植物原生质体培养和细胞融合 概念及研究进展 原生质体的分离与培养 原生质体融合.

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1 植物原生质体培养和细胞融合 概念及研究进展 原生质体的分离与培养 原生质体融合

2 原生质体(protoplast)： 脱去细胞壁、裸露的细胞。又称原生质球 原生质体是为质膜所包围的裸露细胞。
亚原生质体(subprotoplast) 在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成的一些较小的原生质体。它可以具有细胞核，也可不具有细胞核。 核质体(nuclearplast) 由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体。 胞质体(cytoplast) 不含细胞核，而仅含有细胞质的原生质体。

3 应 用 Regenerative ability Cell differentiation Ontogenic processes
Organogenesis Somatic genetics Protoplast system Cell physiology Cell fusion Organelle, DNA uptake Cell cloning

4 意 义 植物细胞育种中的核质替换 细胞质杂种的获得 远缘杂交创造新物种细胞 细胞器的互作研究

5 植物原生质体的分离和培养 材料预处理 原生质体分离的方法 原生质体纯化 原生质体活力测定 影响原生质体数量和活力的因素 原生质体培养方法
Flash 材料预处理 原生质体分离的方法 原生质体纯化 原生质体活力测定 影响原生质体数量和活力的因素 原生质体培养方法 影响原生质体培养的因素 原生质体再生过程

6 用于分离原生质体的材料 材料预处理 用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。 ☆ 龙胆试管苗的叶片用4oC处理较好。 ☆ 甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的原生质体才能分裂。 ☆ 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分离原生质体，才能获得高产量。

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8 机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。
缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。 优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。

9 酶解分离法： 指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。
常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶[Driselase]）、果胶酶类（果胶酶和离析酶[Macerozyme]）、蜗牛酶和胼胝质酶。 崩溃酶是一种复合酶，内含昆布（海带）多糖酶(laminariose)、木聚糖酶(xylanase)和纤维素酶(cellu]ase)，消解细胞壁的能力强。来自担子菌。 离析酶的作用是分解植物组织中的果胶质，使粘结在一起的细胞离解成单个细胞。也称浸软酶、浸溶酶或细胞分离酶。 高质量的植物细胞离析酶应具有均衡的多种果胶酶成分，而且还应包含一种低分子蛋白质，这种蛋白质本身无果胶酶活性，但能增强果胶酶离析单细胞的作用。

10 酶 来源 生产厂家 纤维素酶类 Onozuka R-10 绿色木霉 Cellulysin Driselase Irpex lutens
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan Cellulysin Calbiochem.,San Diego,CA 92037, USA Driselase Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo,Japan 根据植物组织的发育和结构，可分辨出细胞壁主要由如下三层组成:(a)中层或胞间层或物质，（b）初生健.(c)次生壁。 中层是将每个细胞连结在一起形成组织的连结物，因而，存在于相邻细胞的初生壁之间。它是一种不定形的物质对于偏振光无活性（向同性）。在支持组织中，它可以填充细胞间的空隙.中层主要由果胶质组成溶解果胶的果胶酶或化学试剂将组织分解为单个细胞，这个过程称为离析。 初生壁是在新细胞上发育的第一层真正的细胞壁。由于中层是细胞间的物质而不是壁所固有的，所以在许多细胞中初生壁是惟一的细胞壁。初生壁是在细胞内发育或某些仍在生长的细胞的某些部分发育的细胞壁。这层壁在光学上是活跃的（向异性）。 次生壁是在初生壁内表面形成的。它在已经停止生长的细胞内及细胞部分上开始发育。次生壁具有强烈的向异性，而且在其上可以观察到分层结构。 在大多数管胞和纤维细胞中，次生壁上可以分辨出三层—外层(s.)、中层(S2) 和内层（S3）在这三层中，中层是最厚的，然而在有些细胞中，层数也许还不只三层。有些研究者用第三生壁表示次生壁的内层。根据Frey-Wyssling的观点也许存在具有与次生壁不同特征的最内层。他认为这一层也许可以分化成两层—膜层和瘤层。 应该提到的是有些研究者在研究木本组织时使用复合中层一词，这一词特指木质化层的复合体。它们在没有前处理时，在光学显微镜下观察，表现出或多或少的同源。当涉及到中层和相邻初生壁时，复合中层也许就是三层；当涉及到中层本身、初生壁和相邻细胞的次生壁外层时，或许就是五层。

11 酶 来源 生产厂家 果胶酶类 Macerozyme R-10 根霉 Pectinase 黑曲霉 Pectolyase Y-23 半纤维素酶
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan Pectinase 黑曲霉 Sigma Chemical Co. Pectolyase Y-23 Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan 半纤维素酶 RhozymeHP-150 Rohm and Hass Co., Rhiladelphia, UAS

12 酶解法的优缺点 优点：获得量大，适用广泛。 缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质。 会影响所获原生质体的活力。

13 原生质体纯化的方法 漂 浮 法 沉 降 法 不 连 续 梯 度 法

14 飘浮法 采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、Percoll、Ficoll）， 使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法。 优点：
可以避免分离的原生质体因震荡被组织碎片撞击而破损。 所用药品简单，成本低。 缺点及补救措施： 对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体则不易漂浮。可采用不同浓度和不同离心速度分次漂浮的方法。 Protoplast Percoll是一种经聚乙烯吡咯烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。 蔗糖聚合物称聚蔗糖（商品名为Ficoll），分子量为40kD，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。 飘浮法

15 沉 降 法 利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。 优缺点：
纯化原生质体比较简单。 由于原生质体沉积于试管底部，造成相互 挤压，常引起原生质体的破碎。

16 又称界面法，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。
优点：可以收集到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互挤压而破碎。 12mL 0.45M甘露醇 碎片带 0.6mL 0.45M蔗糖 含原生质体带 不连续梯度法

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19 原 生 质 体 鉴 定 低渗爆破法 荧光增白剂法(calcoflower white 0.1%)
胀破后留下的残迹是无形的。如果原生质体还带有部分细胞壁，则原生质体从无壁部分胀破，破碎后留下的残迹仍保持半圆形的细胞壁。 激发滤光片为420 nm 阻挡滤光片为530 nm 绿色荧光，有细胞壁。红色，无。 序号 产品名称 结构 性质 适用范围 1 荧光增白剂OB （C.I.184） 苯并恶唑型 外观：浅黄绿色结晶粉末 含量：≥99.0% 熔点： ℃ 本品广泛用于塑料、涂料、油墨、相纸等增白、增艳,效果极佳,且耐高温性能优异。 2 荧光增白剂OB-1 （C.I.393） 苯并恶唑型 外观：淡黄色粉末 熔点： ℃ 适用于塑料，聚酯原液的增白，也适用于涤纶纤维和涤纶与棉及其它纤维混纺织物的增白。 3 荧光增白剂CBS-127 （FP）（C.I.378） 二苯乙烯联苯型 外观：浅黄色结晶粉末 熔点： ℃ 用于PVC和聚苯乙烯系列产品的增白，也可用于其它热塑性塑料。 4 荧光增白剂ER （C.I.199） 双苯乙烯型 外观：黄绿色结晶粉末 熔点： ℃ 用于涤纶聚脂的增白，也可用于塑料增白 5 荧光增白剂ER-II （C.I.199:1） 熔点： ℃ 用于涤纶,涤棉,涤毛等混纺织物,醋酸纤维,锦纶的增白，也可用于塑料增白. 6 荧光增白剂KCB （C.I.367） 外观：淡黄绿色晶体。 熔点： ℃ 含量：≥99.5% 用于合成纤维与塑料制品的增白，也可用于涂料天然漆的增白。 7 荧光增白剂PF （C.I.135） 熔点： ℃ 用于聚氯乙烯,聚苯乙烯,聚丙烯酸酯,聚酯薄膜,高低压聚乙烯,ABS,PS,名片,高级纸张等的增白增艳. 8 荧光增白剂CBS-X (C.I.351) 外观：浅黄色粉末 最大紫外吸收波长： nm 色光:兰紫光 主要用于合成洗涤剂、香皂和肥皂的增白，也可用于棉麻丝、棉纶、羊毛和纸张的增白。 9 荧光增白剂SWN (C.I.140) 外观：白色结晶粉末 熔点：70-73℃ 主要用于羊毛、丝、醋纤和尼龙，也用于肥皂和洗涤剂，以改进产品外观。 10 荧光增白剂BBU (C.I.220) 二苯乙烯双三嗪类化合物. C40H40N12Na4O16S4 外观:淡黄色粉末 色光:兰光 水溶性:极好 用于棉,纤维,粘胶纤维和纸张的增白。 11 液体荧光增白剂 DL-1 二苯乙烯-联苯型 外观:浅黄绿色透明液体 阴离子型混合物 在纸浆内,在涂布过程中,在表面施胶中进行荧光增白. 12 CBS-X (C.I.351) 外观: 黄绿色透明液体 增白剂含量:≥16%

20 原 生 质 体 活 力 测 定 形态识别 形态完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常球形，放入低渗溶液中，可正常膨大。

21 原 生 质 体 活 力 测 定 荧光显微镜识别(FDA法)
FDA (fluorescein diacetate) 本身不发荧光也不具有极性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内FDA可以被酯酶裂解，将能发荧光的极性部分释放出来。荧光素则不能自由穿越质膜，在完整的活细胞内积累。 黄绿色荧光 使用浓度：0.01%

22 原 生 质 体 活 力 测 定 酚藏花红染色法（0.1%) 酚藏花红能使无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。
伊凡蓝(Evan’s blue)染色法(0.025%) 有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取。 氧电极法 伊凡蓝 伊万斯蓝 伊文斯蓝

23 影响原生质体数量和活力的因素 供试材料及预处理方法 酶解条件： 渗透压稳定剂 质膜稳定剂 分离条件： 分离用具
酶质量、组合、浓度、pH、光照和温度 渗透压稳定剂 质膜稳定剂 分离条件： 离心次数、离心速度、纯化方法、分离纯化持续时间。 分离用具

24 酶的种类、组合、浓度 几种草本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%) 材料 纤维素酶 半纤维素酶 崩溃酶 果胶酶 离析酶 蜗牛酶 研究者
烟草叶片 禾谷类叶片 油菜花粉 马铃薯子叶 马铃薯花粉 1.0 2.0 0.5 0.1~0.2 Uchimiya Scott 李仕琼 戴朝曦 王蒂

25 几种木本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%)
材料 纤维素酶 半纤维素酶 崩溃酶 果胶酶 离析酶 研究者 枸杞愈伤组织 檀香幼叶 檀香愈伤组织 榆幼叶 山毛榉幼叶 胡杨悬浮细胞 0.5 2.0 1.0 0.1~0.2 0.2 0.05 0.01~0.03 0.1 孙勇如等 Lakshmi Dorin Ahuja 诸葛强

26 pH 分离原生质体时，酶液的pH值是值得注意的问题。因为降解酶的活力和细胞活力最适pH值是不一致的。 如制备菜豆叶片原生质体时：

27 光照和温度 制备原生质体时，在细胞中加入酶液、渗透压稳定剂、质膜稳定剂后，还需在一定时间内保持一定的温度，原生质体方能释放。
脱壁的原生质体对光非常敏感，分离原生质体一般是在黑暗条件下进行的。 在28℃条件下，每分钟40转的旋转式转床上培养4h后，叶片组织可完全分离 。 悬浮细胞需在25℃～33℃条件下酶解24h 。

28 渗透压稳定剂 原生质体由于细胞壁的解除和壁压的消失将引起细胞破碎。因而在酶液、原生质体洗涤液、培养液中必须调整渗透压，维持细胞内外渗透压平衡，防止细胞涨破或过分收缩而破坏内部结构。 常用的渗透压稳定剂：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等，浓度约在0.40M~0.80M。渗透压稳定剂还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂 。

29 质膜稳定剂 目的：增加完整原生质体的数量，防止质膜破坏，促进原生质体细胞壁再生和细胞分裂形成细胞团。 常用的质膜稳定剂
葡聚糖硫酸钾、2-（N-吗啉）-乙烷磺酸、氯化钙、磷酸二氢钾。

30 原生质体培养方法

31 液体浅层培养法 优点： 原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。 缺点： 原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。

32 双层培养法——液体-固体双层培养法 优点：
固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。 缺点： 不易观察细胞的发育过程。

33 固体薄层培养法 优点： 使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。
缺点： 培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。

34 琼脂糖珠培养 将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ml一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。 培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育，这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。

35 影响原生质体培养的因素 原生质体的活力 原生质体的起始密度 渗透压稳定剂 培养基营养
适宜密度在104~105个／ml左右。在烟草叶原生质体培养中，密度低于103个／ml时，细胞只能分裂一、二次，密度在104个／ml以上，植板率常显著提高。 渗透压稳定剂 培养基营养 原生质体培养经常使用的KM-P培养基就是以B5培养基为基础；N6培养基则以MS培养基为基础 改进的。 对原生质体培养来讲，蔗糖不如葡萄糖。用葡萄糖代替甘露醇，可提高原生质体的植板率。 KM-P培养基，它包括丰富的维生素、氨基酸、有机酸、核苷酸、糖及糖醇等有机成分 。 不同植物原生质体对外源激素的种类和浓度的需求有很大差异，但总的来说，生长素和细胞分裂素是必需的，并需要二者的适当搭配。 较高的Ca2+浓度能提高原生质体的稳定性，这是由于Ca2+能保持原生质体质膜的电荷平衡。因此很多游高原生质体的酶液中都添加一定量的Ca2+和其他阳离子。在培养中，较高浓度的Ca2+对原生质体的生长发育同样有利。例如，豌豆原生质体在高Ca (5．3 mmol／L)中培养3、6 d，分别有10％、23％的原生质体再生细胞；而在低Ca2+(1 mmol／L)条件 下，分别只有3％、7％的原生质体再生成细胞。

36 影响原生质体培养的因素 培养条件 植物材料和基因型 供体细胞的生长同步性 温度，光照 柑桔，葡萄，桃
原生质体在初期应在黑暗中培养；当形成愈伤组织时，需要强光照(2000~10000 lx)，以后甚至要强光照射才能满足生长的需要。 如柑桔类、猕猴桃等的原生质体培养较容易；葡萄原生质体的分离和培养从1974年就开始了，但到1990年才从欧洲葡萄悬浮细胞来源的原生质体 再生出植株；桃的原生质体培养至今仍只能得到愈伤组织。

37 原生质体再生过程 原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质体在适当的培养方法和良好的培养条件下，很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分化出完整植株的过程。 细胞壁再生 细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成 植株再生

38 细胞壁再生是细胞分裂的先决条件 再生所需时间与植物种类和起源细胞的分化程度及生理状态有关。
再生过程：先是质膜合成细胞壁主要成分微纤维，然后在质膜表面进行聚合作用，形成多片层的结构，以后在质膜和片层结构之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形成完整的细胞壁。 检测新壁合成的方法 荧光增白剂法(calcoflower white 0.1%)和电镜技术 荧光增白剂染色后置紫外显微镜下观察，细胞壁呈现明显荧光。细胞壁纤维素的β-1.4-葡聚糖链相结合 当形成两个新的细胞核的同时，在赤道板的位置出现了一个细胞板，细胞板由细胞的中央向四周扩散逐渐形成了新的细胞壁。 至于纤维素等组成是从哪个部位或哪种细胞器合成的，根据目前的了解，质膜是唯一可能承担这个任务的，从扫描电镜观察原生质体生长壁的过程来看，纤维素微纤丝的形成部位，必须是紧靠质膜的。

39 细胞分裂 愈伤组织或胚状体形成 植株再生

40 几种不同类型的原生质体分裂和发育速度比较
原生质体类型 第一次分裂 时间 % 植板率 (%) 细胞分裂情况 愈伤组织分化速度 原生质体到再生植株 烟草叶片 4d 60 2周—20个细胞组成的细胞团 1m形成芽 3m 胡萝卜培养细胞 6d 10~20 5~30 8~10d形成细胞团，4周后形成胚状体 胚状体3周后成苗 4m 矮牵牛愈伤组织 2周后形成20~25个细胞的细胞团 8~10周出芽 油菜叶片 2~3d 10 15d形成细胞团28d愈伤组织 10d分化出芽 马铃薯子叶 48h 46.1 9~10d形成16个细胞的细胞团 2m 马铃薯花粉 2h 15d形成细胞团

41 原生质体融合 原生质体融合方法 原生质体融合类型

42 原生质体融合（protoplast fusion)
两种异源（种、属间）原生质体，在人工控制条件下，相互接触从而发生膜融合，胞质融合和核融合并形成杂种细胞的过程。Flash 体细胞杂种： 杂种细胞可进一步发育成杂种植物体。由融合细胞培养成的植株称为体细胞杂种植株。

43 诱导原生质体融合的方法 化学融合(chemical fusion) 电融合(electrofusion)
定义：利用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合的方法。 主要种类： 盐类融合法（NaNO3融合） 高pH-高浓度钙离子融合法 PEG融合法 电融合(electrofusion) 利用改变电场来诱导原生质体彼此连接成串，再施以瞬间强脉冲使质膜发生可逆性电击穿而使原生质体融合的方法。

44 NaNO3融合法 机理： 原生质体表面带有负电荷(-10～-30mV)，同性质电荷彼此凝聚的原生质体质膜无法靠近到足以融合的程度。
融合率 0.1%~4%。 例子：Power（1970），玉米与燕麦原生质体融合 一般认为，原生质体融合首先必须使两个原生质体紧密接触，质膜之间的距离要小于10埃A。

45 高pH-高浓度钙离子融合法 Keller和Melchers(1972，1974)首先发现高pH-高浓度钙离子的诱发融合效应。 机理：
钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生质体膜的结合； 高pH又能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合 钙离子浓度和pH范围因植物种类不同而异。（例：烟草原生质体融合－－pH10.5，0.05 mM CaCl2）

46 PEG融合法 诱导融合的机理 PEG具有分子桥的作用 原生质体－水、蛋白质和碳水化合物－ （氢键） PEG（氢键） －原生质体 打破电荷平衡
再经高浓度Ca2＋和高pH溶液处理并用培养液清洗，可能使一种原生质体上的带正电荷的基团连到另一种原生质体的带负电荷的基团上，导致原生质体融合。 但PEG对原生质有一定的毒害作用。 PEG分子具有轻微负极性，可与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键。当PEG分子链足够长时，它在相邻原生质体表面之间起分子桥作用，引发原生质体粘连。与膜相连的PEG分子被洗掉后，膜上电荷发生紊乱而重新分配。当两层膜紧密接触区域的电荷重新分配时，可能使一种原生质体上的带正电荷的基团连到另一种原生质体的带负电荷的基团上，导致原生质体融合。

47 PEG融合技术的要点 融合液配置 A液：CaCl2 2~8mM KH2PO4 0.5~0.7mM 甘露醇或山梨醇 0.1~0.2mM
pH B液：CaCl2 2~8mM pH ~10.0

48 PEG融合技术的要点 融合原生质体的密度和比例 融合 密度：1×105 个/毫升 比例：1:1
融合原生质体溶液 0.1~0.5ml，静置3～5min 融合液A 0.1~0.5ml，保持15~20min，25℃ 融合液B 0.1~0.5ml，保持10~20min，25℃ 培养液洗涤（3～4次），离心（100×g，5min）

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50 电融合 基本原理： 在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。

51 将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室
电融合 将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室 微电极型 平行多电极 两个电极的端部同时与两 个靠近的原生质体膜表面 接触，原生质体由于脉冲 电流间断刺激，两层膜间 产生小孔，连接成桥，经 点连接到面连接，最后形 成融合体。 平行多电极通过1MHz交流电场发生双向电脉冲，原生质体在电场力作用下，极化产生偶极子，原生质体紧密排开成串珠状。此时，加入 直流电脉冲，质膜被击穿，进一步形成融合体

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53 电融合 与PEG融合比较起来，电融合的优点： 电融合参数 （例：马铃薯，融合率>40%） 不存在对细胞的毒害问题 融合效率高
融合技术操作简便 电融合参数 （例：马铃薯，融合率>40%） 交变电场的振幅频率 100 V/cm 交变电场处理时间 20s 支流高频电压 1100V/cm 脉冲宽度 60us 脉冲次数 1

54 融 合 类 型 Flash 自发融合 诱发融合 对称融合 非对称融合 核失活 细胞质失活

55 影响原生质体融合的因素 原生质体质量至关重要，高质量的原生质体是细胞融合的首要条件。 融合方法 融合参数，包括各种融合液都应选择适当。
．在应用PEG进行融合时，重要的影响因素是PEG的种类、纯度、浓度、处理时间、原生质体的生理状况和密度．近年来一些研究者建议在PEG 溶液中加入融合促进剂(如伴刀豆球蛋白，二甲基亚砜，链霉素蛋白酶等)，可以有效地提高原生质体融合的频率． Senda建立的电融合法发展迅速，是目前最流行的融合方法

56 融 合 体 类 型 异核体(heterokaryon)或异核细胞 基因型不同的原生质体融合成杂交细胞 同核体(homokaryon)
基因型相同的原生质体融合成的杂交细胞 非对称杂种或细胞质杂种

57 细胞质工程 (cytoplasmic engineering)
细胞质工程 又称细胞拆合工程 是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核质的重新组合，重建成新细胞。 可用于研究细胞核与细胞质的关系的基础研究和育种工作。

58 细胞质工程 细胞质杂种 应用细胞融合技术，使两种来源不同的核外遗传物质与一个特定的核基因组结合在一起 细胞质杂种获得途径（4条）：
一个正常原生质体与一个去核原生质体融合； Lorz等（1981）用密度梯度离心（5％~50% Percoll，20000~40000g，40~90min）获得高纯度的去核原生质体。

59 细胞质工程 细胞质杂种获得途径 异核体形成后，两个核中有一个消失； 较晚时期，染色体选择性消失。 一个正常原生质体和一个核失活原生质体融合
使核失活的方法：X射线，碘乙酰胺，罗丹明 异核体形成后，两个核中有一个消失； 较晚时期，染色体选择性消失。

60 体细胞杂种产生的其它途径 细胞器移植 叶绿体移植 叶绿体的来源 叶片－－－机械法－低速离心 原生质体－低渗涨破－低速离心 叶绿体的纯化
Percoll或蔗糖密度梯度离心 叶绿体的转移 夹层离心法和PEG诱导融合 应用PEG诱导胡萝卜原生质体摄入藻类叶绿体 利用叶绿体的转移使低光效作物的原生质体通过摄取高光效作物的叶绿体而提高其光合效率。

61 体细胞杂种产生的其它途径 细胞器移植 细胞核移植 细胞核的来源 植物组织－机械法（加Triton X-100）－过滤离心
细胞核的纯化 Percoll或蔗糖密度梯度离心 细胞核的转移 夹层离心法：原生质体－核－原生质体－核∙∙∙ PEG诱导 电场诱导和微注射

62 体细胞杂种产生的其它途径 微生物移植 外源染色体和DNA的摄入 内吞作用 摄入固氮根瘤菌 染色体分离
细胞－同步化处理－原生质体－涨破－差速离心（200 g,10 min；1000g，20 min） 转移方法 PEG诱导，显微注射 农杆菌介导，基因抢，电穿孔，超声波，激光穿孔

63 体细胞杂种选择及杂种植株鉴定 根据可见标记性状的机械选择法 常用的可见标记为叶肉细胞的绿色。
利用融合细胞所具有的可见标记，在倒置显微镜下，用微管将融合细胞吸取出来进行选择的方法。 常用的可见标记为叶肉细胞的绿色。 应用荧光染料标记，在荧光显微镜下分离或用流式细胞仪分拣。 以亲本为对照进行形态特征、特性鉴定；最好要有明显的标记特征，如气孔大小及在叶背表皮上分布密度等。

64 体细胞杂种选择及杂种植株鉴定 。 FITC(异硫氰酸荧光素)在荧光显徽镜下呈绿色 RITC (异硫氰酸罗丹明) RITC在荧光显徽镜下呈红色
是用FITC(异硫氰酸荧光素)和RITC(异硫氰酸罗丹明)将烟草叶肉细胞分别进行荧光标记。由于FIT℃ 在荧光显徽镜下呈绿色，RITC呈红色。

65 体细胞杂种选择及杂种植株鉴定 根据其遗传和生理生化特性的互补选择法

66 互补选择法 互补选择法是指利用两个亲本具有不同遗传和生理特性,在特定培养条件下,只有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。
抗性互补选择法 营养代谢互补选择法 生长互补选择法 矮牵牛+爬山虎融合体的选择

67 混合体 原生质体 原生质体 细 胞 团 死亡 细胞团 细胞团 愈伤组织 死亡 愈伤组织 愈伤组织
矮牵牛 爬山虎冠瘿 混合体 原生质体 融合处理 原生质体 NT培养基 矮牵牛+爬山虎 MS 培养基 (无激素) NT培养基 （异核体） 细 胞 团 死亡 NT培养基 MS 培养基 (无激素) MS 培养基 (有激素) 细胞团 细胞团 MS培养基(无激素) 愈伤组织 死亡 愈伤组织 愈伤组织

68 体细胞杂种选择及杂种植株鉴定 细胞学鉴定 利用染色体显带技术，以亲本染色体为对照，对细胞杂种的染色体数目、形态和带型进行观察。
显带染色是将染色体经过一定程序的处理,并用特定的染料染色后,使染色体在其长轴上显示出一个个明暗交替或深浅不同的横纹,这样的横纹就叫做染色体的带。 每条染色体都含有一定数量、一定排列顺序、一定宽窄和染色深浅或明暗不同的带,这就构成了每条染色体的带型。显示染色体带的过程称为染色体显带。 染色体的染色技术可以分为普通染色和显带染色两大类。普通染色是将普通染料直接染色在染色体标本上。由于整条染色体都均匀着色,在显微镜下只能看到染色体的外形,看不清其内部结构,因此只能根据染色体的相对长度和着丝粒位置等外形体征来识别染色体 。

69 体细胞杂种选择及杂种植株鉴定 同功酶鉴定 根据亲本和杂种同功酶谱的差异来鉴别杂种。有的呈双亲谱带的总和、有的出现新谱带或丢失部分亲本谱带。常用的鉴定酶为：乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、过氧化物酶、酯酶等。

70 Random Amplified Polymorphic DNA
体细胞杂种选择及杂种植株鉴定 Random Amplified Polymorphic DNA DNA分子标记鉴定 是在DNA水平上对亲本和杂种植株遗传差异进行鉴定的一种技术。 依据DNA的多态性（polymorphism） 在生物基因组中，DNA存在倒位、易位、插入、缺失、转座或排列不一的重复序列的现象，表现出DNA的多态性（polymorphism）。应用一定的检测技术就能够鉴定出不同种、品种间的DNA多态性（也称DNA分子标记或DNA指纹）。 原理RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA），即随机扩增多态性DNA技术，是由美国科学家Wiliams和Welsh于1990年分别研究提出的，又称任意引物PCR。它的应用是基于这样的一个推理：对于同一模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱（模板基因组间可能具有同源性），也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。事实上，不同基因组DNA总是一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。理论上讲，在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。

71 体细胞杂种选择及杂种植株鉴定 是一种基于Southern杂交的分子标记技术。它利用特异性核酸片段作探针，直接同染色体DNA片段杂交，在染色体
地高辛等标记特异核酸片段，杂交信号经酶联显色或荧光显色得以显示。原位杂交的优点是准确、直观，但技术非常复 杂。

72 小结 原生质体是植物除去细胞壁的裸露细胞，是进行各种细胞操作的理想系统。 原生质体的分离和纯化是对其操作和培养的前提。
分离的原生质体活性受供体材料和分离条件的影响。 原生质体培养是细胞工程精细技术，培养技术成熟程度直接影响体系的应用。

73 小结 原生质体融合是获得胞质杂种的理想途径。 体细胞杂交在远缘育种和新物种、新资源创造中具有深远意义。
原生质体融合技术主要有PEG融合及电融合 提高融合效率和融合细胞培养重复性是该技术研究的重点

74 思考题 1．原生质体、亚原生质体、微小原生质体和原生质球的概念。 2．为什么原生质体要培养在等渗培养基中？ 3．影响原生质体培养的主要因素。
4．原生质体的培养方法有哪些？各有何优缺点 5．为什么说原生质体培养系统是现代生物技术的载体？

75 思考题 6．植物体细胞杂交的概念和类型。 7. 什么是细胞质工程？ 8．对称融合和非对称融合的概念及非对称融合的作用。
7. 什么是细胞质工程？ 8．对称融合和非对称融合的概念及非对称融合的作用。 9．PEG融合与电融合的原理及影响因素。 10．杂种细胞的获得和选择方法。