第 六 章 肿瘤实验研究的某些方法 第一节 抗肿瘤药物的筛选 一、体内抗肿瘤药物的筛选： 1.动物选择； 2.肿瘤模型：

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1 第 六 章 肿瘤实验研究的某些方法 第一节 抗肿瘤药物的筛选 一、体内抗肿瘤药物的筛选： 1.动物选择； 2.肿瘤模型：
第 六 章 肿瘤实验研究的某些方法 第一节 抗肿瘤药物的筛选 一、体内抗肿瘤药物的筛选： 1.动物选择； 2.肿瘤模型： 小鼠肿瘤：肉瘤180(S—180），肉瘤37(S一37)，艾氏癌腹水型(EAC)，实体型(EC)，肝癌实体型(Heps），Harding—Passey黑色素瘤，末分化型胶质瘤G422等可用昆明种小鼠。小鼠网织细胞白血病(L615)应用纯种615小鼠。小鼠淋巴细胞白血病L1210和P388应用纯种DBA/2或CDF小鼠或BDF小鼠。Lewis肺癌，黑色素瘤B16，小鼠乳腺癌(M5076)应用 C57BL/6纯种小鼠或BDF或CDF小鼠。 大鼠肿瘤：瓦克癌肉瘤(W256)，软骨肉瘤，吉田肉瘤腹水型，用 Wistar，Sprague—Dawley或 Fisher大白鼠。 人肿瘤细胞株：国际上常用的细胞株如人口腔癌细胞株 KB细胞，宫颈癌细胞株HeLa细胞，卵巢癌细胞株A2780及国内建立的食管癌，肺癌及肝癌细胞株等皆可使用。

2 ×100% C—T C 3.实验方法及疗效评价： (1)实体瘤： 1）接种： 2）分组：。
3）给药途径：应与推荐临床用药的途径相同，静脉给药者可用腹腔注射代替。 4）疗效评价：停药24小时后处死动物，称体重，解剖剥离瘤块，称瘤重。如对照组小鼠肿瘤平均重量小于l克，或20％小鼠肿瘤重量小于400mg，大鼠平均瘤重小于2克，则表示肿瘤生长不良，实验作废。 疗效评价公式： 式中T为给药组平均瘤重；C为对照组平均瘤重。 当抑制率＞30%，经统计学处理有显著性差异(P值〈0.05)且经 2次重复实验(共三次)证明后，则评定该药对肿瘤有一定疗效，为评价其有效程度，可根据需要再做其他体内或体外抗肿瘤实验。 肿瘤抑制率= C—T ×100% C

3 ×100% T—C C (2)腹水瘤及白血病： 1）接种： 2）分组及给药方法与实体瘤相同，但此时腹腔给药不能代替静脉注射。
3）疗效评价：接种后，观察和记录动物死亡时间，计算生存天数，如对照组内 20％动物存活超过4周，说明腹水瘤生长不良，实验作废。在接种后30或60天，用以下公式计算生命延长率： 式中C为对照组平均生存天数；T为给药组平均生存天数。 如治疗组动物生存超过60天，记录长期存活率或动物数。 非腹腔内给药时生命延长率＞30％，腹腔内给药时生命延长率＞50％，经统计学处理有显著性差异，三批重复实验证明有效者，评定该药有一定疗效。 生命延长率= T—C ×100% C

4 （3)L615白血病：L615白血病为国内建株的白血病，其生长特点与其他白血病不同，故实验方法亦异。
1）接种： 2）分组及给药方法同实体瘤，疗效评价同腹水瘤及白血病。观察时间为30天。 3）疗效评定：治疗组动物生命延长率＞25％，统计学处理有显著差异(P〈0.05)，经三批实验证实，则认为该药对肿瘤有一定疗效。

5 二、体外抗肿瘤试验： 体外抗肿瘤试验按常规细胞培养法进行，实验应设阳性及阴性对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药，阴性对照为溶剂对照，抗肿瘤效果的评价以体外半数抑制浓度(IC50）的表示，合成药时1C50＜10ug/ml，植物提取物时IC50＜30ug/ml，认为有一定抑制作用。 三、体内抗癌试验：

6 四、对免疫功能影响的试验： BRM通过提高免疫功能抗癌，其作用的环节可能是多方面的。只要对下述免疫学指标有稳定的阳性结果，即表示该药有免疫调节(或激活)作用。 1.巨噬细胞试验： 2.天然杀伤细胞(Natural Killer cell， NK)测定 3.淋巴细胞转化试验(T细胞试验)： 4.细胞激活因子的测定： 5.其他细胞免疫测定方法：

7 第二节  抗肿瘤药物敏感试验的研究 近年来，以抗癌药物治疗个体化为目的的抗癌药物敏感试验受到重视。各种肿瘤活细胞定量方法逐步形成抗癌药物评价系统，用于药敏试验，亦用于药物筛选。药敏试验总的趋势是从动物体内转向体外，从昂贵、费时转向简易、快速，研究方法趋于多样化。这些研究揭示了肿瘤细胞增殖分化的一些特征及其与药物的关系。

8 一、裸鼠人癌模型药敏试验： 二、免疫功能正常小鼠肾包膜下肿瘤移植药敏试验(Subrenal capsule assay， SRCA）：
近来将人癌组织移植入裸鼠肾囊膜内，观察肿瘤生长大小，在双目显微镜下测量肿瘤直径，比较给药组和对照组的差异，在ll天左右可以得到药物疗效的结果。 三、肿瘤干细胞培养及药敏试验： 四、四唑兰显色反应药敏试验：

9 五、其它药敏试验方法： 1.3H胸腺嘧啶渗入试验(3H-TdR incorporation assay)：
2.染料排斥法药敏试验(Noval dye exc1usion assay，NDEA)： 3.酯酶活性萤光法药敏试验： 4.三磷酸腺苷法(ATP assay)： 5.肿瘤细胞半透膜包裹法药敏试验(Microencapsulated tumor assay，META) 6.原代肿瘤组织培养同位素渗入药敏试验： 7.鸡胚绒毛膜囊药敏试验：

10 8.雌激素受体状态与药物敏感性： 在药敏试验的评价上，大致有两种：根据各自方法学特点先确定实验可评价标准，对实验结果进行数学处理后，得出抗癌药敏感与不敏感的结论；获得抗癌药的剂量效应曲线，求得ID50，根据临床可达到的药物浓度，提出临床可能相对敏感的药物。

11 第 三 节 可疑致病因素的致畸致突变致癌作用的研究
一. 致畸作用(Teratogenic effect) ： 致畸试验(Teratogenic test)：是一种检验受试物是否具有引起胚胎畸变现象的试验方法，是在胚胎细胞分化和胎儿组织形成期给受孕动物饲喂受试物，然后在分娩期观察仔胎是否出现畸形来判定受试物的毒性。 试验动物常用小鼠、大鼠和兔。剂量分组至少应用三种剂量。一般以最大无作用剂量用于高剂量组，以其 l/30左右的剂量用于低剂量组。一般小鼠与大鼠于妊娠6一15天，兔于妊娠6一18天饲喂受试物；至妊娠结束前1一2天，以手术方法从母体内取出胎儿检查每个活胎有无外观畸形，并进行特殊的固定或染色以检查胎儿内脏、脑部及骨骼畸形等。

12 二. 致突变作用： 致突变作用又称诱变作用。 目前常用的致突变试验的方法： 1．检验染色体畸变的试验方法：
(1) 染色体畸变分析法或染色体分析法(Chromosomal aberration test）： (2)显性致死突变试验法(Dominant lethal assay）： 常用致突变指数来表示受试物致突变性的强弱。致突变指数越高，致突变作用就越强。试验组和对照组在分别计算致突变指数后进行比较。 致突变指数=早期死亡胚胎数（包括吸收胚胎数）/受孕母鼠数X100%。

13 2. 检验基因突变的试验方法： （1）宿主间介微生物试验法(Host-mediated microbial assay)：
宿主间介试验或宿主培养法是通过观察注入宿主动物体内的微生物的变化来检验受试物是否引起基因突变的一种方法。 不论受试物可使野生型微生物发生突变成为突变型，或者使突变型发生回复突变成为野生型，都有助于确定该种受试物是否具有致突变性。 突变频率=腹腔冲洗液中的突变菌数/腹腔冲洗液中的总菌数

14 （2)艾姆斯(Ames)试验法： Ames试验的基本原理是组氨酸缺陷型(即突变型)的鼠伤寒沙门氏菌在缺乏组氨酸的培养基上不能生长，但在加有致突变原的培养基上培养，则可使突变型产生回复突变成为野生型，即恢复合成组氨酸的能力，于是就能在缺乏组氨酸的培养基上生长，根据其生长菌落的数量判断受试物是否具有致突变性。如果受试物可能是经动物体内酶系统活化代谢后才具有致突变性，则试验时可在培养基上同时加入哺乳动物的肝微粒体酶，使受试物活化而呈现致突变作用。 Ames试验法的优点是：经济、可靠、快速，数周即出结果，但只能作为受试物致癌性的初筛，并不能代替动物慢性致癌试验。

15 三、致癌试验(Carcinogenic test)：
致癌试验是检验受试物及其代谢产物是否具有致癌作用或诱发肿瘤作用的慢性毒性试验方法，若某种受试物的摄入量极微，在慢性试验中出现中毒现象，而根据受试物的化学结构可能具有致癌作用，则需单独进行致癌试验。 （一）短期致癌试验： 1. 哺乳动物培养细胞恶性转化试验： 细胞：叙利亚地鼠(SHE)胚胎细胞，或其它哺乳动物细胞。 剂量：至少应用3种不同浓度，高剂量一般以抑制50％集落生长浓度为基准。

16 2. 动物短期致癌试验：小鼠肺肿瘤诱发短期试验：
动物：推荐使用A系小鼠，一般为6—8周龄，体重15-20克，雌雄各半，每组至少50只。 剂量及分组：一般设高、中、低三个剂量组。最高剂量组应是每周给药三次，连续8周的最大耐受剂量，否则应说明理由。另设阴性对照组。 给药途径：一般采用腹腔注射或其它适宜的途径。 观察时间：通常观察30—35周或可更短些。 结果评价：符合下列情况可判为阳性： （1）实验组肺肿瘤的均数比对照组显著增加； （2）有剂量效应关系； （3）阴性对照组肺肿瘤的平均数与文献报道的同龄未染毒小鼠肺肿瘤发生率大体相符。根据实验结果与需要，还可采用大鼠肝脏转变灶的诱发短期试验。

17 （二）动物长期致癌试验： 1.动物：通常用幼年小鼠或大鼠，选用适宜的品系雌、雄各半。每组动物数在实验结束时应能满足病理检查及统计分析的需要。一般每组为100只。 2.剂量及分组：至少设3个剂量组，另设溶媒或辅形剂对照和空白对照组。剂量设计可参考长期毒性试验结果。低剂量应是临床拟用剂量的l一3倍，其余剂量组可根据药理和毒理作用等因素综合考虑。 3.实验期限：通常大鼠为2年，小鼠1.5年。给药方式与期限：给药方式原则上与临床拟用途径相同，否则应说明理由。给药期限一般至实验结束时，必要时也可适当缩短。

18 4.观察与检查：对动物一般情况应注意观察与记录。肉眼观察到有肿瘤病变时，应取各器官系统做病理组织学检查。在病理剖检时应仔细检查每一个器官，发现肿瘤或疑似肿瘤的组织器官均应进行细胞病理学检查。小动物的脏器较小，应作系统的组织学检查。 在对照组与试验组(给药组)之间进行如下比较： (l)在对照组中出现的某种肿瘤在试验组中的发生率是否增高； (2)在试验组中是否出现某种在对照组中从未见到的肿瘤； （3)上述两种情况是否在试验组中同时发生。

19 5.结果分析与评价： 根据各组的肿瘤发生率、潜伏期和多发瘤做出全面的科学评价，并提出判断为阳性或阴性结果的充分数据与分析。