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第十三章 程序性细胞死亡与细胞衰老 第一节 程序性细胞死亡 第二节 细胞衰老 作业.

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1 第十三章 程序性细胞死亡与细胞衰老 第一节 程序性细胞死亡 第二节 细胞衰老 作业

2 第一节 程序性细胞死亡 ●Hayflick界限(Hayflick Limitation) ●细胞在体内条件下的衰老 ●衰老细胞结构的变化
第一节 程序性细胞死亡 衰老(aging,senescence,senility)又称老化,通常指生物发育成熟后,在正常情况下随着年龄的增加,机能减退,内环境稳定性下降,结构中心组分退行性变化,趋向死亡的不可逆的现象。 衰老和死亡是生命的基本现象,衰老过程发生在生物界的整体水平、种群水平、个体水平、细胞水平以及分子水平等不同的层次。 ●Hayflick界限(Hayflick Limitation) ●细胞在体内条件下的衰老 ●衰老细胞结构的变化 ●细胞衰老的分子机理

3 一、Hayflick界限(Hayflick Limitation)
●概念:关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。 细胞,至少是培养的二倍体细胞,不是不死的,而是有一定的 寿命;它们的增殖能力不是无限的,而是有一定的界限,这就 是 Hayflick界限 ◆癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞,其染色体数目或形态 已经不同于原先的细胞 ◆细胞的增殖能力与供体年龄有关 ◆物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系 ●二倍体细胞的衰老是由细胞本身决定的 ◆决定细胞衰老的因素在细胞内部,而不是外部的环境 ◆是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老

4 不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数 细胞来源 人胚胎成纤维细胞 中年人成 纤维细胞 老年人成 可增殖 代数 40-60 20 2-4

5 二、细胞在体内条件下的衰老 ●在机体内,细胞的衰老和死亡是常见的现象,甚至在 个体发育的早期也会发生;
●正常情况下终生保持分裂的细胞,其分裂能力是否随 着有机体年龄的增高而下降?它们 会不会衰老? ◆衰老动物体内,细胞分裂速度显著减慢,其原因主要 是G1期明显延长; ◆衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老; ◆骨髓干细胞移植实验说明随着年龄的增加,干细胞 增殖速度也趋缓慢.

6 三、衰老细胞结构的变化 ●内质网的变化:内质网成分弥散性地分散于核周胞质中,粗面内质网的总量似乎是减少了
●细胞核的变化:细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增大;细胞核的核膜内折(invagination);染色质固缩化 ●内质网的变化:内质网成分弥散性地分散于核周胞质中,粗面内质网的总量似乎是减少了 ●线粒体的变化:通常细胞中线粒体的数量随年龄的增大而减少,而其体积则随年龄的增大而增大 ●致密体的生成:细胞中致密体包括色素等的生成与积累,亦是 增多 ●膜系统的变化:其膜流动性降低、韧性减小;细胞间间隙连接和细胞膜内颗粒的分布也发生变化

7 细胞衰老的机理 关于衰老的机理具有许多不同的学说,概括起来主要有差错学派(Error theories)和遗传学派(Genetic /Programmed theories)两大类,前者强调衰老是由于细胞中的各种错误积累引起的,后者强调衰老是遗传决定的自然演进过程。 (一)差错学派 细胞衰老是各种细胞成分在受到内外环境的损伤作用后,因缺乏完善的修复,使“差错”积累,导致细胞衰老。根据对导致“差错”的主要因子和主导因子的认识不同,可分为不同的学说。 (二)遗传学派 认为衰老是遗传决定的自然演进过程,一切细胞均有内在的预定程序决定其寿命,而细胞寿命又决定种属寿命的差异,外部因素只能使细胞寿命在限定范围内变动

8 正常儿童(左)和婴幼儿早衰症患者(右)

9 1.代谢废物积累(waste product accumulation)
细胞代谢产物积累至一定量后会危害细胞,引起衰老,哺乳动物脂褐质的沉积是一个典型的例子,在细胞内沉积增多,阻碍细胞的物质交流和信号传递,最后导致细胞衰老。 2.大分子交联(cross linking) 过量的大分子交联是衰老的一个主要因素,如DNA交联和胶原胶联均可损害其功能,引起衰老。

10 3.自由基学说(free radical theories)
自由基含有未配对电子,具有高度反应活性,可引发链式自由基反应,引起DNA、蛋白质和脂类,尤其是多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty Acids,PUFA)等大分子物质变性和交联,损伤DNA、生物膜、重要的结构蛋白和功能蛋白,从而引起衰老各种现象的发生。 内源性氧自由基是人体自由基的主要来源,正常细胞内存在清除自由基的防御系统,包括酶系统和非酶系统,前者如:超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX),非酶系统有维生素E、醌类物质等电子受体。 过量表达SOD的转基因动物表现出寿命延长,但是剔除SOD基因的动物并未表现出衰老

11 1.程序性衰老(programmed senescence)
程序性衰老理论认为,生物的生长、发育、衰老和死亡都由基因程序控制的,衰老实际上是某些基因依次开启或关闭的结果。 2.长寿基因(longevity genes) 线虫中age1基因 酵母中clk1基因

12 3.复制性衰老(replicative senescence)
细胞增殖次数与端粒DNA长度有关。 细胞DNA每复制一次端粒就缩短一段,当缩短到一定程度至Hayflick点时,可能会启动DNA损伤检测点(DNA damage checkpoint),激活p53,引起p21表达,导致不可逆地退出细胞周期,走向衰亡。 端粒的长度还与端粒酶(telomerase)的活性有关,在精原细胞、干细胞和肿瘤细胞(如Hela细胞)中有较高的端粒酶活性,而正常体细胞中端粒酶的活性很低,呈抑制状态。

13 第二节 细胞衰老 一、细胞衰老的概念及生理意义 二、细胞衰老的形态学特征 三、细胞衰老的生化特征 四、诱导细胞衰老的因子 五、细胞衰老的检测 六、细胞衰老的分子调控机理 七、细胞衰老与坏死

14 细胞衰老的概念及生理意义 细胞凋亡:是一个由基因决定的自动结束细胞生命的过程。 生理意义:
(1)确保组织器官正常发育、生长 :在机体的发育、生长过程中,凋亡可以清除多余的和失去功能的细胞,所以,在器官和组织形成中发挥了重要的作用。例如,在人胚胎肢芽发育过程中,通过凋亡使指间组织细胞通过凋亡被逐渐消除,形成指间。 (2)维持内环境稳定 :如果机体对受损、突变或者衰老的细胞不能及时清除话,就会干扰内环境稳定。例如,突变细胞不及时清除会导致肿瘤发生。 (3)发挥积极的防御功能 :例如,当细胞受到病毒感染时,受感染的细胞可以通过凋亡来阻止病毒的增殖,或通过 DNA 的降解,把病毒的 DNA 进行分解。

15 细胞衰老的形态学特征 衰老的起始:细胞表面的特化结构如微绒毛消失,细胞间接触的消失,但细胞膜依然完整,未失去选择通透性;线粒体大体完整,但核糖体逐渐从内质网上脱离,内质网囊腔膨胀,并逐渐与质膜融合;染色质固缩,形成新月形帽状结构等形态,沿着核膜分布 衰老小体的形成:核染色质断裂为大小不等的片段,与某 些细胞器如线粒体一起聚集,被反折的细胞质膜所包围,形成衰老小体,从外观上看,细胞表面发泡,产生了许多泡状或芽状突起,随后逐渐分隔,形成单个的凋亡小体 衰老小体逐渐为邻近的细胞或体内吞噬细胞所吞噬,凋亡细胞的残余物质被消化后重新利用

16 左图 典型凋亡小体:染色质呈新月状,并可见细胞器 
右图 凋亡细胞:凋亡细胞(↑)与邻近细胞分离

17 细胞衰老的生化特征 细胞凋亡的主要生化特征是形成由为180~200bpDNA片段或其整倍性片段组成特征性的DNA ladders ◆钙超载 ◆内源性核酸内切酶激活 ◆tTG(组织转氨酶)积累并达到较高水平

18 诱导细胞衰老的因子 物理性因子,包括射线(紫外线, 射线等),较温和的温度刺激(如热激,冷激)等
化学及生物因子:包括活性氧基团和分子,DNA和蛋白质合成的抑制剂,激素,细胞生长因子,肿瘤坏死因子(TNF),抗Fas/Apo-1/CD95抗体等

19 细胞衰老的检测 形态学观测:染色法、透射和扫描电镜观察 DNA电泳:DNA片段就呈现出梯状条带
TUNEL测定法,即DNA断裂的原位末端标记法 彗星电泳法(comet assay) 流式细胞分析 根据凋亡细胞DNA断裂和丢失,采用碘化丙啶使DNA产生激发荧光,用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞,同时又能观察细胞的周期状态。

20 细胞衰老的分子调控机理 Caspase家族与凋亡 非Caspase依赖性细胞凋亡:凋亡诱导因子(AIF);限制性核酸内切酶G(EndoG)

21 Caspase家族与衰老 Caspase:Cysteine aspartic acic specific protease,即天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶,活性位点是半胱氨酸(Cysteine),裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键 发现:线虫(C.elegans)凋亡研究发现ced3,ced4基因促进细胞凋亡,ced9基因阻止ced3/ced4的激活,抑制细胞凋亡。ced3哺乳类同源物是ICE(白介素- 1β转移酶),即Caspase1 在哺乳动物中相应同源物:ced3=ICE, ced4=apaf1, ced9=bcl、2 Caspase家族:Caspase自身以非活化的Procaspase存在,其激活依赖于其他的Caspase在它的天冬氨酸位点裂解活化或自身活化 Caspase依赖性细胞凋亡途径

22 英国人悉尼·布雷诺尔、美国人罗伯特·霍维茨和英国人约翰·苏尔斯顿
2002年诺贝尔生理与医学奖获得者

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26 级联反应路径 死亡底物的分配

27 细胞凋亡规律的图示 细胞收缩为膜泡

28 细胞凋亡抑制

29 轴突 由靶细胞释放的成活因子

30 a 正常T细胞杂交瘤细胞 b 凋亡细胞(扫描电镜) c 凋亡细胞(透射电镜)

31 caspase 超家族成员及其相应底物 凋亡起始者:Caspase-2,-8,-9,-10,-11 凋亡执行者:Caspase-3,6,7

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33 执行Caspase的底物 类 别 代 表 性 蛋 白 作 用 蛋白激酶 黏着斑激酶(FAK)、PKB、PKC、RAF1
类 别 代 表 性 蛋 白 作 用 蛋白激酶 黏着斑激酶(FAK)、PKB、PKC、RAF1 FAK失活,破坏细胞黏着,导致凋亡细胞与邻近细胞脱离 细胞支架 核纤层蛋白、中间丝、肌动蛋白、凝溶胶蛋白 被切割导致核纤层解体,细胞核收缩,细胞形态改变 核酸内切酶 Caspase激活的DNA酶(CAD) 抑制蛋白被切割后激活,导致核内DNA降解 参与DNA修复酶 PARP(聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶,poly(ADP-ribose polymerase) 被切割后失活,丧失修复活性,以便DNA降解

34 细胞核断裂;大泡形成;细胞碎裂 吞噬细胞吞噬 轻微缓慢卷折,使染色质紧缩 然后分离,细胞质浓缩 正常细胞 细胞凋亡的过程

35 细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图 1.细胞色素c诱导0 h 2.细胞色素c诱导1 h 3.细胞色素c诱导2 h 4.细胞色素c诱导3 h 5.细胞色素c诱导4 h 6.阴性对照 7.Marker ( 自赵允、翟中和)

36 TUNEL测定法

37 彗星电泳法

38 流式细胞分析

39 细胞凋亡与坏死(necrosis) 细胞坏死是细胞受到化学因素(如强酸、强碱、有毒物质)、物理因素(如热、辐射)和生物因素(如病原体)等环境因素的伤害,引起细胞死亡的现象。

40 细胞凋亡和细胞坏死的区别 区别点 细胞凋亡 细胞坏死 起因 生理性 病理性变化或剧烈损伤 范围 单个散在细胞 大片组织或成群细胞 细胞膜
保持完整,一直到形成凋亡小体 破损 染色质 凝聚在核膜下呈半月状 呈絮状、网状 细胞器 无明显变化 肿胀、内质网崩解 细胞体积 固缩变小 肿胀变大 凋亡小体 有,被邻近细胞或巨噬细胞吞噬 无,细胞自溶,残余碎片被巨噬细胞吞噬 基因组DNA 有控降解,电泳图谱呈梯状 随机降解,电泳图谱呈涂抹状 蛋白质合成 调节过程 受基因调控 被动进行 炎症反应 无,不释放细胞内容物 有,释放内容物。

41 细胞坏死  2 细胞和细胞器肿胀、核染色质边集  3 细胞膜、细胞器膜和核膜破裂、崩解、自溶 细胞凋亡  4 细胞和细胞器皱缩,胞质致密,核染色质边集 5 胞质分叶状突起并形成多个凋亡小体,并与胞体分离 6 邻近巨噬细胞等包裹、吞噬凋亡小体

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43 作业 一、名词解释 细胞衰老 细胞凋亡 Hayflick界限 二、简答题或论述题 1、细胞凋亡的概念、形态特征及其与坏死的区别是什么? 2、对于多细胞生物,细胞凋亡的生理意义何在? 3、动物细胞凋亡的基本途径有哪些? 4、细胞凋亡受到哪些因素的调控? 5、什么是“Hayflick界限”? 6.复制衰老可能机制是什么?


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