程中会在不同的梯度位置形成条带。一种分子形成条带的位置取决于它的浮力密度：DNA的浮力密度为1
氯化铯溶液中的大分子在离心的过程中会在不同的梯度位置形成条带。一种分子形成条带的位置取决于它的浮力密度：DNA的浮力密度为1.7 g/cm3，因此在离心的过程中，DNA分子会迁移到氯化铯密度为1.7 g/cm3的梯度位置。蛋白质分子的浮力密度要低得多，因此离心后会集中在离心管靠上的位置，而RNA因为浮力密度最大沉在离心管的底部。因此，密度梯度离心能够分离DNA、RNA和蛋白质，并且能够代替苯酚抽提和核糖核酸酶处理来对DNA进行纯化。

22 更重要的是，密度梯度离心在溴乙锭(ethidium bromide )存在的条件下能够从非超螺旋分子中分离超螺旋DNA。溴乙锭通过插入两个相邻的碱基对而结合在DNA分子上，导致双螺旋的部分松解，从而导致浮力密度的降低，对于线性DNA来说大约会降低0.125 g/cm3。超螺旋DNA由于不存在游离端，几乎不可能发生松解，因此只能结合有限量的EtBr。所以超螺旋分子的密度降低得会小一些，大约会降低0.085 g/cm3。这样一来，超螺旋分子在溴化乙锭-氯化铯密度梯度中形成的条带，与线性和开环DNA条带不在同一位置。

23 溴化乙锭－氯化铯密度梯度离心是一种获得纯净质粒DNA非常有效的方法。当用这一方法处理澄清溶菌液时，质粒DNA会在会在不同于线性DNA的位置形成条带，而蛋白质会悬浮在离心管的顶部，同时RNA沉降在离心管的底部。DNA条带的位置能过通过将紫外线照射在离心管上而被看见，因为EtBr上连接有荧光示踪剂。纯净质粒DNA可以通过注射器穿透离心管壁吸出。附着在质粒上的EtBr可以通过正丁醇萃取出来，而氯化铯则这可以用透析的方法除去。最终，得到的质粒制备物的纯度实际上达到了100 %。

24 质粒扩增 质粒DNA只占细菌全部DNA的很少一部分，因此，有时只能从细菌培养物中提取很少量的质粒DNA。质粒扩增的目的就是为了增加质粒的拷贝数，提高质粒DNA的产量。某些多拷贝质粒（拷贝数超过20个的质粒）具有能够在不进行蛋白质合成的情况下进行复制的能力。细菌染色体DNA的复制则不同，必须在进行蛋白质合成的情况下才能进行复制。在提取质粒DNA时，可以利用这种复制能力上的差别。

25 当细胞的密度达到要求时，可以向培养物中加入一种蛋白质合成抑制物（例如氯霉素），并继续进行培养超过12 h。在此期间，质粒分子持续复制，但是染色体的复制和细胞分裂却被阻断。这样，质粒的拷贝数就可以增加到上千个。扩增是一种增加多拷贝质粒产量的有效方法。

26 3.3 噬菌体DNA的制备 与细胞总DNA或质粒DNA的制备不同，提取噬菌体DNA的初始材料并非通常所用的细胞提取物。噬菌体颗粒要从被侵染的细菌细胞中释放出来，因此，是从细菌培养物中直接制备噬菌体颗粒的。当培养物被离心时，细菌被聚集成小球沉淀在离心管的底部，噬菌体颗粒留在悬液中。接着，把噬菌体颗粒从悬液中收集起来，去除蛋白质外壳后，就可以获得噬菌体DNA。

27 天然的λ噬菌体是溶源性的，而我们培养的是含有前噬菌体的溶源性细菌。细胞外的λ噬菌体的浓度非常低。为了提高细胞外λ噬菌体颗粒的浓度，培养物必须被诱导，使所有的细菌被裂解，并将λ噬菌体颗粒释放到培养基中。诱导过程是很难控制的，但是绝大多数实验室使用的是一种温度敏感突变型噬菌体，它的cI基因发生了突变。cI 基因是一种将噬菌体DNA保持整合状态所必须的基因，该基因失活将引起细胞的裂解。

28 在cI敏感突变中，cI基因在30℃时发挥作用，在该温度下正常的溶源性能够正常的发生。但是，当温度上升到42℃时，cI温度敏感突变基因就不能够正常工作，溶原性也就不能继续维持。因此，把培养物从30 ℃转移到42 ℃就能够诱导细胞裂解产生胞外噬菌体。

29 从被侵染培养物中收集噬菌体 被裂解的细菌细胞残留物，和一些未被侵染的细胞，通过高速离心可以从被侵染的培养物中分离出来，而把噬菌体颗粒留在上清中。现在的问题是如何将悬液的体积减少到5 mL以下，以利于进行DNA的抽提。

30 噬菌体颗粒非常小，必须在用很高的转速才能聚集，因此噬菌体的收集需要在聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）存在的情况下沉淀得到。聚乙二醇是一种长链多聚化合物，在盐存在的情况下，能够吸收水分，使像噬菌体颗粒这样大小的颗粒聚集沉淀。这些沉淀能够通过离心收集，并在一个适当的小体积中重新溶解。

31 从λ噬菌体颗粒中纯化DNA PEG沉淀物包含一定的细菌残片，这其中可能含有不希望的环状DNA。把PEG沉淀重新溶解，通过氯化色密度梯度离心纯化出λ噬菌体，λ噬菌体颗粒以1.45～1.50 g/cm3存在于氯化铯梯度上，并且像前面描述的那样从梯度中提取出来。利用透析除去氯化铯得到纯净的噬菌体制备物。这样一来，通过苯酚法或蛋白酶消化去除蛋白质外壳，到到纯净的噬菌体DNA。

32 M13噬菌体DNA的纯化 M13噬菌体和λ噬菌体的侵染循环存在许多的不同。首先， M13噬菌体的双链复制模式，就像一个高拷贝的质粒那样，非常容易通过标准的质粒纯化步骤进行纯化。这些步骤是：制备被M13噬菌体侵染的细胞提取物，通过密度梯度离心从细菌DNA中分离出M13噬菌体。

33 然而，在更多的情况下我们需要制备胞外噬菌体颗粒，这时噬菌体颗粒包含的是单链形式的M13基因组。由于被侵染的细胞不断向培养基中分泌M13噬菌体，而且永远不会发生细胞的溶解，所以仅仅通过将细胞培养到一个很高的密度就能够得到高浓度的M13噬菌体。事实上，不需要用到任何特殊的技巧，就能够达到每毫升1012个M13噬菌体或更高的浓度。这样高的浓度意味着大量的单链M13噬菌体DNA能够从小体积的培养物中得到，比如说，5 mL或更小的体积。

34 而且，既然被侵染细胞不发生溶解，也就不存在细胞残渣污染噬菌体悬液的问题。因此，对λ噬菌体制备必要的氯化铯密度梯度离心步骤，在M13噬菌体制备中很少用到。概括起来讲，单链M13噬菌体DNA的制备包括小体积被侵染培养物的生长；离心沉淀细菌，用PEG沉淀噬菌体颗粒；苯酚抽提分离噬菌体蛋白质外壳；乙醇沉淀浓缩制备DNA。