第十五章 分子遗传学研究技术 —基因工程技术.

Presentation on theme: "第十五章 分子遗传学研究技术 —基因工程技术."— Presentation transcript:

1 第十五章 分子遗传学研究技术 —基因工程技术

2 基因工程基本流程

3

4

5

6

7

8 第Ⅰ部分 基因工程技术绪论

9 第一节 基因工程技术诞生的理论基础 一.确定了遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质。明确了遗传的物质基础问题 1. 肺炎双球菌转化实验 1944年 Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。 2. 噬菌体转染实验 1952年Alfred Hershy和Marsha Chase进一步证明遗传物质是DNA

10 二.揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递的问题。
1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。

11 三.提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题
1958年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则”

12 1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等终于破译了64个遗传密码
F.Jacob和J.Monod在1961年提出了操纵子学说

13 第二节 基因工程技术诞生的技术基础 DNA分子的体外切割与连接 1.限制性内切酶（restriction enzymes）
Werner Arber 理论预见限制酶 1968年H.O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶 Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断 3人于1978年获得Nobel生理或医学奖 2. DNA连接酶（ligase） 1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶

14 二. DNA分子的核苷酸序列分析 1975年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert发明了DNA快速测序技术, 年Nobel化学奖 三.载体的构建 1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增 四.转化技术 1970年M. Mandel和A. Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S. Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA

15 五.琼脂糖凝胶电泳和southern转移杂交技术
1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开;DNA印迹技术由Southern于1975创建,称为Southern印迹技术

16 第三节 基因工程发展史上的某些重要事件 1869年，F.Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离到DNA 1944年，O.T.Avery等人在肺炎链球菌转化实验中发现遗传信息的携带者是DNA，而不是蛋白质 1952年， A.D. Hershey和M.Chase 再次证明T2噬菌体的遗传物质是DNA 1953年，J.D.Watson和F.H.C.Crick 提出双螺旋结构模型 1958年, Meselson米西尔森和Stanl斯坦尔提出了DNA半保留复制模型 1961年，马太(Matthaei)和尼伦伯格(Nirenberg)破译了第一批密码子， F.Jacob和J.Monod提出了操纵子模型

17 1962年，Arber等人发现限制性内切酶 1968年, Smith和wilcox在流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性内切酶Hind III 年，发现了DNA连接酶，建立了DNA序列分析方法 1972年，得到了第一个重组的DNA分子 1973年，完成了第一个细菌基因的克隆 1974年，首次实现了异源真核生物的基因在大肠杆菌中的转化 1978年，用大肠杆菌表达人工合成的人脑激素和人胰岛素 1981年，成功获得了第一个转基因小鼠，培育出转基因果蝇

18 1982年，第一个由基因工程菌生产的药物:胰岛素
1983年，第一个转基因植物培育成功 1986年，基因工程生物在控制的情况下，实验性地释放到环境中 1988年，开始人类基因计划 1994年，基因工程西红柿在美国上市 2000年，人和拟南芥测序完成

19 第四节 基因工程的定义及其主要的研究内容 一.基因工程的诞生 1. Berg的开创性实验 1972年斯坦福大学的Paul Berg小组完成了首次体外重组实验：将SV40的DNA片断与噬菌体的DNA片断连接起来(用DNA末端转移酶，而非限制性内切酶)。

20 2. Boyer-Cohen实验 1973年斯坦福大学的S. Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。 后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。

21 Boyer-Cohen实验

22 Herb Boyer Stanley Cohen 1986 Nobel生理或医学奖

23 二.基因工程的定义和特征 定义 在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构建遗传物质的新组合，并使之渗入到原先没有这类分子的寄生细胞内，而能持续稳定地繁殖 在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物

24 2.特征 (1)按照人们的主观愿望进行设计 (2)跨越物种屏障 外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖 (3)无性扩增 外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达

25 3.基因工程（gene engineering）相关的概念：
基因操作（gene manipulation）， 重组DNA技术（recombinant DNA technique）， 基因克隆（gene cloning）， 分子克隆（molecular cloning）

26 4. Clone(名词)：是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子细胞或个体所组成的特殊的生命群体

27 5.研究内容 (1)目的基因的获取 从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断 (2)重组体的制备 将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上

28 (3)重组体的转化 将重组体（载体）转入适当的受体细胞中 (4)克隆鉴定 挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因） (5)目的基因表达 使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物

29 第五节 基因工程的安全性 1996年美国国立卫生研究院公布了“重组DNA研究准则” 在实验室安全防护方面，明确规定了物理防护和生物防护两个方面的统一标准。物理防护为P1——P4四个等级，生物防护则分为EK1——EK3三个不同的等级

30 1.实验室的物理安全 P1——P4是关于基因工程实验室物理安全防护上的装备规定。P1级实验室为一般的装备良好的普通微生物实验室； P2级实验室，在P1级实验室的基础上，还需装备负压的安全操作柜； P3级实验室，即全负压的实验室，同时还要装备安全操作柜；P4级实验室是具有最高安全防护措施的实验室，要求建设专用的实验大楼，周围与其它建筑物之间应留有一定距离的隔离带，细菌操作带手套进行，以及使用其他必要的隔离装置，使研究者不会直接同细菌接触。 P=Protect

31 2.实验室的生物安全 生物防护方面，EK1——EK3级是专门针对大肠杆菌而规定的安全防护标准。它是依据大肠杆菌在自然环境中的存活率为前提制定的。EK1级大肠杆菌菌株，在自然环境中一般都要死亡。而符合2-3级标准的大肠杆菌菌株，在自然环境中则是无法存活的。 第一个安全的大肠杆菌是K12菌株，由于不适用于操作，目前广泛应用的是K12的派生菌株。

32 3.载体的安全 应该是失去了自我迁移的能力 ，不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌株中。

33 二. 实验操作的安全性 注意有毒生物对人的危害！！！！ 注意有毒试剂对人的危害！！！！

34 三. 基因工程产物或产品的安全性 转基因作物对生态环境可能的影响，如产生超级杂草 具有除草剂耐性因子的转基因作物的遗传因子可能通过授粉和种子迁移传播给野生植物。获得这些耐性后的野生植物有可能会变成对一般除草剂有耐性的“超级”杂草。为了清除这些杂草，将不得不使用更强大的，浓度更大的除草剂，这必然会引起土壤板结、土质变坏、药物残留等，从而对生态环境造成破坏。

35 2. 标记基因的传递可能引起的抗生素耐性 基因工程技术中应用的标记基因通常是一类抗生素基因，人们担心食用含有此类标记基因的食品后，是否对肠道微生物产生影响或者抗生素类药物产生耐药性。 3. 转基因食品引起的食物过敏的可能性 转基因食品引起食物过敏的可能性是人们关注的焦点之一。特别是如果转基因食品转入的蛋白质是新蛋白时，这些异种蛋白有可能引起食物过敏。

36 4. 毒性方面，如蛋白酶抑制剂，溶血剂，神经毒素
许多食品原料生物本身会产生大量的毒性物质，如蛋白酶抑制剂、溶血剂和神经毒素等，那么转基因作物中是否有毒素以及毒素的含量就成为争议的重要内容之一 5. 伦理方面 许多民族都有其独特的饮食习惯和制约，某些宗教团体禁止食用的动物基因转入他们通常食用的动物中（如将猪的基因转入绵羊中），这可能触犯某些民族的饮食戒律；另外将动物基因转入植物中可能使素食者感到困惑。

37 6. 其他 除以上争论外，对转基因食品安全性的争议还表现在微生物作为宿主细胞的安全性问题，转基因动物激素、食品、饲料添加剂等对动物本身的生长、发育和繁殖的安全性问题等方面。 　　基于上述诸多方面的异议，转基因食品的安全性问题的研究成为转基因技术研究的一个热点。

38 所以关于GMO（genetic modified origanism）的争论主要集中于安全性，宗教，贸易

39 四.转基因生物安全性评价 对转基因生物安全评价主要集中在环境安全性和食用安全性两个方面。 1.环境安全性评价 环境安全性评价的核心问题是转基因生物是否会将所转基因再转移到其它生物中，会不会破坏生态环境，打破原有生物种群的动态平衡，

40 包括： ①转基因作物本身成为杂草的可能性； ②转基因作物便亲缘野生种成为杂草或超级杂草的可能性； ③转基因作物可能产生新的病毒或疾病； ④转基因作物对非目标生物的危害； ⑤转基因作物作为外来种对新环境的入侵，使生物多样性受到威胁； ⑥转基因作物对生态系统及生态过程的影响； ⑦其他一些不可预计的风险。

41 2.食用安全性评价 食用安全性，主要包括营养成分、抗营养因、毒性和致敏性等。目前普遍公认的食用安全性评价的原则是经合组织（OECD）1993年提出的“实质等同性”（Substantial equivalence）原则。

42 （1）实质等同性原则 实质等同性原则最早由国际经济互助开发组织于1993年提出并已被大多数国家采用。该原则认为如果导入基因后产生的蛋白质经确认是安全的，或者是转基因作物和原作物在主要营养成分（脂肪、蛋白质、碳水化合物等）、形态和是否产生抗营养因子、毒性物质、过敏性蛋白等方面没有发生特殊的变化的话，则可以认为转基因作物在安全性上和原作物是同等的，对人类的影响是相似的，则无需对它的安全性再作进一步的分析。

43 根据“实质等同性”原则，转基因食品安全性分成三个等级：
I级，转基因食品成分、营养价值、体内代谢途径、杂质水平和传统食品相同，或变异在已知的范围内，这类食品无需做进一步的分析评价； Ⅱ级，与传统食品极其相似，但产生或缺少某个新成分或特性，对不同成分或特性应作进一步的分析评价； Ⅲ级，与传统食品既不相同也不相似，需要作广泛的营养学和毒理学评价。

44 （2）转基因食品的食用安全性 转基因食品与相应的传统食品相比，至少存在以下两个不同点：一是转基因食品中含有利用转基因技术导入的外源基因，而传统的食品中不含有；二是由于外源基因的表达使转基因食品中含有了特定的外源基因表达产物(相应的蛋白质）。

45 A.外源基因的毒性及其水平转移问题 转基因食品中外源基因含量很小，其化学组成与普通DNA并无差异。通过食用转基因食品而摄入体内的外源基因的数量与消化道中来源于其他食品中的DNA数量相比微不足道。因此，转基因食品中的外源基因本身不会对人体产生直接毒害作用。

46 转基因食品中的外源基因特别是抗生素抗性基因（Antibiotic resistance gene）被摄入人体后，水平转移（Horizontal gene transfer）至肠道生物或上皮细胞，从而对人体产生不利影响的可能性非常小，“消无基因从植物转移到肠道做生物的证据”，也没有在人类消化系统中细菌转化的报道。转基因食品中的卡那霉素、新霉素和潮霉素对人类不存在抗生素医疗安全性的问题。

47 B.外源基因编码蛋白的毒性与过敏性问题 评判转基因食品中外源基因编码蛋白的食用安全性的评定，一是根据外源基因编码蛋白的化学组成判断其毒性，二是采用动物试验或模拟试验的方法评判外源基因编码蛋白的毒性。由于各国政府对转基因食品的审批程序中，对外源基因编码蛋白的毒性评价都有严格的标准，因此通过严格审查后被批准商业化生产的转基因食品中的外源基因编码蛋白对人体均无直接毒性

48 C.外源基因的次生效应及其安全性问题 外源基因的次生效应是指由于外源基因的插入而对宿主体内某些基因的表达所产生的影响，现还无法对外源基因的次生效应进行控制和预测。对外源基因的次生效应可能对转基因食品食用安全性产生的影响，一般采用“实质等同性”原则和个案分析程序（case－by－case procedure）进行评价分析

49 结论： 对动、植物进行负责任的遗传修饰或使用转基因技术在实质上既不新也不会有危害性。传统的遗传育种与转基因技术相比缺乏灵活性和精确性，并因此而缺乏可预期性，其风险绝不比转基因技术低。 夸大转基因食品的潜在危险性，缺乏研究依据的推测，可能会使消费者对食品安全产生认识混乱，从而在根本上阻碍转基因技术的发展

50 第六节 基因工程的应用 一 理论应用：分析基因的结构与功能 二 基因工程实际应用 1 基因工程与医药卫生 目前，基因工程在医药卫生领域的应用非常广泛，主要包括以下两个方面 ： （1）生产基因工程药品 如胰岛素、干扰素和乙肝疫苗等。基因工程药品是制药工业上的重大突破。

51 如1克胰岛素（h-Insulin）要从7.5公斤新鲜猪或牛胰脏组织中提取得到，而目前世界上糖尿病患者有6000万人，每人每年约需1克胰岛素，这样总计需从45亿公斤新鲜胰脏中提取,利用基因工程的"工程菌"生产1克胰岛素，只需20升发酵液。 生长激素释放因子“SRIH”的动物激素（一种十四肽，能抑制其他激素的释放和治疗糖尿病等），它原来要从羊的脑下垂体中提取，宰50万头羊也只能提取5mg的产品，而现在只要用10L发酵液就可获得同样的产量。

52 美国已批准上市的基因工程药物（1997.7） 商品名称 英文名缩写 开发公司 胰岛素 Humulin Novolin Humalog
Insulin lispoinsulin Lilly Novo Nordisk 人生长激素 Protropin Humatrope NutropinAQ rhuGH Genentech 干扰素 IntronA ReferonA Avonix Betaseron Actimmune Alferon-N rhuIFNa2b rhuIFNa2a rhuIFN rhuIFN1b rhuIFN1b rhuIFNa3 Schering Roche Biogen Chiron Interferon Science

53 白细胞介素2 Proleukin rhuIL2 Chiron 粒细胞集落刺激因子 Neupogen rhuG-CSF Amgen
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 Leukine rhuGM-GSF Immunex 红细胞生成素 Epogen Procrit rhuEPO Ortho 组织溶纤原激活剂 Activase rhuTPA Genentech 生长激素 Serostin somatotropin Serono 促生长素 Nutropin Saizen Genotropin Norditropin Bio-Tropin somatopin Pharma/Upjohn Novo Nordisk Biotech General

54 Kogenate Recombinate Factor VIII Bayer Baxter 葡萄脑苷脂酶 Cerezyme glucocerebrosidase Genzyml 脱氧核糖核酸酶 Pulmozyme domase Genentech 乙型肝炎疫苗 RecombivaxHB Engerix B Comrax Hepatitis B vaccine Merck Smith Kline 甲型肝炎疫苗 Havrix

55 体内用单克隆抗体 Reopro Ortho OKT-3 Onco Scint CR/OV Onco Scint OC103 Onco Scint CR103 Prostascint MAB,blood clots MAB,Kidney sup MAB,diag inject Centocor Ortho Biotech Cytogen 鼠单克隆抗体 Panorex Murine MAB Glaxo Welcome

56 中国已经批准上市的基因工程药物（1998.5） 药品名缩写 开发生产公司 批准时间 适应症 rhuINFa1b(外用） rhuINFa1b
rhuINFa2a 长春生研所 上海生研所 深圳兴科 长生药业 三生药业 1989试 1996正 1997正 病毒性角膜炎 HBV,HCV 尖锐湿疣，疱疹等 rhuIFNa2b 新大洲药业 里亚哈尔 华立达 安科 华新 1997试1997试

57 rhuINF 上海生研所 克隆 丽珠生物工程 1994试 1995试 类风湿 rhuIL2 长春生研所 长春药业 四环制药 华新 三生药业 深圳兴科 中华合通 金丝利 康利制药 1997正 癌辅助治疗

58 rhuG-CSF 九源 1997试 化疗生白血病 rhuGM-CSF 特宝 rSK 医大实业 1996试 心梗溶栓 rhuEPO 华欣 永铭维沃 再生障碍性贫血 bFGF（外用） 珠海东大 创伤，烧伤

59 美、日、德、中医药品和基因工程药品市场(亿美元)
国别 医药品市场 基因工程药品市场 基因工程药品占医药品市场% 美国 884 80 9.0 日本 610 29 4.8 德国 220 19.5 8.9 中国 120 1.2 1.0

60 药 物 适应症 销售额(亿美元) EPO 贫血 35 GH 生长障碍 30 G-CSF 中性粒细胞减少症，白血病，艾滋病 16.5 人胰岛素
2000年世界上具有10亿～35亿美元年销售额的基因工程药物 药 物 适应症 销售额(亿美元) EPO 贫血 35 GH 生长障碍 30 G-CSF 中性粒细胞减少症，白血病，艾滋病 16.5 人胰岛素 糖尿病 15 IFN-α 癌症，丙肝 10～20

61 分 类 天然生化药物 基因工程药物 蛋白质，多肽 16 66 酶及酶抑制剂 5 18 动物毒素 3 单 抗 可溶性受体 4 融合蛋白 17
我国生物技术药物研究品种统计表 　分　类 天然生化药物 基因工程药物 蛋白质，多肽 16 66 酶及酶抑制剂 5 18 动物毒素 3 单　抗 可溶性受体 4 融合蛋白 17 治疗基因 多　糖 8 其　他 2 小　计 34 120

62 （2）用于基因诊断与基因治疗 基因工程技术还可以直接用于基因的诊断和治疗。目前用基因诊断方法已经能够检测出肠道病毒、单纯疱疹病毒等许多种病毒。 基因治疗是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的，如恶性肿瘤、艾滋病、心血管疾病，以及糖尿病等，也都可以被人类征服

63 3 基因工程与农业、食品工业 （1）培育高产、优质或具有特殊用途的动植物、微生物新品种 （2）培育各种抗逆性的作物新品种 （3）为人类开辟新的食物来源

64

65 21个种植生物技术作物的国家包括11个发展中国家和10个工业化国家。按种植面积的大小顺序排列，它们分别是美国、阿根廷、巴西、加拿大、中国、巴拉圭、印度、南非、乌拉圭、澳大利亚、墨西哥、罗马尼亚、菲律宾、西班牙、哥伦比亚、伊朗、洪都拉斯、葡萄牙、德国、法国和捷克共和国。

66 2003年，全球转基因大豆的种植面积是4140万公顷，占转基因作物种植总面积的61%；转基因玉米的种植面积为1550万公顷，占总面积的23%；转基因棉花的种植面积为720万公顷，占11%；转基因油菜的种植面积为360万公顷，占5%。

67 2003年，全球大豆种植面积为7600万公顷，其中转基因大豆占55%。棉花种植面积为3400万公顷，其中转基因棉花占21%。油菜种植面积为2200万公顷，转基因油菜占16%。玉米种植总面积为1.4亿公顷，转基因玉米占11%。 大部分转基因作物都带有抗病虫害的基因。大约18%的转基因玉米带有抵御害虫的基因，73%的转基因大豆、玉米和油菜能够抵御除草剂。其余的种类则同时含有这两种基因。

68 转基因作物目前主要种植在美国、阿根廷、加拿大、中国、巴西和南非。在全球转基因作物种植面积中，美国占63%，阿根廷占21%，加拿大占6%，中国和巴西各占4%，南非占1%。
2003年，这些国家的转基因作物种植面积占全球种植面积的99%。

69 4 基因工程与环境保护 （1）环境监测 （2）被污染环境的净化