分子生物学 第六章 分子生物学研究法（下） ——基因功能研究技术 第一节 基因表达研究技术 第二节 基因敲除技术.

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1 分子生物学 第六章 分子生物学研究法（下） ——基因功能研究技术 第一节 基因表达研究技术 第二节 基因敲除技术

2 2 目录 基因表达研究技术 转录组测序 RNA的选择性剪接技术 原位杂交技术 基因定点突变技术 基因敲除技术

3 转录组 广义 狭义 组学下的中心法则 所有mRNA,rRNA,tRNA,non-codingRNA 的总和 所有mRNA的总和
3 转录组 广义 所有mRNA,rRNA,tRNA,non-codingRNA 的总和 狭义 所有mRNA的总和 组学下的中心法则 基因组——转录组——蛋白质组

4 转录组的研究 研究思路 研究的基本方法 特定条件下，细胞内mRNA丰度描述基因表达 水平 外推到蛋白质产物的丰度 基因芯片技术
4 转录组的研究 研究思路 特定条件下，细胞内mRNA丰度描述基因表达 水平 外推到蛋白质产物的丰度 研究的基本方法 基因芯片技术 转录组测序技术

5 转录组测序方法：EST 表达序列标签技术 Expressedsequencetag,EST EST数据目前最多，但测序通量小，测序成本
5 转录组测序方法：EST 表达序列标签技术 Expressedsequencetag,EST EST数据目前最多，但测序通量小，测序成本 高，不能得到基因表达丰度的信息

6 转录组测序方法：SAGE expression,SAGE 基因表达系列分析技术 Serialanalysisof
6 转录组测序方法：SAGE 基因表达系列分析技术 Serialanalysisof expression,SAGE 获得短的序列标签 (10-14bp)，确定转录信息 将短序列标签有序连接起来，克隆 定量测定标签的数量，从而得到其表达水平

7 7 SAGE

8 8 目录 基因表达研究技术 转录组测序 RNA的选择性剪接技术 原位杂交技术 基因定点突变技术 基因敲除技术

9 RNA的选择性剪接技术 不同的mRNA剪接异构体的过程 用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生 分类
9 RNA的选择性剪接技术 用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生 不同的mRNA剪接异构体的过程 分类 平衡剪接、5’选择性剪接、3’选择性剪接、 外显子遗漏性剪接、相互排斥性剪接 研究方法 RT-PCR（real-timePCR）

10 10 RNA的不同选择性剪接方式 平衡剪接 5’选择性剪切 3’选择性剪切 外显子遗漏性剪切 相互排斥性剪切

11 RNA选择性剪接的研究方法：RT-PCR
11 RNA选择性剪接的研究方法：RT-PCR 不同组织来 源的RNA反转录 成cDNA 用相同引物进 行PCR 观察PCR产物 差异 分析是否来 源于选择性剪接

12 12 目录 基因表达研究技术 转录组测序 RNA的选择性剪接技术 原位杂交技术 基因定点突变技术 基因敲除技术

13 原位杂交技术（insituhybridization,ISH）
13 原位杂交技术（insituhybridization,ISH） 用标记的核酸探针，经放射自显影或非放 射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色 体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种 手段 分类 RNA原位杂交 染色体原位杂交

14 RNA原位杂交 被固定的组织切片反应 两者杂交产生双链RNA，通过检测放射性标 记或者酶促免疫反应显色，对该基因的表达
14 RNA原位杂交 用放射性或非放射性标记的特异性探针与 被固定的组织切片反应 若细胞中存在与探针互补的mRNA分子， 两者杂交产生双链RNA，通过检测放射性标 记或者酶促免疫反应显色，对该基因的表达 产物在细胞水平上进行定性定量分析

15 15 RNA原位杂交

16 染色体原位杂交：荧光原位杂交 后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的 序列结合 确定DNA在染色体上的位置
16 染色体原位杂交：荧光原位杂交 对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然 后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的 序列结合 再通过与荧光素分子偶联的单克隆抗体来 确定DNA在染色体上的位置 优点 不需放射性同位素，实验周期短，检测灵敏度 高，可同时观察几个DNA探针的定位

17 17

18 18 目录 基因表达研究技术 转录组测序 RNA的选择性剪接技术 原位杂交技术 基因定点突变技术 基因敲除技术

19 基因定点突变技术(site-directedmutagenesis)
19 基因定点突变技术(site-directedmutagenesis) 改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编 码的氨基酸序列 研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结 构、催化活性以及结合配体能力的影响 改造DNA调控元件特征序列，修饰表达载 体，引入新的酶切位点 目前无法精确预测氨基酸残基变化对整个 蛋白质结构和活性的影响

20 20 基因定点突变的方法 两种PCR方法 重叠延伸技术 大引物诱变法

21 重叠延伸技术：1/2 PCR1 PCR2 重叠延伸、 PCR3 模板DNA 5’ 3’ 3’ 5’ 引物变性和退火 FM RM F2 5’
21 重叠延伸技术：1/2 模板DNA 5’ 3’ 3’ 5’ 引物变性和退火 FM RM F2 5’ 3’ 5’ 3’ R2 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ PCR1 PCR2 重叠延伸、 PCR3 5’ 3’ 3’ 5’

22 22 重叠延伸技术:2/2 3’ 5’ 5’ 3’ PCR4

23 大引物诱变法 X PCR1 大引物 大引物和野生型DNA分子混合，退火 PCR2 5’ 3’ R1 3’ 5’ M 5’ 3’ 3’ 5’
23 大引物诱变法 5’ 3’ R1 3’ 5’ M PCR1 5’ 3’ 3’ 5’ 大引物 大引物和野生型DNA分子混合，退火 5’ 3’ X 3’ 5’ 5’ 3’ PCR2 F2 5’ 3’ 3’ 5’

24 PCR介导的定点突变的优点 选 引入突变 克隆 突变体回收率高，有时不需进行突变体筛 能用双链DNA作为模板，可以在任何位点
24 PCR介导的定点突变的优点 突变体回收率高，有时不需进行突变体筛 选 能用双链DNA作为模板，可以在任何位点 引入突变 可在同一试管中完成所有反应 快速简便，无需在噬菌体M13上进行分子 克隆

25 25 目录 基因表达研究技术 基因敲除技术 基本原理 高等动物基因敲除技术 植物基因敲除技术

26 基本原理 DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰 和基因改造，具有专一性强，染色体DNA可 与目的片段共同稳定遗传等特点
26 基本原理 又称基因打靶，通过外源DNA与染色体 DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰 和基因改造，具有专一性强，染色体DNA可 与目的片段共同稳定遗传等特点 1985年 成功将外源质粒p∆β117插入到人 类染色体DNA β-珠蛋白位点，首次在哺乳动 物细胞中进行成功的基因打靶

27 基因敲除技术的基本原理 分类 完全基因敲除 完全消除细胞或动物个体的靶基因活性 条件型基因敲除（不完全基因敲除） 特定时间和空间的基因敲除
27 基因敲除技术的基本原理 分类 完全基因敲除 完全消除细胞或动物个体的靶基因活性 条件型基因敲除（不完全基因敲除） 特定时间和空间的基因敲除

28 完全基因敲除：正负双向选择原理(PNS)
30 完全基因敲除：正负双向选择原理(PNS) 正向选择基因neo插入或置换靶基因； 负向选择基因HSV-tk置于目的基因外侧， 含有该基因的重组细胞不能在选择培养基上 生长，负向选择基因如果被随机重组到基因 组中会导致细胞死亡

29 正向选择基因neo插入或置换靶基因 序列置换 序列插入 6 9 6 9 neo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 9
28 正向选择基因neo插入或置换靶基因 neo 6 9 6 9 neo 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 9 HPRT+ HPRT+ 6 7 8 序列置换 序列插入 1 2 3 4 5 6 7 neo 9 HPRT+G418r HPRT+G418r

30 目的基因的第一个外显子被neor基因替换
29 目的基因 基因敲除载体 启动子 1 2 3 4 HSV-tk 1 neor1 2 3 HSV-tk 同源重组 1 2 3 4 含有neor基因 的细胞能对抗抗生 素G418，不含有 HSK-tk基因的细 胞能对抗嘌呤类似 物丙氧鸟苷 HSV-tk 启动子 1 neor HSV-tk 抗生素G418，丙氧鸟苷 1 neor 目的基因的第一个外显子被neor基因替换

31 Neo加入到靶基因的内含子中，并在靶基因两侧内含子中插入LoxP位点
31 条件型基因敲除 Neo加入到靶基因的内含子中，并在靶基因两侧内含子中插入LoxP位点

32 32 目录 基因表达研究技术 基因敲除技术 基本原理 高等动物基因敲除技术 植物基因敲除技术

33 真核生物基因敲除的技术路线 源DNA与 胚胎干细胞基因组中相应部分发 生同源重组 并加以表达 构建重组基因载体
33 真核生物基因敲除的技术路线 构建重组基因载体 将重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外 源DNA与 胚胎干细胞基因组中相应部分发 生同源重组 重组载体中的DNA整合到内源基因组中， 并加以表达

34 高等动物基因敲除技术 目的 1 2 基因 棕色小鼠 3 5a 代替野生型基因 5b 随机插入 5c 没有插入 6a 含插入基因的细胞
34 高等动物基因敲除技术 目的 基因 tk 4a 1 neo 2 棕色小鼠 4a 同源重组 4b 非同源重组 4c 未重组 3 4b 4c 5a 代替野生型基因 5b 随机插入 5c 没有插入 6a 含插入基因的细胞 6b 含随机插入的细胞 6c 不含插入的细胞 7 收集细胞 8 用抗生素G418和 丙氧鸟苷处理 5b 6b 7 8 5a 6a 5c 6c

35 在正常胚胎中植入 含插入基因的细胞 将胚胎植入待孕黑色母体 35 新生的雄性嵌合鼠（棕色-黑色） 野生的雌性黑鼠
杂合子 将胚胎植入待孕黑色母体 新生的雄性嵌合鼠（棕色-黑色） 成熟的雄性嵌合鼠（棕色-黑色） 杂合子 纯合子，用于研究

36 基因捕获法 至少需要两代以上的遗传 因，通常是neo基因 要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型， 基因捕获法也可以破坏靶基因表达
36 基因捕获法 要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型， 至少需要两代以上的遗传 基因捕获法也可以破坏靶基因表达 基因捕获载体包括一个无启动子的报告基 因，通常是neo基因

37 基因捕获法 SA βgeo, 无启动子 内含子1 外显子1 外显子2 随机插入内含子或外显子中 转录 剪切 翻译 5’ 5’ 基因捕获载体
37 基因捕获法 SA βgeo, 无启动子 基因捕获载体 随机整合 内含子1 SA βgeo 外显子1 外显子2 随机插入内含子或外显子中 转录 剪切 翻译 5’ 5’

38 38 目录 基因表达研究技术 基因敲除技术 基本原理 高等动物基因敲除技术 植物基因敲除技术

39 植物基因敲除技术 基因敲除采用不同于动物基因敲除的方法 的基因敲除方法 由于动植物细胞结构显著不同，植物细胞
39 植物基因敲除技术 由于动植物细胞结构显著不同，植物细胞 基因敲除采用不同于动物基因敲除的方法 T-DNA插入失活技术是植物中使用最广泛 的基因敲除方法

40 T-DNA插入失活 到基因组DNA上 就会影响基因的表达，从而使该基因失活。 利用根瘤农杆菌T-DNA介导转化
40 T-DNA插入失活 利用根瘤农杆菌T-DNA介导转化 将一段带有报告基因的DNA序列标签整合 到基因组DNA上 如果这段DNA插入到目的基因内部或附近， 就会影响基因的表达，从而使该基因失活。

41 41 LB LP RP 野生型 杂合型 纯合型 将靶基因两端的引物LP, RP及插入 载体上的引物LB加入同一反应体系 中进行PCR

42 42 小结 基因的分析技术 SAGE,RNA选择性剪接，原位杂交，基因定点 突变 基因敲除 正负双向筛选原理 条件型基因消除

43 第六章 分子生物学研究法（下） ——基因功能研究技术 第三节 蛋白质及RNA相互作用技术 第四节 基因芯片及数据分析

44 目录 蛋白质及RNA相互作用技术 酵母单杂交系统 酵母双杂交系统 蛋白质分析技术 染色质免疫共沉淀技术 RNA干涉技术 基因芯片及数据分析

45 酵母单杂交系统 研究酵母细胞内DNA-蛋白质之间的相互作 用 用蛋白的编码基因 质）与顺式作用元件（一种DNA）相互作用
20世纪90年代中期发展起来的新技术 可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，用于 研究酵母细胞内DNA-蛋白质之间的相互作 用 通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作 用蛋白的编码基因 分析鉴定细胞中转录调控因子（一种蛋白 质）与顺式作用元件（一种DNA）相互作用

46 酵母单杂交系统的基本原理 识别和结合效率 转录激活结构域AD 转录因子 顺式元件 顺式元件 顺式元件 最基本启动子 报告基因 结构
顺式元件在启动子上游，报告基因在启动子下游 过程 转录因子与顺式元件结合，激活最基本启动子，使报告 基因表达 接入三个以上的顺式作用元件，可增强转录因子的 识别和结合效率

47 酵母单杂交系统的应用 互作用 位点的功能蛋白的编码基因 列 确定某个DNA分子与某个蛋白质之间的相 分离编码结合在顺式作用元件或其他DNA
准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序 列

48 从拟南芥cDNA文库中筛选出能与DRE结合的转录调控因子
酵母单杂交系统的应用 从拟南芥cDNA文库中筛选出能与DRE结合的转录调控因子 拟南芥cDNA插入片段 PADH1 GAL4 AD TADH1 LEU2 转化 DRE DRE DRE DRE 最基本启动子 LacZ URA3 筛选 挑选阳性克隆 测序，进一步验证活性 阳性克隆

49 目录 蛋白质及RNA相互作用技术 酵母单杂交系统 酵母双杂交系统 蛋白质分析技术 染色质免疫共沉淀技术 RNA干涉技术 基因芯片及数据分析

50 酵母双杂交系统 特征 利用真核生物转录调控因子的组件式结构 DNA结合结构域 bindingdomain,BD
转录激活结构域 activatingdomain,AD BD能与启动子结合，不能激活转录 BD和AD形成的杂合蛋白，能激活转录

51 酵母双杂交系统 只有转录激活域AD不 能激活报告基因表达 只有转录结合域BD不 AD和BD同时存在时， 才能激活报告基因表达

52 酵母双杂交系统 BD AD Bait DNA结合域 DNA转录激活域 诱饵 Prey 猎物

53 目录 蛋白质及RNA相互作用技术 酵母单杂交系统 酵母双杂交系统 蛋白质分析技术 染色质免疫共沉淀技术 RNA干涉技术 基因芯片及数据分析

54 蛋白质分析技术 等离子表面共振技术 免疫共沉淀技术 GST融合蛋白沉降技术 荧光共振能量转移法

55 等离子表面共振技术 聚糖表面，将葡聚糖固 定在纳米级金属膜表面 过时，如果有蛋白质同 诱饵蛋白发生作用，两 者结合使金属膜表面的
将诱饵蛋白结合于葡 聚糖表面，将葡聚糖固 定在纳米级金属膜表面 当有蛋白质混合物经 过时，如果有蛋白质同 诱饵蛋白发生作用，两 信号输出 诱饵蛋白 葡聚糖层 纳米级金属膜 光感受器 光源 棱镜 者结合使金属膜表面的 折射率上升，从而导致 共振角度的改变 共振角度的变化与捕 被捕获的 待分析物 自由的 待分析物 液流通路流向 获的蛋白浓度呈线性关 系

56 免疫共沉淀技术 将蛋白抗体基质复合体加入 含有不同组分的蛋白质溶液中 固体基质 特异性抗体 2 1 亲和试剂 结合后被共沉淀到 试管的底部
与抗体特异 结合的蛋白质 结合后被共沉淀到 试管的底部

57 GST融合蛋白沉降技术（1） 和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作 用蛋白 GST谷胱甘肽转移酶； GSH谷胱甘肽
应用 确定探针蛋白和未知蛋白的相互作用 确定探针蛋白和某个已知蛋白之间的相互作用

58 GST融合蛋白沉降技术（2） SDS-PAGE 分析 谷胱甘肽琼 脂糖球珠 35S标记细 胞裂解物 发生相互作用的蛋白 GST融合物 GST

59 荧光共振能量转移法（FRET） 荧光供体 探针 荧光受体 荧光 Taqman 探针 荧光供体 荧光受体 探针 分子信标 荧光

60 荧光共振能量转移法（FRET） 耦合作用以非辐射方式转移能量的过程 21世纪初发现，又称长距离能量转移
是荧光能量供体与受体之间通过偶极-偶极 耦合作用以非辐射方式转移能量的过程 条件 供体与受体距离合适（1-10nm） 供体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重 叠 供体与受体的偶极具有一定的空间取向

61 FRET

62 目录 蛋白质及RNA相互作用技术 酵母单杂交系统 酵母双杂交系统 蛋白质分析技术 染色质免疫共沉淀技术 RNA干涉技术 基因芯片及数据分析

63 染色质免疫共沉淀技术 质相互作用的技术 chromatinimmuno precipitation,ChIP
新发展的研究活体细胞内染色质DNA与蛋白 质相互作用的技术 主要实验流程 活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物 用超声波或酶处理将其随机切断为一定长度的染色 质小片段 利用抗原抗体反应，沉淀复合体，富集与目的蛋白 结合的DNA片段

64 将DNA转移到干净 加入蛋白酶，解除 捕获抗体结合的 离心管中，备用 DNA-蛋白质交联 DNA-蛋白质复合物 利用甲醛使DNA
和蛋白质交联 将DNA转移到干净 离心管中，备用 破碎细胞， 切DNA 加入蛋白酶，解除 DNA-蛋白质交联 加入感兴趣的抗体 捕获抗体结合的 DNA-蛋白质复合物

65 目录 蛋白质及RNA相互作用技术 酵母单杂交系统 酵母双杂交系统 蛋白质分析技术 染色质免疫共沉淀技术 RNA干涉技术 基因芯片及数据分析

66 RNA干涉技术 表了该技术 同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出 现靶基因缺失的表型 同源的基因序列的特异性“沉默”
RNAinterference,RNAi 1998年安德鲁·法尔在1998年Nature上发 表了该技术 利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内 同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出 现靶基因缺失的表型 对线虫注射外源双链RNA可诱发与之高度 同源的基因序列的特异性“沉默”

67 RNAi 的单链RNA的降解 多步骤过程 对触发物的加工 与目标mRNA的结合 目标mRNA的降解
双链RNA是RNAi的触发物，引发与之互补 的单链RNA的降解

68 RNAi过程 对触发物的加工 与目标mRNA的结合 目标mRNA的降解 Dicer（一种核酸酶）将细胞中长的外源双链RNA
降解成21-25bp的小分子干扰RNA（siRNA） 与目标mRNA的结合 siRNA与目标mRNA结合 目标mRNA的降解 siRNA的反义链指导合成”RNA诱导的沉默复合体 （RISC）的核蛋白体” RISC介导切割mRNA中与siRNA反义链互补的区 域，从而干扰靶基因表达

69 RNAi技术 外源双链RNA Dicer siRNA 细胞内mRNA RISC切割 干扰靶基因表达

70 RNAi 技术的应用 非哺乳动物 哺乳动物 可利用较长的dsRNA直接诱导RNAi, 无需专门 合成siRNA
21-25bp的siRNA才有效

71 目录 蛋白质及RNA相互作用技术 基因芯片及数据分析 基因芯片技术原理 基因芯片的点制过程 基因芯片数据分析

72 基因芯片 DNAchip 迹法研究时，受电泳泳道数量的限制，每次 只能研究很少量的基因 速准确地在基因组水平上阐述各种转录物的 变化规律
传统的实验方法如RT-PCR、Northern印 迹法研究时，受电泳泳道数量的限制，每次 只能研究很少量的基因 基因芯片能同时检测大量靶基因表达，迅 速准确地在基因组水平上阐述各种转录物的 变化规律

73 基因芯片技术的研究过程 段点在玻璃片（2cm*2cm）、金属片或尼 龙膜上，经过物理吸附或化学合成达到固定 化 经过计算机扫描
用机械臂把大量已知或未知序列的DNA片 段点在玻璃片（2cm*2cm）、金属片或尼 龙膜上，经过物理吸附或化学合成达到固定 化 将芯片与待研究的cDNA或其它样品杂交， 经过计算机扫描 五个步骤：生物学问题、样品制备、生物 化学反应、检测、数据模型分析

74 基因芯片技术流程图 与荧光标记的cDNA 发生杂交，所发出的 荧光信号与基因表达 的丰度成正比 通过比较芯片上的 每个位置的荧光强度
处理组 杂交 对照组 芯片上某些点能够 与荧光标记的cDNA 发生杂交，所发出的 荧光信号与基因表达 的丰度成正比 mRNA提取 荧光染料 标记cDNA 通过比较芯片上的 激光激发 每个位置的荧光强度 来确定基因丰度或表 达强度 芯片结果

75 目录 蛋白质及RNA相互作用技术 基因芯片及数据分析 基因芯片技术原理 基因芯片的点制过程 基因芯片数据分析

76 基因芯片的点制过程：简易基因芯片 不超过2000个基因 步骤与原理中描述相同 研究小部分特定基因的表达状态 手工制样或机械臂点样

77 基因芯片的点制过程：大规模基因芯片 大于10000个基因 点样方式：接触式、非接触式、半导体技术 过程 大规模PCR得到独立cDNA片段
用机械臂点样 从不同组织、器官或细胞分离mRNA，反转录成cDNA 用不同荧光染料标记不同cDNA样本 杂交 激光扫描芯片杂交结果，分析

78 目录 蛋白质及RNA相互作用技术 基因芯片及数据分析 基因芯片技术原理 基因芯片的点制过程 基因芯片数据分析

79 基因芯片数据分析 数据可靠性分析 生物学意义分析 重复试验以确保数据的准确 加上持家基因做内对照 差异表达基因的生物学意义
统计每条生物化学途径中固有的基因数量和被基因 芯片定位的差异表达的基因数量，计算出特定器官 或发育阶段表达有显著差异的代谢途径

80 小结 蛋白质相互作用 RNAi 技术 基因芯片 酵母单杂交、酵母双杂交、等离子表面共振、 GST融合蛋白、免疫共沉淀技术、FRET 基因沉默
制备过程、用途