Centrifugal technique

Presentation on theme: "Centrifugal technique"— Presentation transcript:

1 Centrifugal technique
第四节 离心技术 Centrifugal technique

2 目录 一、离心技术发展历程及其工作原理 二、离心机的种类 三、离心机和转头的维护 四、离心机的事故 五、离心技术在样品制备中的作用

3 一、离心技术发展历程及其工作原理

4 一、离心技术发展历程及其工作原理 1.离心机发展历史 19世纪 手摇离心机 收集蜂蜜等
19世纪　手摇离心机　收集蜂蜜等 1923年  瑞典化学家　Svedberg 第一台具有光学系统的分析超速离心机，最高转速达45,000 rpm。 1926年　Svedberg　测定马血红蛋白分子量，首次证明蛋白质为均一的生物大分子。 1926 Nobel Prize in chemistry 1951年　Brakke MK 在差速离心的基础上发展了速率区带离心法。 1955年　Anderson N G发明了区带转头，并用区带离心法首次证明DNA双螺旋结构半保留复制的假说。 Theodor Svedberg

5 一、离心技术发展历程及其工作原理 1.离心机发展历史 20世纪60年代后 20世纪90年代中期 离心机制造工艺； 区带转头；
高强度的钛合金的应用； 半导体集成电路； 计算机技术的发展； 高频调速电机的使用。 20世纪90年代中期 碳素转头（超强超轻材料合成）， 抗拉强度比钛合金强。

6 2、基本原理与概念 R2+D2=(r+l)2 l l l

7 2、基本原理与概念 r 线速度V：物体运动的速率；角速度ω：物体在单位时间内转过的角度。 物理运动360度的路程为：2πr
周期T：运动一周所需的时间，T=2πr/V ω=2π / T =V / r 1.线速度V=s/t=2πr/T 2.角速度ω=Φ/t=2π/T=2πf V = ω×r

8 2、基本原理与概念 (1)、离心技术（Centrifuge Technique）:
利用物质在离心力作用下，按其沉降系数不同而分离的一种技术。 (2)、沉降现象 任何物体受地球引力的作用都具有下沉的现象，称为沉降现象。 υ=a*t=g*t (g为重力加速度，980cm/s2)。   物体在沉降过程中，其下沉的力在某个时刻总会与摩擦力、浮力达到平衡，使物体的受力为零，此时物体在做匀速运动，此时的速度称为临界速度。

9 2、基本原理与概念 （3）颗粒在重力场的运动 一个球型颗粒在具有重力场中的液体介质内，受到地球引力、 溶液浮力和溶液黏滞力的作用，出现不同的运动(粘滞力和浮力向 上，重力向下)。 重力　Fg＝1/6πd3ρpg （密度与体积的乘积） 粘滞力 　Ff=-3πηdv　(v为颗粒沉降速度，Stoke定律) 浮力 Fb=-1/6 π d3ρm g　(ρm为介质密度，阿基米德浮力定律) (d为颗粒直径，ρ为颗粒密度，g为重力加速度)。

10 2、基本原理与概念 当作用在颗粒上的总力为零时，颗粒做匀速运动，即达到临界 速度，作用力的关系式为： Fg = Fb+Ff；
当作用在颗粒上的总力为零时，颗粒做匀速运动，即达到临界 速度，作用力的关系式为： 　　 Fg = Fb+Ff； 　 V＝d2(ρp-ρm)g/18η 小结： (a)、与颗粒直径d2的大小成正比，颗粒大沉降快。 (b)、与颗粒和介质密度差(ρp-ρm)成正比，密度之差越大，沉降越快。 (c)、当ρp>ρm，颗粒沉降速度为正值，即颗粒在介质中往下沉；等于，做不定向运动；小于，颗粒在介质中上浮。 (d)、与引力g成正比，速度随着引力的增加而增加。 (e)、与介质粘度η成反比，速度随粘度的增加而降低。

11 2、基本原理与概念 (4)颗粒在离心场中的沉降 离心力的产生 5种力：离心力，向心力，重力，浮力，介质摩擦力
从理论上讲，只要颗粒的比重大于液体就会发生沉降，但是对于分离生物材料的样品，如细胞、细胞器、细菌、病毒、蛋白质和核酸等生物大分子来说，由于颗粒非常细小，依靠自然沉降是不能达到完全分离的，只能通过离心力的作用才能使它们沉降下来。 物体在围绕转轴以角速度旋转时，就产生离心场，物体在离心场中受到离心力的作用。 离心场的受力：G＝ω2r

12 2、基本原理与概念 (4)颗粒在离心场中的沉降 5种力：离心力，向心力，重力，浮力，介质摩擦力 电机的速度以每分钟的转数（r/min）表示。
G＝ω2r＝4π2N2r/3600 (N为每分钟的转数，单位为r/min；G的单位是cm/s2，正好与重力加速度g的单位一致。)

13 2、基本原理与概念 (4)颗粒在离心场中的沉降 5种力：离心力，向心力，重力，浮力，介质摩擦力
相对离心力（RCF） 　 在实践中，离心力可用重力加速度的倍数G/g来表示，称之为相对离心力，用RCF表示， 可将公式写成： RCF＝G/g=(4π2N2r/3600)/980=1.12×10-5N2r N=1000(RCF/11.2r)1/2

14 2、基本原理与概念 (4)颗粒在离心场中的沉降 5种力：离心力，向心力，重力，浮力，介质摩擦力
一般，低速离心，转速以r/min表示;高速离心，转速以重力加速度g表示。 计算颗粒相对离心力时，应注意离心管与中心轴间的距离，即离心半径r的长度。离心管所处的位置不同，沉降颗粒所承受的离心力也不同。 因此，超速离心常用重力加速度的倍数（×g）来代替转速（r/min），真正反映颗粒在离心管中所受到的离心力。

15 2、基本原理与概念 (4)颗粒在离心场中的沉降 5种力：离心力，向心力，重力，浮力，介质摩擦力
沉降系数(sedimentation coefficient or Svedberg unit, S)： 单位离心力场中颗粒的沉降速度。 S= υ /ω2r= υ /g =(ρp-ρm)d2/ 18η 沉降系数是生物大分子的特征常数，与颗粒密度、形状、大小，与介质密度、粘度，与温度、浓度都有关系。

16 2、基本原理与概念 20℃，以水为介质的条件下，测得S值为标准状态下的S值。 1S=10-13秒
K因子(表示沉降系数为s的颗粒，在转头的最大速度下离心时，颗粒从小半径沉降到大半径所需要的时间。) t=K/s 表示从离心管表面沉降到离心管底所需要的时间。K是转头的实际参数

17 2、基本原理与概念 沉降与相关因素 离心速度　其大小决定颗粒沉降的快慢，不同大小的颗粒使用不同的离心速度。大颗粒，质量大，在离心场中沉降速度快，只需低速离心。反之，需高速离心。 温度　不同温度下，不同介质的粘度不同。多数离心介质的粘度都会随着温度的变化而变化。因此在离心时要求温度恒定，尤其梯度离心对温度比较敏感，对离心环境温度要求较严。 离心时间 t=(1013/3600)(lnrb-lnrm)/ω2s rb：轴与离心管间距离 Rm：轴与管液面间距离 离心半径 1、有一定的离心体积； 2、根据转头大小半径决定颗粒下沉的距离。尤其在梯度离心时，距离短是不易将物质分开的。

18 3. 离心分离方法 (1)沉淀离心 (2)差速分级离心 (3)密度梯度离心

19 3. 离心分离方法 (1)沉淀离心 　 常用方法。指介质密度约1g/ml，选用一种离心速度，使悬浮液中的悬浮颗粒在离心的作用下完全沉淀下来，这种离心方式称沉淀离心。沉降速度与离心力和颗粒大小有关。

20 3. 离心分离方法 10,000g 离 心 1min 100g 100min 1000g 10min 2000g 5min
颗粒沉降离心中的两个因素： 相对离心力（g）和时间（min） 沉降某颗粒需10,000g* min 10,000g 离 心 1min 100g 100min 1000g 10min 2000g 5min

21 3. 离心分离方法 (2)差速分级离心(又称分步离心法) 凡是利用颗粒在离心场中的沉降系数差异进行逐级分离的离心方法，称差速离心。
　凡是利用颗粒在离心场中的沉降系数差异进行逐级分离的离心方法，称差速离心。 　差速离心是建立在颗粒的大小、密度和形状有明显的不同，沉降存在较大的差异的基础上进行分离的方法。一般用于粗级分离，而不用于精细分离。

22 3. 离心分离方法 (2)差速分级离心(又称分步离心法) 优点： 1.操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开；
2.分离时间短、重复性高； 3.样品处理量大。 缺点： 1.分辨率有限、分离效果差，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开； 2.壁效应严重，在离心管一侧会出现沉淀； 3.颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。

23 3. 离心分离方法 (3)密度梯度离心 凡使用密度梯度介质离心的方法称这密度梯度离心或称区带离心。 分辨率比差速离心高：
　凡使用密度梯度介质离心的方法称这密度梯度离心或称区带离心。 分辨率比差速离心高： 差速离心　沉降系数相差10倍以上； 密度梯度离心　沉降系数相差10%－20%s的颗粒或颗粒或密度差小于0.01g/ml的组分。 温馨提示： 　一是制备梯度液时，应考虑样品体系中最小颗粒的密度大于任何位置的介质密度。 　二是控制离心时间，要在所需样品到达管底前停止离心。　

24 3. 离心分离方法 (3)密度梯度离心 优点： 1.具有很好的分辨率，分离效果好，可一次获得较纯颗粒；
2.适用范围广，既能分离沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒； 3.颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。 缺点： 1.离心时间较长； 2.需要制备梯度液； 3.操作严格，不宜掌握。

25 3. 离心分离方法 (3)密度梯度离心 类型一 速率区带离心：因颗粒的不同沉降速度而分层。
　 速率区带离心：因颗粒的不同沉降速度而分层。 把样品放在梯度介质的顶端。可分离与密度介质相当的细胞、细胞器、DNA和蛋白质，分离效果只与分离物质的的大小有关，与介质的密度无关。

26 3. 离心分离方法 (3)密度梯度离心 类型一 　 速率区带离心：因颗粒的不同沉降速度而分层。 分离液：Ficoll、Percoll及蔗糖

27 3. 离心分离方法 (3)密度梯度离心 类型二 等密度区带离心：因颗粒的不同密度而分层。
　 等密度区带离心：因颗粒的不同密度而分层。 　　在等密度介质中的密度范围正好包括所有分离颗粒的密度。样品可以加在制成的梯度介质的上面，也可以与密度介质混合在一起，离心后会形成自成型梯度。

28 3. 离心分离方法 (3)密度梯度离心 类型二 　 等密度区带离心：因颗粒的不同密度而分层。

29 3. 离心分离方法 (3)密度梯度离心 类型二 等密度区带离心：因颗粒的不同密度而分层。
　 等密度区带离心：因颗粒的不同密度而分层。 颗粒在等密度梯度的介质中，经过离心，最终将停留在与其浮力密度相等的区域内，形成一个区带。 颗粒密度和介质密度达到平衡时，所形成的颗粒区带就停止运动，延长离心时间对离心效果无明显影响，即此时与离心时间无关。

30 3. 离心分离方法 (3)密度梯度离心 密度梯度离心的制备： 密度梯度溶液 不均一，密度随着旋转半径的增加而增加
e.g. 5%（1.018g/ml）－20%(1.077g/ml)蔗糖为梯度液 密度梯度材料 氯化锂，氯化铯，氯化铷，酒石酸钾，甘油， 蔗糖和聚蔗糖等。

31 3. 离心分离方法 (3)密度梯度离心 梯度材料的选择 不能与样品发生化学反应 pH、渗透压
不能影响所用的测量技术，e.g. 蛋白质－280nm 不能对转头有腐蚀 梯度的形状 预成型梯度：线性梯度，不连续的阶梯梯度，指数梯度 自成型梯度 细胞 动植物组织 中的亚细胞 易上浮 的脂蛋白 蛋白质 酶 核核糖体亚基 植物病毒

32 3. 离心分离方法 (3)密度梯度离心 梯度的制备 不连续梯度：通过手工制作，梯度界面不能破坏。 连续梯度：梯度混合器 加样
用注射器将样液加在梯度液上面样品体积和浓度适量 　　注意：离心管内的梯度液可承受的样品的最大浓度为该密度梯度液中最低密度梯度浓度的1/10。

33 3. 离心分离方法 (3)密度梯度离心 等密度加样：样液加在密度介质的上面或与密度介质 混合在一起。 加样时注意： 不要污染样品
　　　　　　混合在一起。 加样时注意： 不要污染样品 不要破坏梯度的稳定性 在操作过程中不能使气泡进入梯度中 样品的回收 手工回收

34 二、离心机的种类

35

36 二、离心机的种类 (一)、分类 1.按离心机的速度： (1) 低速离心机 最大转速 (Vmax) 一般在6000r/min。
2.按离心机的用途： (1) 小型离心机　小量快速离心 (2) 制备型大容量低速离心机　Vmax ＝6000 r/min，最大离心力6000×g，最大容量达500ml×6。 (3) 高速冷冻离心机　Vmax＝18000~21000 r/min，最大离心力在50000×g。适用于细胞和亚细胞 的分离。

37 二、离心机的种类 (一)、分类 2.按离心机的用途：
(4) 超速离心机　最大离心力可达800000×g，可进行小量制备，适用于蛋白质、核酸和多糖等生物大分子的制备。 (5)分析型离心机　用于生物大分子定性、定量分析。 (6) 连续流离心机　处理类似于发酵液等特大体积、浓度较稀的样品，最大离心速度与高速离心机相似。 分析型离心机系统示意图 3.按离心机的驱动系统： (1) 空气驱动离心机 (2) 油涡轮驱动离心机 (3) 电刷电机驱动离心机 (4) 变频电机驱动离心机

38 （二）、基本结构 离心室 制冷系统 驱动系统 光学系统 控制系统 转头 真空系统

39 （二）、基本结构 1. 转头 (1) 分类 角转头 适用于差速离心、等密度离心，容量大，转头内容纳的离心管多。
角转头　适用于差速离心、等密度离心，容量大，转头内容纳的离心管多。 水平转头　离心管组装在转头的吊桶内，离心机静止状态时离心管为垂直状态，离心时离心管与轴垂直。适合于区带离心和等密度离心。 垂直转头　适合于质粒DNA的纯化，不适合于差速离心。  近垂直转头　对质粒DNA和RNA的分离纯化特别有效。 区带转头　 连续流转头　

40 分离速度（时间，转头半径） 垂直转头　近垂直转头　固定角转头　水平转头 纯度

41 （二）、基本结构 (2) 性能 铝合金转头 适合于pH6-8的中性溶液离心 用中性溶液洗涤 强度不高，易加工，易碰伤。
铝合金转头　 适合于pH6-8的中性溶液离心 用中性溶液洗涤 强度不高，易加工，易碰伤。 高浓度盐长期接触会产生内结晶，影 响转头的强度。 温度不得超过60℃,更不能用高温灭菌处理价格便宜，使用寿命短。 不锈钢转头 耐腐蚀，对酸、碱、盐溶液均适宜。 机械强度高，加工难。 质量大，离心速度不高。 使用寿命长，价格较便宜。

42 （二）、基本结构 (2) 性能 钛合金转头 耐腐蚀，对酸、碱（pH3.5-11）溶液均适宜。 机械强度高，加工难。 质量较大，离心速度高。
使用寿命长，价格较贵。 碳素转头 质量轻，有利于提速。 耐腐蚀，在偏酸性或偏碱性的溶液中均可使用。 机械强度高，加工容易。 使用寿命长，价格昂贵。

43 (三)、离心机和转头 Beckman LE-80K 　(Optimal系列) 转头：SW28 　　　SW55 　　　Ti90 超速离心机

44 (三)、离心机和转头 (1) 转头的主要参数 最大转速 转头的抗拉强度是有限的，与转头的类型、构造和材料有关 最大离心力
最大转速　转头的抗拉强度是有限的，与转头的类型、构造和材料有关 最大离心力　 最大容量　每个转头中容纳离心管数乘以离心管的最大体积就是该转头的最大容量。 K因子　在最大的转头速度下，由最小半径沉降到最大半径所需要的时间。 K越小，离心能力越大 。

45 (三)、离心机和转头 (2) 超速离心机转头的主要参数 转头名称 离心管体积 最大相对速度(g) Ti90 13.5 ml 548,000
Type70.1 Ti 10.4 ml 388,000 Type 70 Ti 26.3 ml 371,000 SW32 Ti 17 ml 187,000 Type 45 Ti 70 ml 235,000 SW28 28 ml 141,000 SW55 5 ml 368,000 NVT65 11.2 ml 402,000 VTi50 36.2 ml 242,000 TLA-120.1 0.5 ul 279,000

46 三、离心机和转头的维护

47 三、离心机和转头的维护 1.离心机安全操作 不过速运转 平衡运转 准确组装转头 不使用带伤转头 不使用过期转头

48 三、离心机和转头的维护 2.离心机的维护 每次用毕，对于超速离心机，只需定期清洁离心机内腔。
对于高速离心机，每次必须将内腔擦干，且不能长期将转头置于转轴上，以免传感器受潮失灵。

49 三、离心机和转头的维护 3.转头的维护 离心机转头，如果忽视其设置的精密程度和严格的使用方法，就会大大影响它的奉命。事实上，一个转头在承受一百万倍的大气压下，一克就相当于一吨的重量，若转头的表面有很细微的裂缝，对转头就会造成很大的影响，此影响可能会超过转头原本设置所能承受的范围。

50 三、离心机和转头的维护 3.转头的维护 （1）维护转头寿命的三个因素： 专门的设计和制造 使用中的注意事项和合理的操作
当损坏或因疲劳连续使用而产生不安全时，转头必须停用 (2) 转头的设计与制造 　　一般的生产厂家，在制造转头时，会进行转头/马达系统的震动测试。它们会在一个特殊构造的房间里进行非破坏性和破坏性试验，来检验转头的寿命。 (3)引起离心机转头损坏的原因 金属疲劳 化学腐蚀 应力腐蚀

51 三、离心机和转头的维护 3.转头的维护 (3)引起离心机转头损坏的原因 金属疲劳
转子在加速过程中，材料内部多次重复受到拉伸或松驰的交变引力的作用，引起材料结构细微变化，经过一定次数的交变引力循环，这些细微变化导致极细微的裂纹。 化学腐蚀 由于所用的离心管不能承受介质的性质，或者离心管存放太久，老化后受不了强离心力的缘故，会造成离心管的破裂，样品渗漏到转头内。 若没按规定程序操作，造成转头不密封，当抽真空时，转头内腔产生负压，也会样品渗漏，对转头产生化学腐蚀而严重影响转头的寿命。

52 三、离心机和转头的维护 3.转头的维护 (3)引起离心机转头损坏的原因 (4) 转头操作的注意事项 应力腐蚀
应力腐蚀是金属疲劳和化学腐蚀两者同时作用产生的结果。当转头某部分因受化学腐蚀或破 损后，该部分所承受的引力增大了，此种情况下，转头便会很容易毁坏。 (4) 转头操作的注意事项 避免CsCl结晶　 CsCl温度过低产生结晶，沉降就会胀破离心管，从而损坏转头。 转头需加盖 由于疏忽大意，勿将转头盖盖紧，或忘记加盖，当转头运行时，离心腔内会产生空气旋涡使转头浮起，转头离开转轴而发生意外。因此在仪器启动时，应再检查转头盖是否已盖紧。

53 三、离心机和转头的维护 3.转头的维护 注意溶液密度对转头速度的限额
溶液密度大小对转头强度受力有很大关系，在进行密度梯度或等密度离心时，配置的介质密度必须低于说明书中标记的转头所能承受的最大密度。若高于该密度，可用下列公式计算最大速度： 当采用塑料管戴硬铝帽、样品比重大于1.2，新的 最大速度＝转子最大转速＊(1.2/新的密度)1/2 当采用不锈钢管戴硬铝帽，样品比重小于1.2，最大允许转速必须减少设定速度的15%，即最大允许速度＝最大设定转速＊（1－15%） 当采用不锈钢管及管帽、样品比重小于1.2时，最大设定转速必须减少25%

54 三、离心机和转头的维护 3.转头的维护 (5)转头的保养 转头的清洁 转头干燥，涂油保养 密封圈 所有的转头使用后必须用温水洗涤并干燥，
如果必须使用去污剂，则不应使用碱性去污剂。 转头干燥，涂油保养 严禁将转头浸泡在去污剂中。冲净后的转头必须干燥，通常在室温下将转头倒置自然干燥。转头外表可稍涂些硅脂保护表面，转头内壁腔可涂上硅油保护。 密封圈 转头盖与吊桶内壁的密封圈可使转头和离心管在密封的情况下运行，如果密封圈老化，转头内便因离心腔抽真空而形负压，使离心管破裂或渗漏损坏转头。因此，密封圈如有损坏，应及时更换，更换前应涂上真空脂，加强保护。

55 三、离心机和转头的维护 3.转头的维护 超速盘的更换
为了保证转子的正常运行，使用前必须检测超速盘有否磨损，转子使用后，将转子清洗倒放在实验桌上。当发现转子底部的超速盘损坏或磨损，必须立即更换。首先将损坏的超速盘取下，然后用四氯化碳有机溶剂清洗干净，再将备用的超速盘换上。 转头寿命的折算 一般是最大转速的次数。若转头动作已超过其寿命保证期，在没有任何损伤的情况下，转头应按90%折算后再继续使用。

56 四、离心机的事故

57 后果 正在旋转

58 五、离心技术在样品制备中的作用

59 五、离心技术在样品制备中的作用 分离活体生物：　细胞、微生物、病毒 　　　细胞器：　细胞核、细胞膜、线粒体 　生物大分子：　核酸、蛋白质、酶、多聚物

60 五、离心技术在样品制备中的作用 分离活体生物：　细胞、微生物、病毒 　　　细胞器：　细胞核、细胞膜、线粒体 　生物大分子：　核酸、蛋白质、酶、多聚物

61 作业 1、请设计一个方案分离提纯大豆根的细胞核、线 粒体以及叶绿体蛋白质（以差速离心技术为核心）
1、请设计一个方案分离提纯大豆根的细胞核、线 粒体以及叶绿体蛋白质（以差速离心技术为核心） 温馨提示：第9次上课前交；纸质打印版，电子版； 格式参照毕业论文形式。

62