Instrumental Analysis

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1 Instrumental Analysis
仪器分析课程讲义 Instrumental Analysis 主讲：张敬华

2 第九章 紫外吸收光谱法 Ultraviolet Molecular Absorption Spectrometry
利用紫外吸收光谱进行定量分析的由来已久，公元60年古希腊已知道利用五味子浸液来估计醋中铁的含量。这一古老的方法由于最初是运用人的眼睛来进行检测，所以叫比色法。20世纪30年代产生了第一台光电比色计，40年代出现的 BakmanUV 分光光度计, 促进了新的分光光度计的发展。随着计算机的发展，紫外分光光度计已向着微型化﹑自动化﹑在线和多组分同时测定等方向发展。

3 一、分子内部的运动及分子能级 分子光谱比原子光谱要复杂得多,在分子中，除了有电子相对于原子核的运动外，还有组成分子的各原子在其平衡位置附近的振动，以及分子本身绕其重心的转动 ,分子总的能量可以认为是这三种运动能量之和 即：E ＝ Ee+ Ev+ Er 式中Ee为电子能量 ，Ev为振动能量，Er转动能量。 分子中除了电子能级外，还有振动能级和转动能级这三种能级都是量子化的、不连续的。对于简单的双原子分子， ΔEe > ΔEv > ΔEr

4 二、能级跃迁与分子吸收光谱的类型 通常情况下，分子处于较低的能量状态，即基态。分子吸收能量具有量子化特征，即分子只能吸收等于二个能级之差的能量。如果外界给分子提供能量（如光能），分子就可能吸收能量引起能级跃迁，而由基态跃迁到激发态能级。 ΔE=E1-E2=hν=hc/λ 由于三种能级跃迁所需要的能量不同，所以需要不同的波长范围的电磁辐射使其跃迁，即在不同的光学区域产生吸收光谱。

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6 1. 转动能级跃迁与远红外光谱 转动能级间的能量差ΔEr约为：0. 025～0
1.转动能级跃迁与远红外光谱 转动能级间的能量差ΔEr约为：0.025～0.003eV。可计算出 转动能级跃迁产生吸收光谱位于远红外区（50 ~ 300mm）, 称远红外光谱或分子转动光谱。 2.振动能级 振动能级间的能量差ΔEv 约为： １～0.025eV。可计算出振动能级跃迁产生的吸收光谱位于红外区(0.78~50μm)，称红外光谱或分子振动光谱。振动能级跃迁时不可避免地会产生转动能级间的跃迁。即振动光谱中总包含有转动能级间跃迁，因而产生光谱也叫振动-转动光谱。 3.电子能级 电子能级的能量差 ΔEe : 20～1eV。可计算出电子跃迁产生的吸收光谱在紫外—可见光区(200~780nm)，称紫外—可见光谱或分子的电子光谱。电子能级迁时不可避免地会产生振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁，因而产生的谱线呈现宽谱带。紫外—可见光谱实际上是电子-振动-转动光谱。

7 应该指出，紫外光可分为近紫外光（200 ~ 400 nm）和真空紫外光（60 ~ 200 nm）。由于氧、氮、二氧化碳、水等在真空紫外区（60 ~ 200 nm）均有吸收，因此在测定这一范围的光谱时，必须将光学系统抽成真空，然后充以一些惰性气体，如氦、氖、氩等。鉴于真空紫外吸收光谱的研究需要昂贵的真空紫外分光光度计，故在实际应用中受到一定的限制。我们通常所说的紫外—可见分光光度法，实际上是指近紫外、可见分光光度法。

8 三、有机化合物的紫外吸收光谱 有机化合物此外吸收光谱（电子光谱）是由分子外层电子或价电子跃迁所产生的。按分子轨道理论，有机化合物分子中有：成键σ轨道，反键σ*轨道；成键π轨道，反键π＊轨道（不饱和烃）；另外还有非键轨道（杂原子存在）。各种轨道的能级不同，如图所示。

9 有机化合物的紫外—可见吸收光谱，是其分子中外层价电子跃迁的结果（三种）：σ电子、π电子、n电子。
分子轨道理论：一个成键轨道必定有一个相应的反键轨道。通常外层电子均处于分子轨道的基态，即成键轨道或非键轨道上。 外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态(反键轨道)跃迁。主要有四种跃迁所需能量ΔΕ大小顺序为：n→π＊ < π→π＊ < n→σ＊ < σ→σ＊

10 电子跃迁类型： 按能量大小：σ→ σ* > n → σ* > π→ π* > n→ π* 1.σ→ σ*跃迁：
饱和烃（甲烷，乙烷） E很高，λ<150nm（远紫外区） 2. n → σ*跃迁： 含杂原子饱和基团（—OH，—NH2） E较大，λ150~250nm（真空紫外区） 3. π→ π*跃迁： 不饱和基团（—C＝C—，—C ＝ O ） E较小，λ~ 200nm 体系共轭，E更小，λ更大 4. n→ π*跃迁： 含杂原子不饱和基团（—C ≡N ，C＝ O ） E最小，λ 200~400nm（近紫外区） 按能量大小：σ→ σ* > n → σ* > π→ π* > n→ π*

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12 生色团与助色团 生色团： 最有用的紫外—可见光谱是由π→π＊和n→π＊跃迁产生的。这两种跃迁均要求有机物分子中含有不饱和基团。这类含有π键的不饱和基团称为生色团。简单的生色团由双键或叁键体系组成，如乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮基—N＝N—、乙炔基、腈基—C㆔N等。 助色团： 有一些含有n电子的基团(如—OH、—OR、—NH２、—NHR、—X等)，它们本身没有生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但当它们与生色团相连时，就会发生n—π共轭作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称为助色团。

13 ⑴　σ→σ＊跃迁 所需能量最大，σ电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁。饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区(吸收波长λ<200nm，只能被真空紫外分光光度计检测到)。如甲烷的λ为125nm,乙烷λmax为135nm。 ⑵　n→σ＊跃迁 所需能量较大。吸收波长为150～250nm，大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观察到。含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤素等杂原子)均呈现n →σ*跃迁。如一氯甲烷、甲醇、三甲基胺n →σ*跃迁的λ分别为173nm、183nm和227nm。

14  ⑶ π→π＊跃迁 所需能量较小，吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区，摩尔吸光系数εmax一般在104L·mol－1·cm－1以上，属于强吸收。不饱和烃、共轭烯烃和芳香烃类均可发生该类跃迁。如：乙烯π→π*跃迁的λ为162 nm， εmax为: 1×104 L· mol-1·cm－1。  ⑷ n →π＊跃迁 需能量最低，吸收波长λ>200nm。这类跃迁在跃迁选律上属于禁阻跃迁，摩尔吸光系数一般为10～ L·mol-1 ·cm-1，吸收谱带强度较弱。分子中孤对电子和π键同时存在时发生n →π＊ 跃迁。丙酮n →π＊跃迁的λ为275nm εmax为22 L·mol-1 ·cm -1（溶剂环己烷)。

15 n →π*跃迁发生在含有杂原子的不饱和化合物中，其最大摩尔吸光系数εmax （表示物质对光吸收能力大小的参量）比较小，吸收峰随溶剂极性增加而向短波方向移动，即产生蓝移，下表列出了一些常见生色团n →π*跃迁的吸收特性。 生色团 化合物 溶剂 羰基 正己烷 280 16 羧基 乙醇 204 41 硝基 CH3NO2 异辛烷 22 亚硝基 C4H9NO 乙醚 665 20

16 π→π*跃迁可以发生在任何具有不饱和键的有机化合物分子中，其最大摩尔吸光率很大，吸收峰随溶剂极性增加向长波方向移动，即产生红移。下表列出了一些常见生色团π→π*跃迁的吸收特性。
羰基 正己烷 188 900 烯 正庚烷 177 13000 炔 178 10000

17 当一个分子中含有两个或两个以上的生色团时，按相互间的位置可以分为共轭和非共轭两种情况：非共轭时，各个生色团各自独立吸收，吸收带由各生色团的吸收带叠加而成；共轭时，生色团原有的吸收峰会发生改变，可产生新的吸收峰。下表列出了一些有关共轭结构的化合物的吸收特性。 化合物 共轭双键数 1 195 5000 2 200 10000 217 21000 3 254 25000 258 35000

18 另有一些基团，本身并不产生吸收峰，但与生色团共存于同一分子时，可引起吸收峰的位移和吸收强度的改变，这些基团称为助色团。如苯环的一个氢原子被一些基团取代后，苯环在254nm处的吸收带的最大吸收位置和强度就会改变。 化合物 取代基 苯 254 300 氯苯 264 320 溴苯 262 325 苯酚 273 1780 苯甲醚 272 2240

19 红移和蓝移 有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收波长λmax和吸收强度发生变化:

20 5．红移和蓝移： 由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基） 或采用不同溶剂后 吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移） 吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移） 6．增色效应和减色效应 增色效应：吸收强度增强的效应 减色效应：吸收强度减小的效应 7．强带和弱带： εmax>105 → 强带 εmin<103 → 弱带

21 紫外—可见吸收光谱中有机物发色体系信息分析的一般规律
⑴若在200～750nm波长范围内无吸收峰，则可能是直链烷烃、环烷烃、饱和脂肪族化合物或仅含一个双键的烯烃等。 ⑵若在270～350nm波长范围内有低强度吸收峰(ε＝10～100L·mol-1·cm-1),（n→π跃迁），则可能含有一个简单非共轭且含有n电子的生色团，如羰基。 ⑶若在2５0～300nm波长范围内有中等强度的吸收峰则可能含苯环。

22 ⑷若在210～250nm波长范围内有强吸收峰，则可能含有2个共轭双键；若在260～300nm波长范围内有强吸收峰，则说明该有机物含有3个或3个以上共轭双键。
⑸若该有机物的吸收峰延伸至可见光区，则该有机物可能是长链共轭或稠环化合物。

23 无机化合物的紫外-可见吸收光谱 1. 电子跃迁吸收光谱
镧系和锕系元素的离子对紫外和可见光的吸收是基于内层f电子的跃迁而产生的。其紫外可见光谱为一些狭长的特征吸收峰，这些峰几乎不受金属离子的配位环境的影响。

24 2. 电子跃迁吸收光谱 过渡金属的电子跃迁类型为d电子在不同d轨道间的跃迁，吸收紫外或可见光谱。这些峰强烈受配位环境的影响。
例如 cu2+以水为配位体，吸收峰在794nm处，而以氨为配位体，吸收峰在663nm处。此类光谱吸收强度弱，较少用于定量分析。

25 3.电荷转移吸收光谱 当吸收紫外可见辐射后，分子中原定域在金属M轨道上电荷的转移到配位体L的轨道，或按相反方向转移，这种跃迁称为电荷转移跃迁，所产生的吸收光谱称为荷移光谱。 电荷转移跃迁本质上属于分子内氧化还原反应，因此呈现荷移光谱的必要条件是构成分子的二组分，一个为电子给予体，另一个应为电子接受体。 电荷转移跃迁在跃迁选律上属于允许跃迁，其摩尔吸光系数一般都较大(10 4左右)，适宜于微量金属的检出和测定。 电荷转移跃迁在紫外区或可见光呈现荷移光谱，荷移光谱的最大吸收波长及吸收强度与电荷转移的难易程度有关。 例：Fe3＋与SCN－形成血红色配合物，在490nm处有强吸收峰。其实质是发生了如下反应： [Fe3＋ SCN－ ] ＋hν= [Fe SCN ]2＋

26 吸收带类型和影响因素 有机化合物的吸收带 吸收带(absorption band): 在紫外光谱中，吸收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型。 (1) R吸收带 (2) K吸收带 (3) B吸收带 (4) E吸收带

27 1．R带：由含杂原子的不饱和基团的n →π*跃迁产生
C＝O；C＝N；—N＝N— E小，λmax250~400nm，εmax<100 溶剂极性↑，λmax↓ → 蓝移（短移） 2．K带：由共轭双键的π→ π*跃迁产生 (—CH＝CH—)n，—CH＝C—CO— λmax >200nm，εmax>104 共轭体系增长，λmax↑→红移，εmax↑ 溶剂极性↑，对于—(—CH＝CH—)n— λmax不变 对于—CH＝C—CO— λmax↑→红移

28 3．B带：由π→ π*跃迁产生 芳香族化合物的主要特征吸收带 λmax =254nm，宽带，具有精细结构； εmax=200 极性溶剂中，或苯环连有取代基，其精细结构消失 4．E带：由苯环环形共轭系统的π→ π*跃迁产生 芳香族化合物的特征吸收带 E nm εmax>104 （常观察不到） E nm εmax= 强吸收 苯环有发色团取代且与苯环共轭时，E2带与K带合并 一起红移（长移）

29 物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件（温度、溶剂极性、pH等）不同，吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度等都可能发生变化。
影响紫外-可见吸收光谱的因素 物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件（温度、溶剂极性、pH等）不同，吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度等都可能发生变化。 1.温度 在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。

30 2. 溶剂 注意如下几点： （1）同一种物质由于使用的溶剂不同，得到的紫外—可见吸收光谱的峰形和最大吸收位置可能不一样，所以在测定物质的吸收光谱时，一定要注明所使用的溶剂 （2）尽量选用低极性溶剂； （3）能很好地溶解被测物，并且形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性； （4）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。

31 影响吸收带位置的因素： 1．溶剂效应： 对λmax影响： n-π*跃迁：溶剂极性↑，λmax↓蓝移 π-π*跃迁：溶剂极性↑ ，λmax↑红移 对吸收光谱精细结构影响 溶剂极性↑，苯环精细结构消失 溶剂的选择——极性；纯度高；截止波长< λmax 2．pH值的影响：影响物质存在型体，影响吸收波长

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33 可见分光光度计

34 紫外-可见分光光度计

35 仪器结构 光源 单色器 样品室 检测器 显示 1. 光源 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。 可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500 nm。 紫外区：氢、氘灯。发射185～400 nm的连续光谱。

36 2.单色器 将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。 ①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；
②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； ③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅； ④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝； ⑤出射狭缝。

37 3. 样品室 样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。 4. 检测器 利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。 5. 结果显示记录系统 检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理

38 分光光度计类型 1.单光束 简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。 2.双光束 自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。

39 3.双波长 将不同波长的两束单色光(λ1、λ2) 快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。△=1～2nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。

40 普通分光光度分析方法 1.单组分的测定 通常采用 A-C 标准曲线法定量测定。 2.多组分的同时测定
⑴ 若各组分的吸收曲线互不重叠，则可在各自最大吸收波长处分别进行测定。这本质上与单组分测定没有区别。 ⑵ 若各组分的吸收曲线互有重叠，则可根据吸光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量。 Aλ1= εaλ1bca ＋ εbλ1bcb Aλ2= εaλ2bca ＋ εbλ2bcb

41 ΔＡ＝Ａx －Ａs =εb(cx － cs ）=εbΔc
示差分光光度法 普通分光光度法一般只适于测定微量组分，当待测组分含量较高时，将产生较大的误差。需采用示差法。即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。 设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为cs(cs < cx)。则： Ax= εb cx As = εb cs ΔＡ＝Ａx －Ａs =εb(cx － cs ）=εbΔc 测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差ΔＡ。

42 示差法测得的吸光度与Δc呈直线关系。由标准曲线上查得相应的Δc值，则待测溶液浓度cx ：
cx = cs + Δc

43 示差法标尺扩展原理 普通法： cs的T=10%；cx的T=5% 示差法： cs 做参比，调T=100%

44 双波长法 不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束单色光(λ1和λ2)；以参比波长λ1处的吸光度Aλ1作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。 ΔA ＝Aλ2 －Aλ1 ＝ (ελ2 －ελ1)b c 两波长处测得的吸光度差值ΔA与待测组分浓度成正比。ελ1和ελ2分别表示待测组分在λ1和λ2处的摩尔吸光系数。

45 关键问题: 测量波长λ2和参比波长λ1的选择与组合 以两组分x和y的双波长法测定为例：
ΔAx和ΔAy，则该体系的总吸光度差ΔAx+y为： ΔAx+y = ΔA x + ΔA y 如何选择波长λ1 、λ2有一定的要求。

46 选择波长组合λ1 、λ2的基本要求是： ⑴选定的波长λ1和λ2处干扰组分应具有相同吸光度，即： ΔAy = ΔA yλ2 － ΔA yλ1 = 0 故： ΔAx+y = ΔA x=(εxλ2－εxλ1)bcx 此时：测得的吸光度差ΔA只与待测组分x的浓度呈线性关系，而与干扰组分y无关。若x为干扰组分，则也可用同样的方法测定y组分。 ⑵在选定的两个波长λ1和λ2处待测组分的吸光度应具有足够大的差值。 可采用作图法选择符合上述两个条件的波长组合。

47 导数分光光度法 导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、消除背景干扰、加强光谱的精细结构以及复杂光谱的辨析等方面，显示了很大的优越性。
利用吸光度(或透光度)对波长的导数曲线来进行分析： Ｉ＝Ｉ0 e-εbc 假定入射光强度Ｉ0 在整个波长范围内保持恒定： dI 0 /dλ＝0 则：dI/dλ＝－Ｉ0 bc e -εbc dε/dλ ＝－Ｉ0 bc dε/dλ

48 dI/dλ ＝－Ｉ0 bc dε/dλ 一阶导数信号与试样浓度呈线性关系； 测定灵敏度依赖于摩尔吸光系数对波长的变化率dε/dλ。吸收曲线的拐点处dε/dλ最大，故其灵敏度最高(见图）。 同理可以导出其二阶和三阶导数光谱（略）

49 紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定、结构分析。
紫外-可见吸收光谱的应用 紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定、结构分析。 1.定性分析 每一种化合物都有自己的特征光谱。测出未知物的吸收光谱，原则上可以对该未知物作出定性鉴定，但对复杂化合物的定性分析有一定的困难。

50 2.纯度的鉴定 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便的。 如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用A280/A260的比值，鉴定其纯度。 3.结构分析 紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。 例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明该物质无共轭结构和芳香结构。