第一节 抗原－抗体反应 抗原与相应抗体在体内或体外相遇可发生特异性结合，呈现的某种反应现象。.

Presentation on theme: "第一节 抗原－抗体反应 抗原与相应抗体在体内或体外相遇可发生特异性结合，呈现的某种反应现象。."— Presentation transcript:

1 第一节 抗原－抗体反应 抗原与相应抗体在体内或体外相遇可发生特异性结合，呈现的某种反应现象。

2 抗原抗体反应有以下几个特点: 1.抗原与抗体结合是特异性结合 表位(抗原)——超变区(抗体) 2.抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合
氢键、疏水键、静电引力和范德华力(Van der waal‘s force) 、电子云力的合力。 抗原和抗体可解离,性质不变。

3

4 3.抗原抗体反应可分为两个阶段 （1）特异性结合阶段  此阶段需时短,仅需几秒到几分钟,无可见 反应出现 （2）可见反应阶段 需时较长,数分,数小时或数日出现可见现 象,表现为沉淀,凝集,细胞溶解等 4.抗原和抗体结合是否呈现明显可见的反应现 象,与两者的分子比例密切相关

5

6

7 抗原抗体反应的主要影响因素： 1.电解质: 在中性或碱性条件下,抗原抗体均带负电荷,适当浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷而互相结合,出现明显的沉淀或凝集现象。 2.温度: ℃ 3. 酸碱度: pH6-8

8 抗原抗体反应包括： 沉淀反应 凝集反应 溶解反应 补体结合反应 中和反应 已知抗体 检测未知抗原； 已知抗原 检测未知抗体。

9 一、沉淀反应(precipitation)
概念：可溶性抗原与相应抗体在电解质存在条件下结合，出现沉淀物的现象。 沉淀反应的试验方法：环状法 絮状法 琼脂中沉淀法

10 环状法 —— 重层法 灵敏度：0.5ug抗体/ml 原理：

11 絮状法 —— 混合法 灵敏度：1.5ug抗体/ml 原理：

12 琼脂中沉淀反应法： 双向免疫扩散(double immunodiffusion) 单向免疫扩散(single radial
对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis) 火箭电泳(rocket electrophoresis) 免疫电泳(immunoelectrophoresis)

13

14 (一)双向免疫扩散(double immunodiffusion) 原理：在琼脂板上按一定距离打孔，抗原和抗体分别加入相邻孔中，使其向孔周围扩散，比例适宜相对应的抗原抗体结合，在抗原抗体孔间出现白色的沉淀线(沉淀物)。 灵敏度：1～20μg抗体/ml 应用： 主要用于检测体液中各种蛋白成分，如甲胎蛋白（AFP）、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）等。

15

16 (二)单向免疫扩散(single radial
immunodiffusion) 原理：抗体预先与琼脂混匀制成凝胶板，打孔,将可溶性抗原加至孔中，向周围扩散，与抗体在比例适宜处形成白色沉淀环。沉淀环的直径与抗原浓度呈正相关。根据沉淀环直径大小从预先绘制成的标准曲线，查出待测标本中抗原含量。 优点：定量测定抗原，方法简便，易观察结果。 灵敏度：1～20μg／ml。 缺点：需时长，1～2天观察结果。 应用：常用于血清中IgG、IgM、IgA和C3的定量检测。

17

18 (三)对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis) 原理：在电场中进行双向免疫扩散。 加抗原孔靠近阴极，加抗体孔靠近阳极。通电(缓冲液pH 8.6)后，抗原向阳极泳动，抗体向阴极泳动，二者在比例适宜处形成白色沉淀线。 特点：出结果快于双向免疫扩散，约需1小时； 灵敏度:10μg／ml。

19

20 (四)火箭电泳(rocket electrophoresis,又称电免疫扩散)
原理：在电场中进行单向免疫扩散。 抗原在含抗体的琼脂中泳动，二者于比例适宜处形成沉淀峰。沉淀峰的高度与抗原含量成正比。从参考曲线查出抗原含量。 敏感度： 1～20μg／ml 优点：需时较短。 应用：测定抗原含量。

21

22 (五)免疫电泳(immunoelectrophoresis)
原理：将抗原在琼脂平板上进行电泳，然后沿电泳方向挖一与抗原平行槽，加入抗体，进行双向免疫扩散。抗原与抗体在比例适宜处形成沉淀弧。根据沉淀弧的数量、位置和形状，与已知标准抗原比较，即可分析抗原的成分及性质。 应用：血清蛋白组分分析； 抗原成分分析。

23

24 二、凝集反应(agglutination)
概念：颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶性抗原(或抗体)于相应抗体(或抗原)，在电解质存在下出现凝集物的现象。

25 凝集反应包括： ◆ 直接凝集反应 (direct agglutination) ◆ 间接(被动)凝集反应(indirect/passive
◆ 间接凝集抑制试验(indirect agglutination inhibition test) ◆ 协同凝集试验(coagglutination test) ◆ 抗球蛋白试验(antiglobulin test，Coomb’s test)

26 (一)直接凝集反应(direct agglutination)
原理：颗粒性抗原(本身) + 抗体 凝集 包括： 玻片法：定性，用于：菌种鉴定 人ABO血型鉴定 试管法：半定量，用于：伤寒或副伤寒诊断 肥达氏反应(Widal test), 布氏菌病诊断 瑞特氏反应 (Wright test)

27

28 直接凝集反应（玻片法）

29

30

31

32

33 原理： 可溶性抗原(或抗体)，吸附颗粒载体 ＋ 抗体(或抗原)  凝集 间接凝集反应种类及所用载体
(二)间接(被动)凝集反应(indirect/passive agglutination) 原理： 可溶性抗原(或抗体)，吸附颗粒载体 ＋ 抗体(或抗原)  凝集 间接凝集反应种类及所用载体 间接凝集反应 载体 间接血凝实验 红细胞 间接乳胶凝集实验 聚苯乙烯胶乳颗粒 间接炭凝实验 活性炭

34

35 (三)间接凝集抑制试验 (indirect agglu-tination inhibition test)
原理： 抗体 ＋ 反应 ＋ 抗原致敏载体颗粒 可溶性抗原 凝集

36

37

38 (四)协同凝集试验(coagglutination test) 原理：
IgG结合于SPA (金黄色葡萄球菌) ＋ 凝集 抗原(可溶性） 应用：检测微量抗原(存在于血液、脑脊液和其他分泌液)。用于流脑、伤寒、布氏菌病等的早期诊断。

39

40 (五)抗球蛋白试验(antiglobulin test，Coomb’s test)
原理： 红细胞(Rh+) ＋ 凝集(不可见) ＋ 抗人球蛋 抗Rh抗体(IgG) 白抗体 凝集(可见) 灵敏度：3X10-2ug/ml 二种方法：A.直接抗球蛋白实验 B.间接抗球蛋白实验

41

42

43 三.免疫标记技术 用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体(或抗原)，与抗原(或抗体)进行反应，通过检测示踪物质，分析被检抗原(或抗体)的存在或含量的方法。 灵敏度：高，1X10-4 ～1X10-5ug抗体/ml 应用：微量物质的定性、定量或定位。

44 免疫标记技术的基本类型： （一）免疫荧光技术(immunofluorescence technique)
（二）免疫酶技术(immunoenzymatic （三）同位素标记技术(isotope labelling

45 （一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技术) 原理：用荧光素(如异硫氰酸荧光素、罗丹明B200等) 标记抗体(荧光抗体)，用荧光抗体浸染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体结合，于荧光显微镜下观察荧光，确定被检抗原的存在。 免疫荧光技术包括： 直接法 间接法 间接补体增强法

46 1．直接法 优点：特异性强 缺点：必须制备针对每一种抗原的荧光抗体。 应用：用于抗原鉴定、定位和分布。

47 2．间接法 用荧光素标记抗球蛋白抗体(荧光抗抗体) 优点：只制备一种荧素光标记的抗体，可检测多种抗原或抗体 缺点：易产生非特异性荧光

48 应用： （1）检测抗原：如T细胞亚群检测 【抗体(第一抗体，已知) ＋ 抗原】＋荧光抗抗体(第二抗体) 荧光显微镜下观察荧光
【抗体(第一抗体，已知) ＋ 抗原】＋荧光抗抗体(第二抗体) 荧光显微镜下观察荧光 （2）检测抗体：如抗核抗体检测 【抗原(已知)＋抗体(未知抗体)】＋荧光抗抗体(第二抗体) 荧光显微镜下观察荧光

49 3．间接补体增强法 原理：{【抗体(或抗原，已知) ＋ 抗原 (或抗体，未知)】＋ 补体} ＋ 荧光标记抗补体C3的抗体 显微镜下观察荧光
优点：敏感性高 缺点：易产生非特异性荧光 应用：检测抗原或抗体

50

51 （二）免疫酶技术(immunoenzymatic
techniques) 是将抗原抗体反应与酶催化底物的作用相结合的一种方法。 主要有两种类型： 1.免疫酶染色 2.酶免疫测定（enzyme immunoassay, EIA）

52 1.免疫酶染色(又称免疫组化技术, immunohistochemistry technique) 原理：用酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等) 标记抗体(酶标抗体)，将酶标抗体与抗原(细胞或组织切片)作用，抗原与酶标记抗体结合，加底物，酶催化底物产生有色物质，观察结果。 应用：细胞内、组织内抗原的定性、定量和定位检测。

53 2.酶免疫测定 酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)
原理：①将抗原(或抗体)结合于固相载体； ②与抗体(或抗原)反应；③加酶底物，酶促反 应。 灵敏度：2X μg／ml 应用：广泛，可检测微量抗体和抗原(如微生物成分、激素、细胞因子、粘附分子等）。

54 ELISA法： 直接法 间接法 双抗体夹心法(双位点法) 竞争法

55

56

57

58 (三) 同位素标记技术(isotope-labelling technique)
放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA) 是一种放射性同位素分析与抗原抗体反应相结合方法。 优点：灵敏度高, 可检测0.001pg／mL 特异性强 应用：微量抗原和抗体检测。 缺点：不稳定，废物处理麻烦等。

59 1.检测抗原 抗原竞争法 【Ab(有限量) + Ag(待测）】 + Ag*(已定量) ↓ Ag-Ab复合物或Ag*-Ab 分离Ag*-Ab和游离Ag* 测定Ag*-Ab和游离Ag*放射性 从标准曲线上读知含量

60 2.检测抗体 放射过敏原吸附试验 (radioallergosorbent test ,RAST) 原理：与ELISA间接法相同。 应用：可用于病人血清中过敏原特异性 IgE抗体的定性或定量检测。

61 （四）发光免疫分析(luminescent immuno-assay, LIA)
原理：用发光物质标记抗体(或抗原),再同抗原(或抗体)进行反应，以发光现象作为抗原抗体反应的指示系统。 应用：定量检测抗原、抗体。 发光分为：化学发光(chemiluminescence) 生物发光（bioluminescence）

62 化学发光原理： 发光物质 激发态分子 基态分子 释放光子(发光) 化学发光剂：鲁米诺（luminol ） 反应剂：过氧化阴离子 反应剂

63 （五）免疫胶体金技术(colloidal gold／immunogold staining)
原理：胶体金标记蛋白质(如抗体) + 组织细胞(待测) 观察结果(用电镜、光镜或肉眼) 应用：免疫组织化学定位，测定细胞表面标志和细胞内成分。 优点：易行、省时、价廉、灵敏度高。 胶体金：用还原法将四氯金酸(HAuCl4)制成特定大小的金颗粒，该颗粒由于静电作用呈稳定的胶体状态，称为胶体金。