第六章 外源基因的表达.

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1 第六章 外源基因的表达

2 生物有机体的遗传信息都是以基因的形式储存遗传物质DNA分子上的

3 在大肠杆菌细胞中，参与特定新陈代谢的基因是趋于成簇地集成一个转录单位，即操纵子
在基因表达过程中，操纵子先转录成多顺反子mRNA 。 多顺反子mRNA转译成多肽分子

4 操纵子：是基因表达的协调单位，由启动子、操纵基因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成。操纵基因受调节基因产物的控制。
（1）酶的诱导 调节基因 操纵基因 结构基因 阻遏蛋白 阻遏蛋白阻挡操纵基因， 结构基因不表达。 诱导物 mRNA 酶蛋白 诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白 不能阻挡操纵基因，结构基因表达。 启动子

5 阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达
（2）酶的阻遏 启动子 结构基因 结构基因 操纵基因 操纵基因 调节基因 调节基因 启动子 mRNA 辅阻遏物 酶蛋白 代谢产物与阻遏蛋白结 合，使之构象发生变化 与操纵基因结合，结构 基因不能表达 阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达

6 第一节  基因表达的机制 外源基因在原核细胞中的表达 外源基因在真核细胞中的表达

7 ① 原核生物只有一种RNA聚合酶(真核细胞有三种)识 别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 ② 原核生物的表达是以操纵子为单位的。
一、原核细胞基因表达的特点 ① 原核生物只有一种RNA聚合酶(真核细胞有三种)识 别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 ② 原核生物的表达是以操纵子为单位的。 ③ 由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的， 也是连续进行的。

8 ④ 原核基因一般不含有内含子(intron)，在原核细 胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。
⑤ 原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。 ⑥ 在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S rRNA 3，末端碱基互补的序列，即SD序列，而真核基因则缺乏此序列。

9 外源基因在原核细胞中表达条件 ① 通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白；
② 外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA； ③ 必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达； ④ 外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(open reading frame，ORF)； ⑤ 利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。

10 二、几种类型的原核表达载体 不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白称为非融合蛋白
在原核细胞中表达外源基因时，可产生融合型和非融合型表达蛋白 不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白称为非融合蛋白 融合蛋白是指蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码，C端由真核DNA的完整序列编码。

11 非融合蛋白的优点 在于它具有非常接近于真核细胞体内蛋白质的结构，因此表达产物的生物学功能也就更接近于生物体内天然蛋白质 。 非融合蛋白的最大缺点是容易被细菌蛋白酶所破坏 表达非融合蛋白，将带有起始密码子ATG的真核基因插入到原核启动子和SD序列的下游，组成一个杂合的核糖体结合区，经转录翻译，得到非融合蛋白。

12 注意 融合蛋白：由一条短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白质结合在一起。 含原核细胞多肽的融合蛋白是避免细菌蛋白酶破坏的最好措施
注意其阅读框架，其阅读框架应与融和的DNA片段的阅读框架一致，翻译时才不至于产生移码突变。

13 基因工程载体： 克隆载体 克隆载体中都有一个松弛型复制子，能带动外源基因在受体细胞中复制扩增 表达载体 表达载体是适合在受体细胞中表达外源基因的载体

14 1. 非融合型表达蛋白载体pKK223-3 Brosius等在哈佛大学的Gilbert实验室组建的 在大肠杆菌细胞中，它能极有效地高水平表达外源基因 它具有一个强的tac(trp-lac)启动子。这个启动子是由trp启动子的-35区、lacUV5启动子的-10区、操纵基因及SD序列组成

15 tac启动子之后是一个取自pUC8的多位点接头，使之很容易把目的基因定位在启动子和SD序列后
在多位点下游的一段DNA序列中，还包含一个很强的核糖体RNA的转录终止子，目的是为了稳定载体系统 载体的其余部分由pBR322组成。

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17 2．分泌型克隆表达载体pinⅢ系统 以pBR322为基础构建的。它带有大肠杆菌中最强的启动子之一，即Ipp(脂蛋白基因)启动子
在启动子的下游装有lacUV5的启动子及其操纵基因 lac阻遏蛋白的基因(1ac I)也克隆在这个质粒上

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19 3．融合型蛋白表达载体pGEX系统 含有启动子tac及lac操纵基因、SD序列、lacI阻遏蛋白基因等 SD序列下游是谷胱甘肽巯基转移酶基因
克隆的外源基因则与谷胱甘肽巯基转移酶基因相连

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21 三、 提高克隆基因表达效率的途径 满足商品生产的广泛需求 仅仅停留在检测水平上的表达是远远不够的
许多因素，诸如启动子的强度、DNA转录起始序列、密码子的选择、mRNA分子的二级结构、转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和寄主细胞的生理特征等，都会不同程度地影响到克隆基因的表达效率

22 1．启动子结构对表达效率的影响 为了鉴定出最强的启动子，必须创建出衡量不同启动子转录效率的研究系统。这一系统已由Russell等(1982)创建 受检启动子的强弱与它们的一致序列（即与-10和-35区序列）相似的程度成正比 -35和-10区之间的距离也是一个重要因素。如果间隔为17个碱基对，启动子表现很强，如果大于17个碱基对，启动子表现较弱

23 2．转译起始序列对表达效率的影响 连接在SD序列后面的4个碱基成分的改变会对转译效率发生很大的影响。 如果这个区域是由4个A(T)碱基组成，其转译作用最为有效； 这个区域是由4个C碱基或4个G碱基组成，其转译效率只及最高转译效率的50％或25％。 直接位于起始密码子AUG左侧的密码三联体的碱基组成，同样也会对转译的效率发生影响。

24 3．启动子同克隆基因间距离对表达效率的影响
Roberts等(1979)构建了一系列重组质粒，各种质粒之间的区别仅在于启动子和结构基因cro之间的距离不同 将这些不同的重组质粒转化大肠杆菌后，发现cro蛋白质的水平在重组质粒间相差悬殊，最高值比最低值大2000倍

25 启动子与结构基因间的距离在蛋白质翻译上有巨大作用
进一步的研究还表明：①翻译的起始点和SD序列必须接近到一定程度；②翻译的起始包括活化的30S核糖体亚基和mRNA 5’末端区域间的互作，这时mRNA的5’末端已折叠成特殊的二级结构。基因表达水平的改变是mRNA二级结构的反映。

26 4．转录终止区对克隆基因表达效率的影响 第一，若干非必须的转录本的合成，会使细胞消耗巨大的能量用于制造大量非必须的蛋白质； 第二，在转录本上有可能形成一些不期望其出现的二级结构，从而降低了转译的效率； 第三，偶然会出现启动子阻塞现象，也就是说，克隆基因启动子所开始的转录，会干扰另一个必要的基因或调节基因的转译。

27 有些强启动子会通读，干扰质粒的复制，结果使质粒的拷贝数反而下降
在基因内部的适当位置上存在着转录的终止区，就能够保证使质粒的拷贝数(也就是基因的表达效率)控制在一个正常的水平上。

28 5．质粒拷贝数及稳定性对表达效率的影响 由于细胞中核糖体的数量与mRNA分子相比是大大超量的，因此，提高克隆基因表达效率的途径之一是增加相应的mRNA分子的数量 启动子的强度 第二种是基因的拷贝数

29 6．提高翻译水平常用的途径 (1) 调整SD序列与AUG间的距离 此距离过长、过短都影响真核基因的表达 (2) 用点突变的方法改变某些碱基
(3) 增加mRNA的稳定性

30 7．减轻细胞的代谢负荷 外源基因在细菌中高效表达，必然影响宿主的生长和代谢 而细胞代谢的损伤，又必然影响外源基因的表达
合理地调节好宿主细胞的代谢负荷与外源基因高效表达的关系

31 8．提高表达蛋白的稳定性，防止其降解 (1) 克隆一段原核序列，表达融合蛋白 (2) 采用某种突变菌株，保护表达蛋白不被降解
(3) 表达分泌蛋白

32 第二节 基因表达的调控元件

33 一、启动子 是一段提供RNA聚合酶识别和结合DNA序列 位于基因的上游 长度因种类而异，一般不超过200bp RNA聚合酶定位结合到启动子上，启动转录

34 启动子：基因表达调控的重要顺式元件 序列特异性 在启动子的DNA序列中 ，通常含有几个保守的序列框，序列框中碱基的变化会导致转录启动的滞后和转录速度的减慢。 方向性 具有方向性的顺式调控元件，正反两个方向中只有一种具有启动功能。

35 位置特异 只能位于所启动转录基因的上游或基因内的前端。 种属特异性
原核生物的不同种、属，真核生物的不同组织具有不同类型的启动子。亲缘关系越近的两种生物，其启动子通用的可能性较大

36 1、原核生物的启动子 转录起始位点 Pribnow框 Sextama框 间隔区

37 （1）转录起始位点 大多数细菌启动子转录起始区序列为CAT （2）Pribnow框 转录起始位点上游6bp处 六联体保守序列：TATAAT －10序列区 有助于dsDNA局部双链解开

38 （3）Sextama框 六联体保守序列 位于转录起始位点上游35bp处 －35区 保守序列为：TTGACA RNA聚合酶的识别位点

39 （4）间隔区 转录起始位点与Pribnow框之间 Pribnow框与Sextama框之间 间隔序列的碱基组成对启动子的影响 间隔序列的长度影响启动子的功能 Pribnow框与Sextama框之间间隔17bp，转录活性较高 长度大于或小于17bp，会减弱启动子的转录活性

40 原核生物启动子结构模式

41 R -35 B -10 I +1 Sextama Box Pribnow Box Initiation

42 2、真核生物的启动子 rRNA基因启动子（I型） mRNA基因启动子（II型） tRNA基因启动子（III型）

43 转录起始位点 TATA框 TATAA（T）AA（T） 富含AT的保守序列区 与dsDNA的解链有关，决定转录起始位点 CAAT框 转录起始位点上游－75处 9bp的保守序列 GCT（C）CAATCT 与RNA聚合酶的结合有关 GC框 ， 上游－100～－300位置 GGGCGG， 转录因子的结合有关

44 Promoter for basic transcription
( class II recognized by RNA polymerase II ) l     Cap site ; initiation point (+1) Capping m7GpppA/G ±---AUG---(in mRNA) Initiation region PyPyANT/(A)PyPy 1-4Kb GC island CAAC/T box TATA box Cap Enhancer UPE core promoter Promoter (basic factor)

45 Promoter for basic transcription
l     TATA box / Hogness box / Goldberg-Hogness box (-30) Rich AT and rich GC flanked 1-4Kb GC island CAAC/T box TATA box Cap Enhancer UPE core promoter Promoter (basic factor)

46 Promoter for basic transcription
l     GC island (C no methylated) and CAAT box (CAT box UPE) (-70) GCGC-----GGC(T)CAATCT---- Response to effect of transcription Range 30 bp± 1-4Kb GC island CAAC/T box TATA box Cap Enhancer UPE core promoter Promoter (basic factor)

47 3、启动子的分离 随机克隆法 聚合酶保护法 过滤膜结合法 PCR法

48 随机克隆法 酶切含启动子的DNA 随机克隆到pKO1探针质粒上 重组分子转化galK- 大肠杆菌受体 转化物涂布以半乳糖为唯一碳源的McConkey培养基 pKO1探针质粒含有缺启动子的galK 报告基因，当具有启动子活性的片断插入到galK 报告基因上游时可启动其表达，产生半乳糖激酶。

49 聚合酶保护法 原理：根据RNA聚合酶与启动子区域特异性结合 取基因组文库中重组质粒与RNA聚合酶体外保温
选择合适的限制酶或外切酶消化，以未加RNA聚合酶的DNA作对照 消化产物电泳分析 被钝化的酶切位点或片断位于RNA聚合酶保护区内 可能包含启动子序列

50 过滤膜结合法 原理：dsDNA不能与硝酸纤维素膜有效结合，而DNA－蛋白质复合物缺能有条件结合到膜上 将DNA片断与RNA聚合酶体外温育
将混合物转移到膜上 漂洗薄膜，除去未结合的RNA聚合酶和dsDNA 高盐溶液洗脱与RNA聚合酶结合的DNA片断 该片断含有启动子序列

51 二、增强子 增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列 结构类似于启动子，由多个元件组成 每个元件可以与一种或多种转录调控因子结合
在真核生物中，II型启动子的启动转录往往需要一个或几个增强子的参与

52 ★ Enhancer 的结构与功能 ----Enhancer 由两个以上的增强子成分(Enhancer Element)组成
增强子元 (Enhanson）组成 ----各个Enhanson(cis-factor)与激活蛋白(trans-factor)结合 促进转录的复合体 + UPE + core promoter 基本转录复合体 增强特异性转录

53 增强子的特性 双向性 增强子的正反两个方向都有调节活性 重复序列 含有能够独立行使功能的重复序列 与所处位置无关
增强子可处于转录起始位点的上游、下游，甚至在转录序列之中；离被调控的序列可达数千个碱基对

54 特异性 少数增强子能在所有类型的细胞中发挥作用，而大多数增强子行使功能时具有组织特异性，或在给定细胞的特定阶段发挥作用 增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异源基因相连时也有功能。

55 e.g. SV40 Enhancer (-179~ -250) En. Elem. En. Elem En. Elem. -250 -180
coreC TCII TCI sphII sphI Ap Ap Ap1 远距离控制，无方向性 +1 GC CAAT TATA 促进转录复合体 基本转录复合体 mRNA

56 三、 终止子和终止因子 终止子：提供转录终止信号的一段DNA序列。 终止因子：协助RNA聚合酶识别终止子的蛋白质辅助因子。
三、  终止子和终止因子 终止子：提供转录终止信号的一段DNA序列。 终止因子：协助RNA聚合酶识别终止子的蛋白质辅助因子。 有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使酶越过终止子继续转录，称为通读，这类引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子。 终止子位于已转录的序列中，DNA的终止子可被RNA聚合酶本身或其辅助因子识别。

57 1、 大肠杆菌中的两类终止子 （1）、 不依赖于ρ的终止子（简单终止子） （2）、 依赖ρ的终止子
1、   大肠杆菌中的两类终止子 所有原核生物的终止子在终止点之前都有一个回文结构，它转录出来的RNA可以形成一个颈环式的发荚结构。 （1）、    不依赖于ρ的终止子（简单终止子） 简单终止子除具有发夹结构外，在终止点前有一寡聚U序列，回文对称区通常有一段富含GC的序列。 寡聚U序列可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板。 （2）、    依赖ρ的终止子 依赖ρ的终止子，必需在ρ因子存在时，才发生终止作用。终止点前无寡聚U序列，回文对称区不富含GC。 ρ因子是55KD的蛋白质，可水解三磷酸核苷。

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60 2、 抗终止作用 通读往往发生在强启动子、弱终止子的基因上。
2、   抗终止作用 通读往往发生在强启动子、弱终止子的基因上。 抗终止作用常见于某些噬菌体的时序控制。早期基因于后基因之间以终止子相隔开，通过抗终止作用可以打开后基因的表达。

61 四、大肠杆菌色氨酸操纵子的调节机制-衰减子模型：
衰减子：在转录水平上调节基因表达的衰减作用，用于终止和减弱转录，这种调节的作用部位叫衰减子

62 大肠杆菌色氨酸操纵子的调节机制-衰减子模型

63 大肠杆菌色氨酸操纵子衰减的可能机制 形成终止信号 转录终止 高浓度色氨酸 不能形成终止 信号转录得以 进行 低浓度色氨酸

64 衰减子模型能够较好地说明某些氨基酸的生物合成 的调节机制
阻遏和衰减机制虽然都是在转录水平上进行调节，但是它们的作用机制完全不同。 阻遏控制转录的起始，而衰减控制转录起始后是否能继续下去。