第9章 酶法分析 一、 液化酶活力的测定 1、原理 液化酶作用于淀粉糊时，能迅速切断淀粉分子组成的巨大网状结构，使醪液粘度降低，便于输送，因此液化酶在酒精生产中是一种不可缺少的酶，测定它的含量，对指导生产具有重要的意义。 液化酶能将淀粉分子链的α-1,4-葡萄糖苷键切断成链长短不一的糊精及少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异反应逐渐消失。以该颜色消失的时间计算每小时可水解可溶性淀粉的克数计算酶活力。

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1 第9章 酶法分析 一、 液化酶活力的测定 1、原理 液化酶作用于淀粉糊时，能迅速切断淀粉分子组成的巨大网状结构，使醪液粘度降低，便于输送，因此液化酶在酒精生产中是一种不可缺少的酶，测定它的含量，对指导生产具有重要的意义。 液化酶能将淀粉分子链的α-1,4-葡萄糖苷键切断成链长短不一的糊精及少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异反应逐渐消失。以该颜色消失的时间计算每小时可水解可溶性淀粉的克数计算酶活力。

2 2、表示方法 1g酶粉或1mL酶液于600C、pH6.0条件下，1小时液化可溶性淀粉的克数表示液化淀粉酶的酶活力单位。

3 二、糖化酶活力的测定 1、原理 糖化型淀粉酶（即淀粉—1,4-葡萄糖苷酶，简称糖化酶）能将淀粉从分子链非还原性末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖的醛基被弱氧化剂次碘酸钠所氧化。根据所消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，计算出单位时间内由可溶性淀粉转化为葡萄糖的量，并表示出酶活力的大小。

4 2、表示方法 1g酶粉或1mL酶液在400C、pH4.6的条件下，1小时分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖的酶量为1个酶活力单位，以u/g或u/mL表示。

5 三、生物传感器在生物产品分析中的应用 1、工作原理 SBA 型生物传感自动分析仪利用酶促反应来进行定量分析，测定的关键传感器是固定化酶和H2O2 电极复合传感器，分析过程基于以下生化反应：

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7 2、测定过程 （1） 样品经稀释后（要求pH 在6－8 左右），由定量进样针吸取25ul，并注入反应池；
（2）含有样品的底物在样品室内迅速按照一定比例混合均匀，底物透过酶膜圈的外层与固定化酶层接触并反应，反应放出的H2O2 再透过酶膜圈的内层与白金－银电极接触，并产生电流信号，该电流信号与底物浓度成线性比例关系，经微机控制的信号，可直接显示并打印结果。

8 3、生物传感分析仪的特点 （1） 反应靠固定化酶催化，昂贵的生化试剂可以多次重复使用。一张酶膜可测定数千次，因此总的测定成本比较低。

9 （2）操作简便：操作只消耗缓冲液和定标药品，测定时只需进样一个动作，其后的操作就可自动完成，药品用量只有25 微升。
（3）速度快：20 秒可得到测定结果，经25 秒自动冲洗进行下一次测定，一小时能测定60 次左右。 （4）结果准确，一般误差小于1％，不受颜色，混浊度等影响。 （5）因为是一种特殊的生化仪器，操作维护需要一定的酶学知识，仪器的性能随酶膜的状态而有所变化。

10 酶膜的参数（以谷氨酸酶膜为例） 活性的定义：在分析仪上用主操作程序测定未定标前的酶膜对SBA-标准液25ul 的
仪器显示数（称为基础活性）。测定值大于100 为合格。

11 本章复习题 1、液化酶、糖化酶活力的物理意义？ 2、简述生物传感器分析仪在生物工程行业中的应用？

12 第10章 有害成分的检测 主要内容 第一节 甲醇含量的检测 第二节 杂醇油含量的检测 第三节 微量甲醛含量的检测 第四节 氯丙醇含量的测定 第五节 铅含量的检测

13 第一节 甲醇含量的检测 一、来源 二、毒害作用 三、案例 1、2005年，云梦县一白酒加工销售点出售的散装白酒中，甲醇含量竟然超过国家规定标准200余倍。该县查封这批害人的毒酒，并对已售出的少量有毒白酒进行追查。 　　云梦县质检局在城关泰山路一家白酒加工销售点检查时，发现该点加工销售的散装白酒，每100毫升甲醇含量达到8.32克，而国家规定白酒中甲醇含量每100毫升不得超过0.04克。执法人员现场封存了有毒白酒540余公斤。店主李某称，该酒只销售了30余公斤。

14 2、山西朔州假酒案 1998年除夕夜——“紧急通知：我市近日流入清徐、文水、孝义生产的散装白酒，已造成严重后果，望广大市民不要饮用此酒。” 文水县农民王青华用34吨甲醇加水后勾兑成散装白酒57.5吨，出售给个体户批发商王晓东、杨万才、刘世春等人。这些人明知道这些散装白酒甲醇含量严重超标（后来经测定，每升含甲醇361克，超过国家标准902倍），但为了牟取暴利，铤而走险，置广大乡亲生命于不顾，造成27人丧生。 1998年3月9日，王青华等6名犯罪分子被判处死刑。

15 3、 蒙古国副总理恩赫包勒德（08.1.2）说，首都乌兰巴托巴嘎诺尔区新年期间发生饮用伪劣白酒中毒事件，已造成11人死亡。
　　恩赫包勒德说，经调查，有52人在饮用同一厂家生产的白酒后出现中毒症状，酒中甲醇含量严重超标。除死者外，其余41名中毒者仍在医院接受救治，其中3人病情严重。 　　恩赫包勒德说，政府已查封酒厂，并禁止在巴嘎诺尔区出售白酒，质检机构已开始对乌兰巴托市场上出售的酒精类饮料进行检查。 　　白酒在蒙古国是必不可少的招待品。

16 4、湖北五峰甲醇中毒死亡人员增至4人 12人住院 新闻发布：国家葡萄酒质量网 　 发布时间：   　中新社宜昌三月二十五日电 (刘良伟 上官纯青)至二十五日下午，发生在湖北省五峰土家族自治县的甲醇勾兑的散装白酒致死人命事件，累计已有四人死亡，十二人住进医院抢救治疗，还有十八人因出现不良反应在医院门诊输液治疗。目前，宜昌市已启动食品安全三级应急响应，采取系列措施控制事态进一步发展。湖北省质监局、卫生厅、工商局、公安厅等部门派员已赶至五峰指导事件调查处理工作。 三月二十三日十三时零三分至二十四日十七时，湖北五峰县公安局连续接到报案，共有四人疑似酒精中毒死亡。经公安、质监、卫生等部门赶到现场调查取证，初步检验结果表明酒中甲醇超标。　　

17 据公安部门初步调查，四名死者所饮用白酒均来自五峰镇万马池十一号宏斌酒水批发部所批出，该店业主王长兵，男，三十三岁，目前已被警方控制，据其交代，今年三月十五日，他从宜都市聚能日用品商店购进工业甲醇三点七四吨，共勾兑假酒六千五百公斤，已售出约五千公斤，主要销往五峰县五峰镇、采花乡宋家河、长乐坪镇白鹿庄。至三月二十四日上午，相关部门追回嫌疑人所交代的假酒四千二百八十八公斤。截止目前，五峰全县已查封散装白酒七万六千八百三十二公斤，封存甲醇二千九百七十公斤。 目前，该县领导带队深入各乡镇进行拉网式排查，进一步加强宣传，同时向周边长阳县、宜都市告知这一信息，以防问题散装白酒流入周边地区。

18 四、分析方法 （一）GC （二）品红—亚硫酸比色法 1、原理：甲醇测定采用氧化法。将甲醇氧化成甲醛，用品红-亚硫酸显色，以比色法测定。 （1）甲醇在磷酸介质中被高锰酸钾氧化为甲醛： 5CH3OH + 2KMnO4 +4H3PO4＝5HCHO +2KH2PO4 + 2MnHPO4 + 8H2O （2）过量的高锰酸钾被草酸还原： 5H2C2O4 + 2KMnO4 + 3H2SO4＝ 2MnSO4 + K2SO4 + 10CO2 + 8H2O （3）所生成的甲醛与品红-亚硫酸（又称喜夫试剂，Schiff）反应，生成醌式结构的蓝紫色化合物，以比色法测定。

19 2、样品处理 3、试剂 （1）高锰酸钾-磷酸溶液 （2）草酸-硫酸溶液 （3）品红-亚硫酸溶液 （4）标准甲醇溶液
（5） 60%（vol）无甲醇酒精 4、实验步骤 （1）标准系列管的制备

20 编号 1 2 3 4 5 甲醇标准溶液（mL） 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 60%（vol）无甲醇酒精（mL） 0.50 水（mL） 4.50 4.30 4.10 3.90 3.70 3.50

21 于各管中加入2. 00毫升高锰酸钾-磷酸溶液，摇匀，放置10分钟。加2. 00毫升草酸-硫酸溶液，褪色后，加5
于各管中加入2.00毫升高锰酸钾-磷酸溶液，摇匀，放置10分钟。加2.00毫升草酸-硫酸溶液，褪色后，加5.00毫升亚硫酸品红溶液，摇匀，于室温下显色30min(如室温低于200C，则需在200C水浴中显色)。显色30分钟后，立即在590nm 波长下测光密度，绘制标准曲线。从标准曲线上求得试样管光密度所对应的甲醇量(毫克)，然后计算出样品中甲醇的含量。 （2）试样管的制备 亚硫酸品红的呈色灵敏度与酒精含量有关，故标准管与酒样管中酒精度应需一致。标准管中采用酒精度为6％(vol)，因此，试样管中酒精度也需调制成6％(vol)，参照标准管。

22 5、计算 甲醇(g／L) ＝ 6、说明及注意事项

23 第二节 杂醇油含量的检测 一、概述 二、分析方法 （一） GC （二）对二甲胺基苯甲醛比色法 1、原理：除正丙醇外的高级醇，在浓硫酸作用下，都会脱水，生成不饱和烃（如：异丁醇变成丁烯，异戊醇变成戊烯）。而不饱和烃与对—二甲氨基苯甲醛反应生成橙红色化合物，与标准系列比较定量。

24 2、分析步骤 3、说明及注意事项 （1）对—二甲氨基苯甲醛对不同醇类的显色程度不一致。对相同量醇类，其显色灵敏度为异丁醇﹥异戊醇﹥正戊醇，而正丙醇、异丙醇、正丁醇等显色灵敏度很差。同时，酒中杂醇油成分复杂，比例不一。准确的测定方法应采用气相色谱法。 （2）该显色反应不是杂醇油的特效反应，凡试样中能被硫酸脱水生成不饱和烯烃的化合物，如醛、酮和萜等都有类似反应而干扰测定。可用盐酸间苯二胺处理。

25 第三节 微量甲醛含量的检测

26 第四节 食品中氯丙醇及其检测 (一)氯丙醇的种类及性质 丙三醇和盐酸反应可产生4种氯丙醇产物，即 3一氯一1，2一丙二醇(3一MCPD)、
第四节 食品中氯丙醇及其检测 (一)氯丙醇的种类及性质 丙三醇和盐酸反应可产生4种氯丙醇产物，即 3一氯一1，2一丙二醇(3一MCPD)、 2一氯一1，3一丙二醇(2一MCPD)、 l，3一二氯一2一丙醇(1，3一DCP)、 2，3一二氯一l一丙醇(2，3一DCP)。 其中主要的产物是3一氯一1，2一丙二醇。

27 氯丙醇微溶于水，易溶于有机溶剂。不同的氯丙醇其毒性不一样，
3一MCPD会影响肾脏及生育，还可引发癌症； 1，3一DCP会引起肝、肾脏、甲状腺等的癌变； 2，3一DCP对肾脏、肝脏也有一定的毒性。

28 (二)氯丙醇的来源 食品中的氯丙醇主要来源于酸水解动植物蛋白，在酸水解蛋白的同时，原料的脂肪或油脂中存在的三酰甘油也被水解成丙三醇，并进一步与盐酸反应生成氯丙醇。 在国外，水解植物蛋白作为风味剂在食品中大量使用，包括许多加工和预加工食品、汤、肉 汁混合物、风味快餐和固体汤料中，其典型的添加水平大致在0.1％～0.8％之间；在我国，允许用水解植物蛋白来生产配制酱油，因此，有可能导致一些酱油制品中氯丙醇含量过多。

29 我国《食品卫生法》中对食品生产使用的原料和辅料提出了明确的规定，指出非食品用原料不准用于食品生产。因此，使用人发、猪毛、畜蹄角等非食用原料生产所谓的“氨基酸调味液”作为配制酱油是一种违法行为。
另外，氯丙醇的其他来源还包括：袋泡茶的包装袋，以含氯凝聚剂做成的净水剂，被包装工业称为“第三代”食品包装材料的聚3一氯一1，2一环丙烷树脂等。

30 (三)酸水解植物蛋白调味液中氯丙醇的测定(商业部标准SB10338——2000)
用20％NaCl溶液调节酸水解植物蛋白调味液至固形物含量为36％的溶液后，取适量上弗罗里硅藻土柱，用乙酸乙酯洗脱，洗脱液在50℃下浓缩至近干，用乙酸乙酯定容后，用GC法测定，内标法定量。

31 第五节 铅、汞、砷含量的检测 一、铅含量的检测

32 分析方法 （一） 石墨炉原子吸收光谱法 仪器：原子吸收分光光度计（附石墨炉及铅空心阴极灯） （二） 氢化物原子荧光光谱法 仪器：原子荧光光度计 （三） 火焰原子吸收光谱法 仪器 ：原子吸收分光光度计附火焰原子化器 （四）二硫腙比色法（双硫腙比色法）

33 1、原理 试样经消化后，在碱性（pH值在 ）溶剂中，Pb2+与双硫腙形成红色络合物，溶于氯仿或CCl4中，红色深浅与铅离子浓度成正比，与标准系列比较定量。 测定前要加盐酸羟胺、氰化钾、柠檬酸铵来掩蔽铁、铜、锌等离子干扰。

34 2、说明 （1）氰化钾，剧毒，不能用手接触，必须在溶液调至碱性再加入。废的氰化钾溶液应加NaOH和FeSO4，使其变成亚铁氰化钾再倒掉。
（2）试剂的作用 盐酸羟胺：作为还原剂，保护双硫腙被高价金属离子、过氧化物等所氧化，防止溶液中Fe3+与氰化物生成赤血盐。 氰化钾：是较强的配位体，可掩蔽铜、锌等多种金属离子的干扰。 柠檬酸铵：防止在碱性条件下碱土金属的沉淀。

35 （五）单扫描极谱法 原理：试样经消解后，铅以离子形式存在，在酸性介质中，与I-形成的PbI42-络离子具有电活性，在滴汞电极上产生还原电流。峰电流与铅含量呈线性关系，与标准系列比较定量。 仪器：极谱分析仪

36 本章复习题 1、饮料酒中甲醇的来源、危害、限量及分析方法（包括测定原理）？ 2、铅含量的分析方法有哪些，在双硫腙比色法中加入盐酸羟胺、氰化钾、柠檬酸铵的作用是什么？

37 考试题类型 选择、填空、问答、计算题 时间

38 谢 谢！