试验三 用于大分子分离的电泳技术 孔忠新 2009.11.06.

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1 试验三 用于大分子分离的电泳技术 孔忠新

2 电泳技术原理 电泳技术，是指在电场作用下，带电颗粒在由于所带的电荷不同以及分子大小差异而有不同的迁移行为从而彼此分离开来的一种实验技术。
许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子结构及所在介质的pH值和组成。由于混合物中各种组分所带电荷性质、电荷数量以及相对分子质量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速率也各异。因此，在一定时间内各组分移动的距离也不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。

3 电泳技术应用 电泳技术主要用于分离各种有机物（如氨基酸、多肽、蛋白质、脂类、核苷酸、核酸等）和无机盐；也可用于分析某种物质纯度，还可用于分子量的测定。 电泳技术与其他分离技术结合 电泳法与层析法结合 用免疫原理测试电泳结果 电泳与酶学技术结合 用于蛋白质结构的分析 提高对蛋白质的鉴别能力 发现同工酶，对于酶的催化和调节功能有了深入的了解

4 琼脂糖凝胶电泳

5 琼脂糖凝胶电泳原理：        琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D－半乳糖和3,6脱水L－半乳糖连接而成的一种线性多糖。 在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1％－3％，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。

6 琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型、大分子核酸等，应用较广。琼脂糖可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。

7 琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1％的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。 琼脂糖适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA，电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。 另外，一些低熔点的琼脂糖（62 ℃时熔化，因此其中的样品如DNA可以重新溶解到溶液中而回收。

8 由于琼脂糖凝胶的弹性较差，难以从小管中取出，所以一般琼脂糖凝胶不适合于管状电泳，管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。 目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下： 1） 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。 2） 琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98%~99%），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 3） 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。 4） 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。

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11 操作

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13 凝胶的EB染色 EB使用时的配制、贮存及使用
EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。

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16 Goodview可与DNA分子形成复合物，发射的荧光强度较游离的Goodview强度大10倍以上，且荧光强度与DAN含量成正比

17 琼酯糖凝胶电泳的浓度及分辨率 琼脂糖浓度（W/V） 大小范围（bp） 0.6% 1000-23000 0.8% 800-10000 1.0%
0.6% 0.8% 1.0% 1.2% 1.5% 2%

18 不同类型琼脂糖的性质 琼脂糖类型 凝结温度/℃ 熔化温度/ ℃ 标准琼脂糖 35~38 90~95
不同厂家生产的不同商品其凝结温度和熔化温度有一定差异 40~42 85~90 高强度琼脂糖 34~43 85~95 修饰的低熔点/ 凝点琼脂糖 25~35 63~65 35 65 超低熔点 8~15 40~45 低黏性低熔点琼脂糖 25~30 70 38 85 30 75

19 不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围 浓 度 （%） 标 准 (kb) 高强度 低熔点 低黏度低溶点(kb) 0.3 1~50 0.5
标 准 (kb) 高强度 低熔点 低黏度低溶点(kb) 0.3 1~50 0.5 0.7~25 0.8 0.5~15 0.8~10 1.0 0.25~12 0.4~8 1.2 0.15~6 0.3~7 1.5 0.08~4 0.2~4 2.0 0.1~3 3.0 0.05~1 0.5~1 4.0 0.1~0.5 6.0 0.01~0.1

20 琼脂糖凝胶电泳的注意事项 DNA分子带负电，从琼脂糖凝胶的负极向正极泳动，速度依赖于其分子质量。小的紧密的DNA分子的较大伸展片断容易穿过琼脂糖介质。依据所要分离的DNA分子的大小来选择琼脂糖的浓度。 注意： 1、 每孔点样的体积一般少于25ul。 2、 加一定量的蔗糖来增加样品的浓度，以使样品停留在点样孔中。 3、 加入水溶性的阴离子追踪染料（如溴酚蓝）。 4、 加入标准分子质量样品，根据已知分子质量的带相应位置做出标准曲线。 5、 电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。注意电泳期间，电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发。 6、 将胶浸没在1mg/L的溴化乙锭（EB）中，5min后即可看到DNA带。 7、 在紫外灯下可以看到DNA带，这种方法检测的界限是每条带约10ng 。 8、 要对某一条带（如质粒）进一步分析，可将含该带的凝胶切割下来，回收DNA

21 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小（1~100ug）、分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或单体与交联剂的比例，聚合成不同孔径大小的凝胶，可用于蛋白质、核酸等分子大小不同的物质的分离、定性和定量分析。还可结合解离剂十二烷基硫酸钠（SDS），以测定蛋白质亚基的相对分子质量。

22 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵(AP)以及加速剂四甲基乙二胺(TEMED)，四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基。 CH2=CH C=O NH2 丙烯酰胺 NH CH2 -CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH- C=O C=O NH NH C=O C=O NH NH2 N,N’-甲叉双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺 + 溶液的pH对聚合作用是重要的，因为过低pH没有足够的碱基加速催化反应，同样过多的氧分子存在，会使聚合作用很快停止。所以制备凝胶时，在加过硫酸铵之前，混合物必须抽去空气。核黄素催化的聚合作用，常用于制备浓缩胶，因为这样制得的凝胶孔度要大些。核黄素在光照射下及有微量氧存在时，产生自由基使Acr发生聚合作用。

23 聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好，其分辩力极高，甚至相差1bp的DNA段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的DNA，但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。

24 聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE胶的配制 50ml体系： 丙烯酰胺 有效分离（bp） 二甲苯青 溴酚蓝 丙烯酰胺30%（ml）
   二甲苯青 溴酚蓝   丙烯酰胺30%（ml） 10×TBE（ml）    ddH2O（ml）     TEMED（µl）   过硫酸铵10%（µl） 3.5%    460 100 5.83 5 39.17 25.0 250 5.0%   260 65 8.33 36.67 8.0%   60-400 160 45 13.33 31.67 12.0%   40-200 70 20 20.0 25.00 15.0%   25-150 60 15 20.00 20.0%   5-100 12 33.33 11.67

25 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类 1 变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离或纯化。
1 变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离或纯化。 变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。 用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用途：制备高纯度的DNA片段。

26 水平板式电泳槽 垂直板式电泳槽

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28 长玻璃板 短玻璃板 浓缩胶 分离胶

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30 SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白质

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32 凝胶的制备过程： 1、 按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。 2、 将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角。 3、 按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数。 4、 加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止。 5、 立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10°角，可减少液体泄漏的机会。 6、 室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1 X TBE缓冲液。 7、 小心取出梳子，加样。

33 核酸电泳指示剂的选择 指示剂：        核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似。 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有： 1、 增加样 品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 2、 在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置。 3、 使样品呈色，使加样操作更方便。

34 染色剂：    核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色。    溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min.琼脂 糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染 色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察。 　　银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收。

35 电泳缓冲液 常用的有TAE、TPE及TBE

36 TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较 都是常用电泳缓冲液。三者相比：
2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量； 3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%； 4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。

37 脉冲场凝胶电泳 pulsed-field gel electrophoresis PFGE

38 超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度（40kb）后DNA的迁移速率几乎与分子大小无关，而主要决定于电场强度。但 PEGE 解决了这一问题。
该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应叫交替电场凝胶电泳。

39 B+ A- +A -B 脉冲电场电泳示意图

40 A- +A B- +B A- +A B- +B 垂直交变电场系统 场翻转系统 A- +A B- +B - + 箝位匀强电场系统 旋转胶系统

41 蛋白质双向凝胶电泳

42 毛细管电泳

43 丙烯酰胺：3 ml TBE： 3 ml 水：9 ml AP：200 ul TEMED：20 ul