第二节 HPLC仪器.

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1 第二节 HPLC仪器

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4 高压输液装置 →进样系统 →分离系统→ 检测系统 此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。
HPLC仪器包括： 高压输液装置 →进样系统 →分离系统→ 检测系统 此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置。 梯度淋洗

5 1. 高压输液系统 1）贮液器： 2）脱气： 3）高压泵： 输液泵种类：恒流型和恒压型。 4）梯度淋洗装置：
1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很小约2 m，可防止颗粒物进入泵内。 超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。 要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。 输液泵种类：恒流型和恒压型。 4）梯度淋洗装置：

6 ① 往复式柱塞泵（恒流型） ② 气动放大泵（恒压型）

7 4）梯度淋洗装置： 作用是在分离过程中，按一定的程序连续改变流动相中多种不同性质溶剂的配比，以改变流动相的极性、离子强度或酸度等，从而提高试样的分离效率，缩短分析时间，使色谱峰形得到改善，提高测定的灵敏度和定量的准确度。

8 2. 进样系统 1）隔膜注射进样： 使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但不能承受高压、进样量小且重现性差。

9 2）高压进样阀： 目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好。 装入样品 出口 进样 采样环 泵入溶剂 进色谱柱

10 3. 色谱柱

11 1）要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为15~30cm，内径为4~5mm；
2）柱的填充：主要采用匀浆法（湿法）。 填充方法： 填充时，将制作好的匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快（防凝聚、沉降或结块）、且无空气进入（影响填充均匀性）。

12 4. 检测器 1）紫外光度检测器 原理： 依据被分析试样组分对特定紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守比尔定律。
紫外光度检测器光路图

13 特点： 1、高灵敏度，最小检测量10-9g·mL-1； 2、对流速和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱； 3、结构简单； 4、不适用于对紫外完全不吸收的试样，溶剂的选择 受限制。

14 光电二极管阵列检测器（PDA或DAD）

15 快速扫描—光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱-光谱图
波长 可的松 氟美松 皮质酮 快速扫描—光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱-光谱图

16 根据某些物质受激后能产生一定强度荧光的性质，可制成灵敏度极高的荧光检测器。它是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高2~3个数量级。
2）荧光检测器 根据某些物质受激后能产生一定强度荧光的性质，可制成灵敏度极高的荧光检测器。它是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高2~3个数量级。 适合于具有对称共轭结构的有机芳环分子，如稠环芳烃、甾族化合物、酶、氨基酸、维生素、色素、蛋白质等荧光物质的测定。

17 3）示差折光检测器 原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。 光源 调零 光学零 参比 样品 平面镜 透镜 光电转换 记录仪 放大器 遮光板 特点： ①为通用型浓度检测器，灵敏度为10-7g•mL－1； ②但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。

18 原理：基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。
4）电导检测器 属于电化学检测器，主要用于离子色谱的检测。 原理：基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。 对温度变化敏感。 5）蒸发光散射检测器 原理：见书本P91 特点： ①通用型检测器 ②与示差折光检测器相比，灵敏度高 ③响应信号不受溶剂和温度的影响，可用于梯度淋洗 ④对几乎所有样品的响应因子接近一致，因此可以在没有标准品的情况下，采用内标法测定未知物的近似含量（fi/fs接近1）