UV-Vis, Fluorescence, Phosphorescence, FTIR, and Raman Spectroscopy

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1 UV-Vis, Fluorescence, Phosphorescence, FTIR, and Raman Spectroscopy
Vibrational spectroscopy ： Infrared spectroscopy Raman spectroscopy Electronic excitation： Fluorescence Phosphorescence Infrared spectroscopy Raman spectroscopy Electronic excitation Frequency (Hz) 106 109 1012 1015 1018 1021 Millimeter telemetry waves, Short wave radio Cosmic rays Microwaves radar AM radio X-rays γ-rays TV ,FM Infrared Ultraviolet Wavelength (m) 103 1 10-3 10-6 10-9 10-12 E=hν=hc/λ h= 6.62×10-27 J-s c= 3×1010 cm/s 1 103 Visible light Wavenumber (cm-1) 700 nm 400 nm Wavelength (nm) Speaker：王竣弘 Adviser：Hsien-Chang Chang

2 光的特性 光的直進性 光的折射 光的全反射 光徑的可逆性 光的色散現象 光電效應 光的干涉 光的繞射 光子 電子 金屬
這只會發生在當光線從光密介質（較高折射率的介質）進入到光疏介質（較低折射率的介質），入射角大於臨界角時。 光電效應是指物質吸收光子並激發出自由電子的行為。當金屬表面在特定的光輻照作用下，金屬會吸收光子並發射電子，發射出來的電子叫做光電子 光子 電子 金屬

3 光譜的分類 本質 波長 產生方式 按波長區域 按產生本質 紅外光譜 可見光譜 紫外光譜
在一些可見光譜的紅端之外，存在著波長更長的紅外線；同樣，在紫端之外，則存在有波長更短的紫外線。紅外線和紫外線都不能為肉眼所覺察，但可通過儀器加以記錄。因此，除可見光譜，光譜還包括有紅外光譜與紫外光譜。 按產生本質 按產生本質，光譜可分為分子光譜(帶狀光譜)與原子光譜(線狀光譜)。 在分子中，能量電子態 > 能量振動態> 能量轉動態。因此在分子的電子態之間的躍遷中，總是伴隨著振動躍遷和轉動躍遷的，因而許多光譜線就密集在一起而形成分子光譜。因此，分子光譜又叫做帶狀光譜。 在原子中，當原子以某種方式從基態提升到較高的能態時，原子內部的能量增加了，這些多餘的能量將被以光的形式發射出來，於是產生了原子的發射光譜，亦即原子光譜。因為這種原子能態的變化是非連續量子性的，所產生的光譜也由一些不連續的亮線所組成，所以原子光譜又被稱作線狀光譜。

4 Part 1: UV-Vis(紫外－可見分光光度法)
可見光及紫外光之燈管做為光源，通過濾光鏡調整色調後，經聚焦後通過單色光分光稜鏡，再經過狹縫選擇波長，使成單一且特定波長之光線，其後射入樣品管中之水樣中，再射入光電管中將光能轉換為電器訊號。藉由樣本及空白水樣間所吸收之光能量差與標準液之能量吸收值相比較，便可律定樣本中之待測物濃度 紫外光譜是分子中某些價電子吸收了一定波長的電磁波，由低能級躍近到高能級而產生的一種光譜，也稱之為電子光譜。目前使用的紫外-可見光光譜儀波長範圍是200~800nm。其基本原理是用不同波長的近紫外光（200~400nm）依次照一定濃度的被測樣品溶液時，就會發現部分波長的光被吸收。如果以波長λ為橫座標（單位nm），吸收度 （absorbance）A為縱座標作圖，即得到紫外光譜（ultraviolet spectra，簡稱UV）。 紫外、可見和近紅外光譜經常連續測試。 紫外－可見分光光度法（Ultraviolet–visible spectroscopy，UV-Vis），又稱紫外－可見分子吸收光譜法，是以紫外線－可見光區域電磁波連續光譜作為光源照射樣品，研究物質分子對光吸收的相對強度的方法。通過分子紫外－可見分子吸收光譜法的分析可以進行定性分析，並可依據朗伯-比爾定律進行定量分析。[1]當光的波長減小到一定數值時，溶劑對它產生強烈的吸收，即「端吸收」，樣品測試就在「端吸收」的透明界限之內。 濾光鏡

5 Beer-Lamber Law (also known as Beer's law or the Beer–Lambert–Bouguer law )
c：濃度 I0：入射光強度 I1 ：透射光強度 偵測器 入射光

6 Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)
It is a coenzyme found in all living cells. The compound is a dinucleotide(核苷酸), since it consists of two nucleotides joined through their phosphate groups(磷酸基): with one nucleotide containing an adenosine(腺苷) ring, and the other containing nicotinamide. 煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（簡稱：輔酶Ⅰ，英語：Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+），是一種轉遞質子（更準確來說是氫離子）的輔酶，它出現在細胞很多代謝反應中。NADH或更準確NADH + H+是它的還原形式。 OPO3  NADP

7 Absorbance spectra of NAD+ and NADH
The proton is released into solution, while the reductant RH2 is oxidized and NAD+ reduced to NADH by transfer of the hydride to the nicotinamide ring. Both NAD+ and NADH absorb strongly in the ultraviolet due to the adenine base. For example, peak absorption of NAD+ is at a wavelength of 259 nm, with an extinction coefficient of 16,900 M-1cm-1. NADH also absorbs at higher wavelengths, with a second peak in UV absorption at 339 nm with an extinction coefficient of 6,220 M-1cm-1. Oxidoreductase (氧化還原酶) RH2 + NAD+ → NADH + H+ + R A 340 nm : 6.22 = M x 1 cm x 6,220 M-1cm-1 NADH Concentration

8 Direct versus coupled assays
UV light is often used, since the common coenzymes NADH and NADPH absorb UV light in their reduced forms, but do not in their oxidised forms. An oxidoreductase using NADH as a substrate could therefore be assayed by following the decrease in UV absorbance at a wavelength of 340 nm as it consumes the coenzyme. the coupled assay for the enzyme hexokinase, which can be assayed by coupling its production of glucose-6-phosphate to NADPH production, using glucose-6-phosphate dehydrogenase. UV光只會被還原態所吸收 但不被氧化態吸收 一氧化還原酶以NADH為基底來測量 ，使用340nm 來測量 究竟使用了多少輔酶

9 Role in redox metabolism of NAD(H)
The redox reactions catalyzed by oxidoreductases are vital in all parts of metabolism, but one particularly important area where these reactions occur is in the release of energy from nutrients. Here, reduced compounds such as glucose are oxidized, thereby releasing energy. This energy is transferred to NAD+ by reduction to NADH, as part of glycolysis and the citric acid cycle.

10 Part 2: 螢光、磷光 螢光： 吸收光子能量，電子從基態單態激發至激發單態S1，接著以發光的形式放出能量，電子再度回到基態。螢光態的壽命為10−8至10−5秒。 磷光： 吸收光子能量，電子從基態單態激發至激發單態S1，接著經由系間跨越過程躍遷至能量較低的激發三重態T1，最後以發光的形式放出能量， 電子再度回到基態。磷光的壽命為10− 4秒到數分鐘乃至數小時不等。

11 採用螢光標記的鏈終止劑所得到的DNA測序圖
在原初的方法中，需要對DNA的引子端進行螢光標記， 以便在測序凝膠板上確定DNA色帶的位置。 在改進方法中，對作為鏈終止劑的4種雙脫氧核苷酸(ddTBP)分別進行螢光標記，電泳結束後不同長度的DNA分子彼此分開，經紫外線照射，4種被標記的雙脫氧核苷酸發出不同波長的螢光。通過分析螢光的光譜即可分辨出DNA的序列 採用螢光標記的鏈終止劑所得到的DNA測序圖

12 Part 3: IR system (紅外光譜法)
光譜範圍 Infrared Ultraviolet 分子不是靜的物體，它們不僅相對地在運動著， 即使在單一的分子內，其組成的原子核也隨時在改變著相對的位置。 分子內之原子核相對運動的結果， 便造成振動（vibration）或分子的旋轉（rotation）。 Near-infrared Overtone region 震動 Far-infrared rotation-region 旋轉 Infrared (mid) vibration-rotation region 震動-旋轉

13 分子運動 簡單的雙原子分子只有一種鍵，那就是伸縮。
對稱伸縮 非對稱伸縮 剪刀式擺動 左右搖擺 上下搖擺 扭擺 簡單的雙原子分子只有一種鍵，那就是伸縮。 更複雜的分子可能會有許多鍵，且振動可能會共軛出現，導致某種特徵頻率的紅外吸收可和化學組聯繫起來。 常在有機化合物中發現的CH2組，可藉「對稱和非對稱伸縮」、「剪刀式擺動」、「左右搖擺」、「上下搖擺」和「扭擺」六種方式振動。

14 傳統(IR)與傅氏轉換紅外線光譜儀(FTIR)之原理
FTIR：採用Michelson干涉儀取得干涉光譜，再轉換為頻譜。 優點可同步取得全頻光譜縮短掃瞄時間及頻率解析度的提升。 比較對一個400~4000 cm-1範圍的光譜，若解析度為1 cm-1，傳統光柵分光儀同一時間點平均將只有1/3600的光源強度通過光柵到達偵測器，99.97%的光都被擋在外。 Michelson interferometer 因FTIR不經過分光，同一時間可測得所有頻率的光，不需掃瞄，節省時間，故用傳統光譜測一樣品的時間可取得多次的干涉光譜，加以平均而獲得高訊號/雜訊比(S/N)的光譜。 因為干涉儀會調制光的頻率，所以不會有色散儀中所出現雜散光的情形。 FTIR光譜儀中，所有光束路徑完全沒有用到狹縫，偵測到的能量較高，因此發展運用在能量受到限制的遠紅外光區。 干涉儀會調制光的頻率，所以不會有色散儀中所出現雜散光的情形。 一般傳統光譜儀 傅氏轉換紅外線光譜儀

15 麥克森干涉儀 (Michelson interferometer ) M1 M2 麥克森干涉儀，是用分光鏡(Beam Splitter)使兩光束進行方向完全不同強度相等之一反射及一透射光束，當其再相遇時便形成干涉條紋。反射光束從平面鏡M1反射，第二次通過分光鏡時透射而到屏幕。透射光束從平面鏡M2反射，再由分光鏡反射而至屏幕，從鏡 M2反射之光束並未穿透分光鏡，這一點使得它與從鏡 M1反射之光束有光程差。麥克森干涉儀利用光波的干涉，使量測的精度提高到1/2 個波長以內。

16 楊格雙狹縫干涉 其中的d 僅有數公釐，而 r 長達1 meter，故 PS1 、PA 、PS 2 近似平行。

17 Fourier Transform of Interferogram
麥克森干涉儀是以振幅來區分的干涉儀之要例，麥克森(Michelson)干涉儀，係以部分反射平面鏡使振幅區分所得的兩光柱進行的方向完全不同，當其再相遇時便形成干涉條紋。部分反射平面鏡又稱分光鏡 BS，分光鏡之反射膜鍍於偏靠於M1反射鏡之一側，使來自光源之光分成強度相等之一反射及一透射光柱。光從鏡M2 正向反射，第二次通過BS 而達圖下的屏風 S，光從鏡 M1反射，二次通過 C，再由BS反射而至屏風S，從鏡 M1反射之光束並未穿透分光鏡，這一點使得它與從鏡 M2反射之光束有位置及光程之偏移，加入玻璃板 C 之目的在使二線路在玻璃中之光程及路徑相等，故C稱為補償板(compensation plate )。此不僅是使單色光產生條紋的基本儀器，當用白光時亦是不可缺少的。 Multichannel

18 衰減全反射(Attenuated total reflection, ATR)
光束以一角度由C點進入高折射率n1的介質A，當光束到達A-B介質介面時，如果入射角q大於A-B介質介面的全反射角，光束能量將在B介質界面以指數函數衰減。若在B介質(折射率n2)上放置可吸收光子的分子，則當光束在A介質內進行全反射的過程中則可偵測到置於B介質分子的吸收光譜，置於B介質的分子其吸收強度隨著距離A-B界面越遠而呈指數含數遞減，此現象就稱之衰減全反射。

19 樣品處理 紅外線光譜於材料上的應用相當廣泛，例如高分子聚合物材料、有機導電材料、清潔劑、介面活性劑等等。此外樣品依照物理狀態或不同的環境下，所呈現的紅外線光譜也不一樣，因此必須適當的處理樣品就能獲得正確的光譜。 氣體樣品及低沸點的液體樣品： 將低沸點的液體蒸汽或氣體樣品引入氣體槽中(gas cell)加以測定。 液體樣品： 將純液體滴在鹽片上，再用另一鹽片夾起來，放在樣品架上固定。 固體樣品： 固體樣品磨成細粉分散在液體油膏或固體粉末介質中進行測定。

20 正辛烷紅外線吸收光譜 四個吸收頻帶於：2952、1465、1380、720 cm-1。 2952 cm-1為C-H的伸縮震動。

21 生物分子之紅外線吸收光譜帶

22 Observations of laser scattering from the sample
Elastic: (Rayleigh scattering) Inelastic: (Raman scattering) Absorption matter Transmitted light Incident light Scattered light 拉曼散射(Raman scattering) Stokes side 瑞立散射 (Reyleigh scattering) 拉曼散射 (Raman scattering） anti-Stokes side 激態 激態 激態 hv h（v－v’） hv hv hv h（v + v’） Vibrational energy levels 基態 基態 基態

23 拉曼光譜的極化誘發 μ＝αE 則誘發偶極矩為 ※此式中的三項分別為 Rayleigh散射(ν0) anti-Stokes線(ν0+νk)
E:電場 μ:誘發偶極矩 α:極化率 ν0 :電磁波頻率 E0 :電場之振幅 α0:平衡極化率 Δα:極化率最大改變量 則誘發偶極矩為 ※此式中的三項分別為 Rayleigh散射(ν0) anti-Stokes線(ν0+νk) Stokes線(ν0-νk)

24 inVia

25 Light Pathway of Raman System
Sample 578 pixel × 385 pixel (1 pixel=22 mm) 1200, 1800 Lines/mm Notch/Edge 40~45 mm Grating Filter Slit CCD Lens Lens Lens Prism Objective 10X, 20X, 40X ND Filter Expander Mirror 擴束至 6 mm Laser 633, 785 nm

26 共振拉曼散射(RR) (Resonance Raman scattering)
優點： 1.訊號放大，易於辨別 2.對於取得不易的試樣，即使低濃度亦可偵測 3.針對部份結構激發，突顯少數譜線，易於分析

27 表面增顯拉曼光譜 SERS(Surface-Enhanced Raman Spectroscopy)
將樣品吸附在膠態金屬顆粒(通常是金、銀或銅材質)的表面，或著吸附在這些金屬薄片的粗糙表面上。 吸附分子的拉曼圖普通常會增強103到106。 SERS effect arises from two mechanisms： EM (electromagnetic) enhancement mechanism CHEM (chemical) enhancement mechanism Surface Plasma Resonance Charge Transfer

28 EM (electromagnetic) enhancement mechanism
Surface Plasma Resonance Exciting laser a: radius of the metal sphere λ: wavelength of incident light Er: total electric field at a distance r from the sphere surface θ: the angle relative to the direction of the electric field CHEM (chemical) enhancement mechanism Charge Transfer An electron transfers to the metal from HOMO. The hot electron transfers to LUMO via the metal. The electron return to its initial state and Stokes photon creation.

29 CCl4 spectrum 218 314 459 758 & 786 doubly degenerate
triply degenerate fully symmetric triply degenerate 218 314 459 758 & 786

30 紅外光譜和拉曼光譜比較 紅外光譜 拉曼光譜 產生模式 吸收光譜 散射光譜 激發光源 紅外線 紫外光~近紅外光 振動活化 偶極矩轉動 極化改變
檢測水溶液樣本 水的紅外吸收 很強，干擾大 水的拉曼散射 很弱，干擾小

31 紅外光譜 拉曼光譜 粉末 容易 單晶 很難 很容易 純液體 水溶液 難 氣體 聚合物纖維 化合物部分特徵 優良 訊號取難易 較難

32 Gold film on silicon film
Investigation of the Interaction between Amino Acids and Au by Surface-Enhanced Infrared Spectroscopy Reference electrode Counter Working electrode (Au film) Si prism Purge gas IR beam O C H N R H Gold film on silicon film Glycine Li-Chia Chen1, Taro Uchida2, Hsien-Chang Chang1, Masatoshi Osawa2 1Institute of Biomedical Engineering, National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan 2Catalysis Research Center, Hokkaido University, Sapporo , Japan 32