Chapter 30 DNA Replication and repair

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1 Chapter 30 DNA Replication and repair

2 An Overview Replication fidelity: Important for preserve the genetic information from one generation to the next. Replicons, semi-conservative, semi-discontinous, RNA priming

3 Replicons How many replicons?
DNA replication Replicons Replicon is any piece of DNA which replicates as a single unit. It contains an origin and sometimes a terminus. Origin is the DNA sequence where a replicon initiates its replication. Terminus is the DNA sequence where a replicon usually stops its replication. How many replicons?

4 Prokaryotic genome: a single circular DNA = a single replicon
DNA replication Prokaryotic genome: a single circular DNA = a single replicon Eukaryotic genome: multiple linear chromosomes & multiple replicons on each chromosome

5 Bidirectional replication of a circular bacterial replicon
DNA replication Bidirectional replication of a circular bacterial replicon All prokaryotic chromosomes and many bacteriophage and viral DNA molecules are circlular and comprise single replicons. There is a single termination site roughly 180o opposite the unique origin.

6 Origin and direction of DNA replication
J.Cairns，1963 θ型

7 Unidirectional i Bidirectional

8 18% Plasmid ColE1 Unidirectional

9 Besides, other replication mechanism D-loop, δ-etc.
DNA replication In all the cases, the origin is a complex region where the initiation of DNA replication and the control of the growth cycle of the organism are regulated and co-ordinated. Besides, other replication mechanism D-loop, δ-etc.

10 Multiple eukaryotic replicons and replication bubbles
DNA replication Multiple eukaryotic replicons and replication bubbles The long, linear DNA molecules of eukaryotic chromosomes consist of multiple regions, each with its own origin. A typical mammalian cell has replicons with a size range of kb. Where replication forks from adjacent replication bubbles meet, they fuse to form the completely replicated DNA. No distinct termini are required

11 Multiple eukaryotic replicons and replication bubbles
DNA replication Multiple eukaryotic replicons and replication bubbles replication bubbles  replication fork

12 Multi-origin in eukaryote
原核生物（线粒体）：单复制子双向等速，部分单向 真核生物：多复制子双向等速

13 Double helix

14 After replication, only one strand in the newly synthesized DNA is from parent, and another is new.
半保留复制 semi-conservative

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16 Attention: Semi-conservative replication is universal. Only DNA or RNA can be paired, no matter base, nucleotide, or nucleotide acid. Semi-conservative replication can sustain the stability of DNA, but far from inert (惰性), admitting mutation, deletion and rearrangement.

17 Semi-discontinuous Replication fork：模板链在解开时形成的叉状结构 Leading strand：子链的合成从模板的3，端开始 Lagging strand：子链的合成从模板的5，端开始 However, DNA　is　synthesized only from 5’ end

18 Okazaki fragment in prokaryote is 1000～2000 bps, and 100 bps in eukaryote.

19 The replication is catalyzed by DNA polymerase.
While DNA polymerase works only from 5，to 3，end. How to explain that two strands are synthesized at the same time? 2-3kb Okazaki fragments in lagging strand，then ligase works

20 Discovery of Okazaki fragments
DNA replication Discovery of Okazaki fragments Evidence for semi-discontinuous replication [3H] thymidine pulse-chase labeling experiment Grow E. coli Add [3H] thymidine in the medium for a few second spin down and break the cell to stop labeling  analyze  found a large fraction of nascent DNA ( nt) = Okazaki fragments Grow the cell in regular medium then  analyze  the small fragments join into high molecular weight DNA = Ligation of the Okazaki fragments

21 1.用3H标记的T培养大肠杆菌，提取DNA，3H标记的DNA片段
先导链是连续的，后随链不连续。所以

22 Conditions before DNA replication
1.substrates deoxynucleotide triphosphate: dATP, dGTP，dCTP，dTTP (dNMP)n+dNTP (dNMP)n+1+PPi

23 2. DNA polymerase 特点： （1）不能催化从无到有的聚合反应。 （2）催化的反应只能在引物的3′延伸。
Mg2+ （dNMP）n + dNTP （dNMP）n+1 + PPi 特点： （1）不能催化从无到有的聚合反应。 （2）催化的反应只能在引物的3′延伸。 （3）3′接上的核苷酸决定于模板链。 （4）具有5′→3′和3′→5′外切酶活性。

24 PolⅡ和PolⅢ PCR反应全过程 三种聚合酶特性的比较 1985年A.K.Saiki等首先报道了PCR（多聚酶链式反应） 1 热变性
5′ 1 热变性 2 退火 PCR反应全过程 5′ 3 DNA聚合酶 5′ 重复1，2，3

25 在原核生物中，目前发现的DNA聚合酶有三种，分别命名为DNA聚合酶Ⅰ（pol Ⅰ），DNA聚合酶Ⅱ（pol Ⅱ），DNA聚合酶Ⅲ（pol Ⅲ），这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。参与DNA复制的主要是pol Ⅲ和pol Ⅰ。

26 pol Ⅰ为单一肽链的大分子蛋白质,可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段称为Klenow fragment，具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶的活性

27 pol Ⅲ由十种亚基组成，其中α亚基具有5'→3'聚合DNA的酶活性，因而具有复制DNA的功能；而ε亚基具有3'→5'外切酶的活性，因而与DNA复制的校正功能有关。

28 原核生物中的三种DNA聚合酶 

29 在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种，分别命名为DNA聚合酶α（pol α），DNA聚合酶β（pol β），DNA聚合酶γ（pol γ），DNA聚合酶δ（pol δ），DNA聚合酶ε（pol ε）。 其中，参与染色体DNA复制的是pol α（延长随从链）和pol δ（延长领头链），参与线粒体DNA复制的是pol γ，polε与DNA损伤修复、校读和填补缺口有关，pol β只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。

30 三、模板(template) DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。

31 四、需要引物 参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3’端自由羟基（3’-OH）的RNA作为引物(primer) ，才能开始聚合子代DNA链。 RNA引物的大小，在原核生物中通常为50～100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。

32 引发体和RNA引物 引发体(primosome)由引发前体与引物酶（primase）组装而成。
引发前体是由若干蛋白因子聚合而成的复合体。在原核生物中，引发前体至少由六种蛋白因子构成。蛋白i、蛋白n、蛋白n”、蛋白dnaC与引物预合成有关，蛋白n’与蛋白dnaB与识别复制起始点有关，并具有ATPase活性。 引物酶本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供自由的3'-OH，使子代DNA链能够开始聚合。

33 五、DNA连接酶 DNA连接酶(DNA ligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，而使两段DNA连接起来。

34 DNA连接酶催化的条件是：① 需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基；② 未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；③ 需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。

35 六、单链DNA结合蛋白 单链DNA结合蛋白（single strand binding protein, SSB），能够与单链DNA结合的蛋白质因子，本身不起解链作用。等复制完成，脱离单链循环。 作用： ① 使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在② 保护单链DNA，避免核酸酶的降解。

36 解螺旋酶（unwinding enzyme） ，又称解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白，每解开一对碱基，需消耗两分子ATP。
七、解螺旋酶 DNA helicase 解螺旋酶（unwinding enzyme） ，又称解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白，每解开一对碱基，需消耗两分子ATP。 条件：单链DNA的存在或末端缺口

37 八、拓扑异构酶(topoisomerase)
拓扑异构酶Ⅰ可使DNA双链中的一条链切断，松开双螺旋后再将DNA链连接起来，从而避免出现链的缠绕。拓扑异构酶Ⅱ可切断DNA双链，使DNA的超螺旋松解后，再将其连接起来。 大肠杆菌拓朴异构酶Ⅰ的结构

38 DNA生物合成过程 一、复制的起始 DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。 （一）预引发： 1．解旋解链，形成复制叉：
由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白（SSB）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。 DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。

39 2．引发体组装： 由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成引发体。

40 二）引发： 在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3'端自由羟基（3'-OH）。

41 二、复制的延长 一）聚合子代DNA： 由DNA聚合酶催化，以3'→5'方向的亲代DNA链为模板，从5'→3'方向聚合子代DNA链。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中，是DNA聚合酶α(延长随从链)和δ（延长领头链）。

42 （二）引发体移动： 引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。

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44 三、复制的终止 （一）去除引物，填补缺口：
在原核生物中，由DNA聚合酶Ⅰ来水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。

45 （二）连接冈崎片段： 在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。

46 （三）真核生物端粒的形成： 端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富含G、C的短重复序列构成，可重复数十次至数百次。

47 线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。
端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。

48 端粒酶(telomerase)的作用机制

49 复制的引发和终止 DNA聚合酶只能延长已存在的DNA链，无法启始（从头合成）DNA新链 先形成一段RNA链（引物），在其后面延长DNA链，合成完后，再将前面的RNA引物切掉。 RNA引物由RNA聚合酶以DNA为模板形成

50 前导链的合成只要RNA聚合酶合成一段RNA引物，DNA聚合酶就可以一直合成下去
引发体在后随链上前进，引发酶为每一个冈崎片段合成引物，DNA聚合酶在引物后面合成DNA，直到遇到下面一个冈崎片段

51 复制的完成与终止 DNA合成后短的RNA引物链被RNaseH降解 另外一种DNA聚合酶（I）将缺口补齐 DNA连接酶将两段DNA分子连成大分子DNA

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53 端粒与端粒酶 端粒：染色体末端的一种特殊结构，保护并定位染色体 RNA引物切除后，DNA聚合酶I补齐
但是DNA聚合酶I聚合DNA时，要求具备游离的3，OH，新链DNA的5，端无法补齐 所以DNA每复制一次就短一点，端粒就短一些，染色体就相应短一点 最终当达到一定限度时，指令细胞衰老、凋亡

54 多利羊的寿命只有6岁，正常12岁 端粒短20%，端粒长短与寿命有关，老人端粒短 但癌细胞DNA复制时，端粒并不缩短，Why？ 端粒酶，癌细胞的端粒酶有活性，可以将染色体末端缩短的端粒补上；但成熟的正常体细胞中无活性 端粒酶中含有RNA，既作模板，又作引物 抑制端粒酶的活性——治疗癌

55 DNA复制的保真性： 为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关：
1．遵守严格的碱基配对规律； 2．DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择； 3．对复制过程中出现的错误及时进行校正。

56 第二节：突变与修复 遗传物质的改变导致生物性状的变化 种类：1.染色体畸变（数量与结构） 2.基因突变（DNA或RNA结构）

57 染色体突变 数目 结构 单体：2n-1 缺体：2n-2 三体：2n+1 多体：2n+ 非整倍体突变减数分裂异常 整倍体突变
缺失：少了一段 重复：多了一段 倒位：位置颠倒 易位：断裂后加到其他染色体上

58 基因突变 在某一突变座位发生，又称点突变。 意义：进化动力；生物多样性依据； 遗传学的核心；育种素材 基因突变的特征： 随机性
多方向性和复等位基因 稀有性低频率 可逆性与回复突变 正向突变：野生型—突变型

59 5’ ATGGCTATGC 3’ 变成 5’ ATGGTATGC 3’ 3’ TACCGATACG 5’ 3’ TACCATACG 5’
基因突变种类 碱基置换突变：转换与颠换，个别氨基酸差异 移码突变：插入或缺失，读码框的变化，蛋白质改变 转换 颠换 5’ ATGGCTATGC 3’ 变成 5’ ATGGTATGC 3’ 3’ TACCGATACG 5’ ’ TACCATACG 5’ 移码 突变

60 碱基的转换

61 DNA突变的类型：

62 基因突变发生时期 DNA碱基顺序的改变，是DNA在复制过程中出现错误产生的。由于DNA是具有复制功能的分子，一旦DNA碱基顺序出错，它就会通过复制机制遗传下去。 发生在体细胞中 只影响当代，如癌症，嵌合体 发生在生殖细胞中 遗传给下一代

63 突变的诱发 物理因素：紫外线（TT二聚）、高能射线和电离辐射等，及极端温度
化学因素：最常见因素，主要包括：烷基化试剂，亚硝酸盐以及碱基类似物等 常见：煤烟，尾气，腐烂食品，抗生素 生物因素：病毒引起的突变 自发因素：10-10

64 （一）引起突变的因素： 1．自发因素： (1)自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。 (2)自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。 (3)复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。

65 2．物理因素： 由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。

66 3．化学因素： (1)脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成I。

67 (2)烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。
(3)DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。 (4)碱基类似物：如5-FU，6-MP等，可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。 (5)断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。

68 （三）DNA突变的效应： 1．同义突变：基因突变导致mRNA暗码子第三位碱基的改变但不引起暗码子意义的改变，其翻译产物中的氨基酸残基顺序不变，但有时可引起翻译效率降低。 2．误义突变：基因突变导致mRNA暗码子碱基被置换，其意义发生改变，翻译产物中的氨基酸残基顺序发生改变。 3．无义突变：基因突变导致mRNA暗码子碱基被置换而改变成终止暗码子，引起多肽链合成的终止。 4．移码突变：基因突变导致mRNA暗码子碱基被置换，引起突变点之后的氨基酸残基顺序全部发生改变。

69 诱变机制 1.物理因素引起的诱变 胸腺嘧啶碱基在紫外光照射下，可以发生二聚加成反应：
在DNA分子中，如果两个胸腺嘧啶碱基相邻，在紫外光照射下，可能发生上述聚合反应，其结果是破坏了正常复制或转录。

70 2.碱基类似物引起的诱变 碱基类似物是一类结构与核酸碱基相似的人工合成或天然化合物，由于它们的结构与核酸的碱基相似，当这些物质进入细胞后能够掺入到DNA链中，干扰DNA的正常复制和转录。 例如5-溴尿嘧啶（5-BU），AP等，它与胸腺嘧啶碱基的结构相似，能取代T与A配对同时又可与G配对。 又如二恶英，是一种具有强烈致癌和致畸物质。它能够进入细胞并与DNA结合，导致DNA复制发生错误，从而可能诱发癌变。

71 3.亚硝酸或烷化剂引起的诱变 4.吖啶类分子引起的突变 可以改变核酸的化学组成，与复制无关
鸟嘌呤核苷烷基化形成6-甲氧基鸟嘌呤核苷后，不再与C配对，而与T配对。 A、G、C能发生亚硝酸氧化脱胺，分别形成次黄嘌呤核苷（I）和黄嘌呤核苷（X）及U A变I，I配C C变U，U配A 4.吖啶类分子引起的突变 扁平分子，插入DNA中，引起移码突变

72 诱变剂与致癌 90%的诱变剂有致癌作用 90%的致癌物有诱变作用 用Ames实验可方便地检测诱变物质
鼠伤寒沙门氏杆菌的营养缺陷型菌株诱变后可生长 在食品工业上广泛应用

73 DNA的修复机制 若DNA的碱基由于射线、化学因素突变 生物体有修复机制以保证DNA分子的稳定性 1.光修复：直接修复
可见光提供能量，光修复酶 将二聚体切成单体 2.切除修复： 3.重组修复：

74 当DNA受到大剂量紫外线（波长260nm附近）照射时，可引起DNA链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合，形成二聚体，例如TT二聚体。
其结果是破坏了正常复制或转录。

75 （一）直接修复： 1．光复活： 这是一种广泛存在的修复作用。光复活能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。其修复过程为：光复活酶（photo-lyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物→在300～600nm可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开，使之完全修复→光复活酶从DNA上解离。

76 2．转甲基作用： 在转甲基酶的催化下，将DNA上的被修饰的甲基去除。此时，转甲基酶自身被甲基化而失活。如：O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶 3．直接连接： DNA断裂形成的缺口，可以在DNA连接酶的催化下，直接进行连接而封闭缺口。

77 （二）.切除修复：将损伤的部位（二聚或化学损伤）用酶切断，以另一条链为模板，在DNA聚合酶作用下合成新的DNA片段，然后用连接酶连接

78 切除修复(excision repairing)：
这也是一种广泛存在的修复机制，可适用于多种DNA损伤的修复。该修复机制可以分别由两种不同的酶来发动，一种是核酸内切酶，另一种是DNA糖苷酶。

79 DNA糖苷酶与AP核酸内切酶

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81 （三）.重组修复：修复与复制和重组偶连 需外切酶、内切酶、聚合酶、连接酶 复制：缺口 重组：补齐缺口 再合成：母链中的缺口由子链为模板再合成
拆东家，补西家 拆过的东家模板补 结果：母链并没修复，但子链完整，稀释

82 重组修复(recombination repairing)：
这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。 Rec A与rec BCD蛋白质

83 （四）．SOS修复： 这是一种在DNA分子受到较大范围损伤并且使复制受到抑制时出现的修复机制，以SOS借喻细胞处于危急状态。 DNA分子受到长片段高密度损伤，使DNA复制过程在损伤部位受到抑制。 损伤诱导一种特异性较低的新的DNA聚合酶，以及重组酶等的产生。 由这些特异性较低的酶继续催化损伤部位DNA的复制，复制完成后，保留许多错误的碱基，从而造成突变。

84 DNA损伤的修复 DNA损伤的修复方式可分为直接修复和取代修复两大类。

85 （五）、错配修复 Dam甲基化酶 GATC中的A发生甲基化，识别母链 将未甲基化的子链中错配的碱基切掉