同工酶 一、CK与其同工酶 二、LDH与其同工酶.

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1 同工酶 一、CK与其同工酶 二、LDH与其同工酶

2 骨骼肌细胞和心肌细胞中，也存在于脑和其它组织细胞。
急性心肌梗死的酶类标志物 一．肌酸激酶 （ CK ） 分布 骨骼肌细胞和心肌细胞中，也存在于脑和其它组织细胞。 亚类 由M和B亚基组成的二聚体，有三种同工酶： CK-MM，CK-BB ， CK-MB 。 CK-MB1和CK-MB2 CK-MM1、CK-MM2和CK-MM3

3 CK-MM1>CK-MM2>CK-MM3，CK-MB1>CK-MB2。
正常血清中各亚型的含量 CK-MM1>CK-MM2>CK-MM3，CK-MB1>CK-MB2。 AMI时 组织型的MM3和MB2大量释放入血，CK-MM3/CK-MM1和CK-MB2/CK-MB1 比值超过1.0，此变化明显早于CK和CK-MB的升高。CK-MB2/CK-MB1在AMI 发病后1小时达到峰值，CK-MM3/CK-MM1在3小时达到峰值。显然CK亚型分 析在诊断AMI的特异性和灵敏度方面优于CK总酶和同工酶。

4 二．乳酸脱氢酶 （ LDH ） 亚类 LDH是由两个亚基（H和M）组成的四聚体， 分布 心肌细胞中主要的LDH为LDH1。
五种同工酶，按电泳速度的快慢命名为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4和LDH5 分布 心肌细胞中主要的LDH为LDH1。 对于可疑的心肌梗死病人：。 测定总LDH和α-羟丁酸脱氢酶（HBDH） HBDH是指用酮丁酸取代丙酮酸作为底物时测得的LDH活性，LDH1和LDH2比其它同工酶对酮丁酸有更大的活性，因此HBDH活性相当于LDH1和LDH2。在诊断AMI时，HBDH的特异性高于LDH总活性，但不及LDH1同工酶 。

5 三、心肌酶的测定 1．方法学及其发展：经过三个阶段： ①二十世纪五十年代以前大都使用“固定时间法”
②二十世纪五十年代中期，生化分析仪的广泛使用，临床实验室开始采用 “连续监测法 ③从二十世纪七十年代以来，随着免疫技术的发展，出现利用酶的抗原性 ，通过抗原抗体反应直接测定酶质量的方法

6 酶活性的测定 测定方法分类： 按照仪器检测方法分类：分光光度法、浊度法、荧光法、 放射性核素法、电位滴定法、电极法、量气法。
按照反应时间分类；分为定时法、连续监测法和平衡法。 按照检测对象分类：分为直接法和间接法。

7 一、按照反应时间分类的酶活性测定方法 （一）定时法 原理：
吸光度A t t2 　　时间t 　　　图5-6　定时法的三种反应进程 2 3 1 一、按照反应时间分类的酶活性测定方法 （一）定时法 原理： 定时法是固定时间法的简称，是指测定反应开始后一段时间（t1～t2）产物的增加量或底物的减少量以测定酶活性的方法。该方法一般需要在反应进行到一定时间后用强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止反应。 特点： 优点：简单，因为最后测定时酶促反应已被终止，故比色时不需要保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。 缺点：如果不做预试验则无法了解其酶促反应进程（t1-t2）是否为零级反应，故难以确保测定结果的准确性。 定时法与两点法、终点法的区别

8 （二）连续监测法 原理： 连续监测法是指在多个时间点连续测定产物（或底物）在线性期内的生成量（或消耗量）即零级反应速率以测定酶活性的方法，又称速率法、零级反应速率法、斜率法。 该方法是在一定的反应时间区段内（至少9～120s）每隔一定时间（常为2～30s）读取一次吸光度值，连续测定多点（至少4点），然后对吸光度数据作最小二乘法处理，再用线性期内的数据计算单位时间内的反应速率△A/min，最后据式5.7等计算出酶活性。 （5.7）

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10 特点： 与定时法相比，属于即时观测，无需停止酶促反应、不需添加其他呈色试剂，且可将多点的测定结果绘图连线，快速、直观查看酶促反应进程，很容易找到呈直线的线性期，检查到是否偏离零级反应； 连续监测法要求不显色而是直接测定底物（或辅助底物即中间底物）或产物量的变化，因此，在测定原理上，可以选择紫外吸收法或生色原显色法； 要求能够准确地控制温度、pH值和底物浓度等，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及全自动生化分析仪都能满足这些要求 ； 测定结果常较定时法高，因为在酶促反应初始阶段底物最充裕，而产物的抑制作用、可逆反应、酶变性等均很小，所以反应后期的吸光度等检测信号就比定时法要高且真实，因而测定结果也较定时法准确。

11 二、按照检测对象分类的酶活性测定方法 （一）直接法 指直接测定酶促反应产物或底物的理化指标以测定酶活性的方法。 测定NAD（P）H的方法 测定人工合成的色素原底物的方法 测定耗氧量的方法 测定pH改变的方法 等

12 1．测定NAD（P）H的方法 原理：监测340nm吸光度的变化可以反映NAD（P）H量的变化，其变化与待测酶的含量正相关。 对象：以NAD（P）+或NAD（P）H为辅酶的脱氢酶类。例如LD、G-6-PD、GLDH等 。

13 2．测定人工合成的色素原底物的方法 原理： 一些水解酶类或转移酶类通过酶促反应后，其化合物中的某一基团被水解或转移，使无色的底物转变为有色的产物，这类底物称为色素原底物。根据这一原理，可以人为地合成一系列底物即人工合成的色素原底物后测定酶活性。 底物和测定对象： 人工合成的色素原底物 待测酶 产物的毫摩尔吸光系数 对硝基苯酚磷酸二钠盐（PNPP-Na2） ALP 对硝基酚（PNP）（405nm，pH10.3）18.5 L-γ-谷氨酰-3-羧基对硝基苯胺 GGT 2-硝基-5-氨基苯甲酸 （405nm，pH8.1）9.49 2-氯-硝基酚-α-半乳糖-麦芽糖苷 AMS 2-氯酚（2-CP）（405nm，pH6.0）6.1 2-氯-硝基酚-α-岩藻糖苷 α-岩藻糖苷酶（AFU） 2-CP（405nm，pH6.5）6.2

14 （二）间接法 是指加入相应试剂后间接测定酶促反应的产物转化物或 底物转化物的理化指标以测定酶活性的方法。 酶偶联法 化学法

15 1．酶偶联法 原理：在测定待测酶Ex的活性时，常采用偶联一个工具酶（指示酶Ei）或几个工具酶（辅助酶Ea和指示酶Ei）将待测酶的某一产物转化为新的产物，反应速率达到平衡时，测定指示酶的反应速率来代表待测酶的活性。反应模式可简化为： [A]》Kmx [B]《Kma 零级反应 一级反应 一级反应 Ex、Ea、Ei这一连串酶促反应称为酶偶联体系 指示酶的反应系统： 以NAD（P）+或NAD（P）H为辅酶的脱氢酶类作为指示酶，监测其反应物NAD（P）H于340nm处紫外吸收或在紫外激发光365nm波长照射下，其在460nm发射强烈荧光的变化速率的测定系统 ； 是偶联过氧化氢（H2O2）以过氧化物酶（POD）为指示酶的测定系统。 Trinder反应：

16 表5-4 一些酶偶联法的待测酶与工具酶 待测酶 辅助酶 指示酶 指示系统 ALT 无 LD NAD(P)H AST LD*
　表5-4 一些酶偶联法的待测酶与工具酶 待测酶 辅助酶 指示酶 指示系统 ALT 无 LD NAD(P)H AST LD* LD、苹果酸脱氢酶（MD） CK HK G6PD 5‘-核苷酸酶（5‘-NT） 腺苷脱氨酶（ADA） GLDH LPS 共脂酶、甘油激酶（GK）、GPO POD H2O2 * LD：消除内源性丙酮酸的干扰。

17 2．化学法 化学法是在反应体系中加入一些与酶促反应无关同时也不影响酶活性的试剂，这些试剂只和酶反应物（一般是产物）迅速作用，产生信号变化。 ChE 丁酰硫代胆碱 硫代胆碱（SCh） 硫代胆碱（SCh）+ 5，5‘-二硫代-双（2-硝基苯甲酸） 5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-TNBA） （黄色）

18 第四节 代谢物的酶法测定 第五节 同工酶测定 了解 三、工具酶的应用 四、酶活性测定的影响因素
第四节 代谢物的酶法测定 葡萄糖、甘油三酯、胆固醇、胆红素、尿酸、尿素、乙醇、胆汁酸等等，也可以用来测定无机离子和微量元素如钾、钠、氯、碳酸氢根。 一、终点法 　　（一）原理 　　终点法是指将样本中代谢物即待测底物与工具酶保温一定时间后，全部转变为可检测的产物，以产物量来计算代谢物浓度的方法。 二、速率法 速率法不要求将代谢物或辅助底物完全转变为可检测的物质，而是利用工具酶的一级反应速率或零级反应速率来测定其浓度。不需做样本空白，但需要设校准管用对比法测定。 第五节 同工酶测定

19 标本在采集、分离和贮存等过程可能会影响酶的活性。
2．标本的处理对结果的影响 标本在采集、分离和贮存等过程可能会影响酶的活性。 压脉带使用时间过长 溶血可引起LDH明显增高 采血后1～2小时及时分离血清。 心肌酶在体外随存放时间和温度其活性产生变化 酶 室温（25℃） 冰箱（0～4℃） 冰冻（－25℃） AST 3天 1周 1月 CK LDH 1～3天 表15-2 心肌酶在不同温度储存的稳定性（活性变化小于10％）

20 LDH1 14%～26%；LDH2 29%～39%；LDH3 20%～26%；
四、参考范围及临床意义 1.乳酸脱氢酶及其同工酶 【参考范围】 LDH：成人120～230U/L(L→P法) 儿童140～260U/L(L→P法) LDH同工酶（成人）： LDH1 14%～26%；LDH2 29%～39%；LDH3 20%～26%； LDH5 6%～16%；LDH1/LDH %～0.74% LDH4 8%～16%；

21 【临床意义】 LDH增高主要见于急性心肌损伤，还见于肝炎、传染性单核细胞增多症、胰腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、贫血、骨骼肌损伤、及肝硬化等。LDH降低无临床意义。LDH同工酶对于AMI发生24小时之后的诊断有帮助，心肌梗死后10～12小时LDH1升高，高峰时间为48～72小时。心肌梗死时LDH同工酶分析，LDH1/LDH2的比值分析有重要临床意义，一般情况下LDH1/LDH2小于1，当LDH1/LDH2大于1时，对诊断心肌梗死具有重要价值。

22 CK：男性45～180U/L 女性25～130U/L 儿童75～540U/L
2．肌酸激酶及其同工酶 【参考范围】 CK：男性45～180U/L 女性25～130U/L 儿童75～540U/L CK-MB：10～25 U/L或CK-MB/CK<5%(免疫抑制法) 【临床意义】 CK增高：见于心肌损伤剧烈运动、妊娠、肌肉注射、心脏外科手术、治疗性电 休克、心脏导管插入术、冠状动脉造影术、整形外科手术、腹腔手术、进行性 肌营养不良、多发性肌炎及脑血管意外等 CK-MB增高见于心肌损伤和心肌梗死 CK降低主要见于恶病质及神经性肌萎缩。

23 3.CK-MB质量 【临床意义】 CK-MB为CK的同工酶，主要存在于心肌细胞中。CK-MB质量指用
被CK-MB质量测定所代替。在AMI发生后3～8小时即可在血中检测到 CK-MB升高，9～30小时可达峰值，血中维持升高2～3天。CK-MB的 正常参考范围依试剂的不同而不同。 【临床意义】