ELISA酶联免疫吸附法 （Enzyme Linked Immunoserbent Assay）

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1 ELISA酶联免疫吸附法 （Enzyme Linked Immunoserbent Assay）

2 酶联免疫吸附法 （Enzyme Linked Immunoserbent Assay，简称ELISA）
1974年Voller等人改用聚苯乙烯微量反应板作为固相免疫吸附载体，使ELISA法得以推广应用。ELISA法除保留抗原、抗体反应的高度特异性外，由于标记酶的酶促反应的放大作用，使测定的灵敏度可达到ng甚至pg的水平。目前，ELISA法已在医学临床上、生物学研究上测定各种各样抗原，半抗原和抗体，特别是在单克隆抗体研究中，为杂交瘤细胞株的筛选，提供了简便、灵敏，快速的测定方法物。

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7 测定抗体的间接法 1．将抗原吸附于固相载体表面，洗涤除去未吸附的抗原。 2．加抗体，保温，形成抗原—抗体复合物洗涤除去其余的杂蛋白．
3．加酵标抗抗体，保温，洗涤。 4．加入底物，测定底物的降解量二抗体量。

8 间接法 夹心法 竞争法

9 2．测定抗原的双抗体夹心法 首先将特异抗体的免疫球蛋白吸附在反应板凹孔内，洗涤除去未吸附的抗体，加入含有抗原的待测溶液，保温形成抗原—抗体复合物，洗涤除去杂蛋白后再加上述特异抗体，由于抗原是多价的并未被抗体饱和，经保温则可形成抗体—抗原—抗体复合物，洗涤后加酶标抗抗体，保温洗涤后加底物呈色，中止酶活性，比色测定抗原量。

10 3．测定抗原的竞争法 将含有特异抗体的免疫球蛋白吸附在两份相同的载体（甲）和（乙）中，然后在（甲）中加入酶标抗原和待测抗原，（乙）中只加酶标抗原，其浓度相同于（甲）中加入的酶标抗原的浓度，保温洗涤后加底物呈色。待测液中未知抗原量愈多，则酶标抗原被结合的量就愈少，有色产物就愈少，以此便可测出未知抗原的量，即等于（甲）与（乙）底物降解量的差值.

11 ELISA体系的构建 酶的交联 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶等常用于ELlSA法。

12 酶交联的方法 辣根过氧化物酶交联在抗体上的方法主要有两种，即戊二醛法和过碘酸氧化法。 1．戊二醛法
戊二醛作为双活性试剂可将酶与抗体交联在一起，交联法是把一定量的酶、抗体和戊二醛同时加入溶液中，在—定温度下反应—段时间，然后用透析法或凝胶过滤除去未结合的戊二醛即可得到酶结合物。

13 过碘酸盐氧化法 辣根过氧化物酶是—种带糖的酶。糖含量约占18％，过碘酸盐可将糖中的羟基氧化成醛基，再与抗体直接连接。
然后加硼氢化钠还原形成稳定的酶结合物。该法交联效果比戊二醛法好，结合物中HRP与抗体的摩尔比在2—3之间，参与酶结合物中的HRP可达70％，而抗体则可达99％。

14 显色系统 各种免疫酶技术，无不以某种显色反应面揭示待测物质。不同酶要选择相应的底物。 免疫酶技术中常用的酶—底物系统
酶、底 物、显色反应、测定波长

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17 单击显示ELISA酶联免疫吸附法的应用