Speaker: Chen-Chuan Lee Adviser: Nien-Jen Hu

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1 Speaker: Chen-Chuan Lee Adviser: Nien-Jen Hu
The second messenger c-di-AMP inhibits the osmolyte uptake system OpuC in Staphylococcus aureus 16 August 2016 Vol 9 Issue 441 ra81 C-di-AMP會去抑制金黃色葡萄球菌的滲透壓的調節 Speaker: Chen-Chuan Lee Adviser: Nien-Jen Hu

2 Cyclic diadenosine monophosphate
Cyclic diadenosine monophosphate (c-di-AMP) is one such signaling nucleotide produced by Gram-positive bacteria . In S. aureus, c-di-AMP is produced by the adenylate cyclase DacA and degraded by the phosphodiesterase GdpP. 近幾年發現c-di-AMP是個在細菌內的二級訊號分子 背格蘭仕揚細菌所製造 c-di-AMP由兩個ATP經由環畫眉DacA形成 會被phosphodiesterase GdpP 環化酶作用 DacA 2 ATP c-di-AMP c-di-AMP

3 Differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA)
Binding assay Competing assay 之前研究是透過DRaCALA這個技術進行實驗 是個快速篩選 蛋白是否會結合ＣＤＡ 利用同位素標定的ligant跟蛋白混合 透過同位素標定的ligand 量化出protein 與CDA結合的能力 Negative colntrol 拿 K. G. Roelofs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528–15533 (2011).

4 C-di-AMP binding proteins
KtrA (RCK_C domain) CpaA (RCK_C domain) K+ Potassium channel Cation-proton antiporter 在之前研究中發現鉀離子通道KtrAb complex 的KtrA ＲＣＫ c domain會結合ＣＤＡ 陽離子與氫離子的antiporter的CpaA ＲＣＫ c domain也會結合ＣＤＡ 這兩個蛋2都會調控細胞滲透壓 所以可能是金黃色葡萄球菌對高滲透壓有高度的抵抗性 R. M. Corrigan Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 9084–9089 (2013)

5 Osmoprotection uptake system
Osmolyte: Proline osmolyte K+ [osmolyte] [K+] Carnitine 借下來要介紹金黃色葡萄球菌是要怎麼底抗滲透壓的改變 假如細胞外的地鉀離子濃度較高 正常來講細胞內的水會像外流來平衡滲透壓 但是這樣細菌脫水死亡 所以金黃色葡萄球菌有個保護機制 會把胛里子攝取進細胞讓包內鉀離子農上升 而不會脫水死網 同樣的機制也會用在運送osmolyte機制上 這幾個都是細菌所需要得分子 來保護細胞 water water [K+] [osmolyte] Choline Glycine betaine

6 Motivation Does c-di-AMP bind other receptor proteins in S. aureus ?
What is the biophysical role of c-di-AMP of the targeted protein? 作者想知道還有在金黃色葡萄球菌哪些蛋白會與ＣＤＡ結合？ 那會結合ＣＤＡ的蛋白在細胞內有哪些生理作用？

7 Searching the protein interact with c-di-AMP
Using the DRaCALA with an S. aureus ORFeome library. OpuCA is one of four genes in the OpuCA-OpuCD operon ,which encodes the ATP-binding cassette (ABC) osmoprotectant uptake system OpuC. OpuC operon 作者從之前所建立的黃金葡萄球菌gene library中表現出每個蛋白利用dracala 去篩選哪些蛋白會與ＣＤＡ結合 發現opuca這個蛋白會結合CDA Opuca是位在opuC operon其中一段基因 opuc system是一級主動運輸 會binding ATP的膜蛋白 A是 ATP binding site B D是穿膜區 Ｃ是recepter 是一個transpoter ＢＤ要同時有 opuCA是會結合ATP c-di-AMP 水通帶蛋白 啊跨proline

8 ABC transporter Primary active transporter: ATP hydrolysis
Substrate binding protein Transmembrane domain ATPase domain Substrate binding protein TM domain ＣＡ是個會結合ATP及ＣＤＡ 透過水ＡＴＰ產生能量 典型的ＡＢＣ tranpoter 會有 作者發現OpuCA會結合ＣＤＡ ATPase domain

9 C-di-AMP binds to His-MBP-OpuCA specifically
His-MBP(maltose-binding protein)-OpuCA fusion protein interacts with c-di- AMP (Kd)2.46 ± 0.14 uM. 作者先做出His MBP –opuCA 融合蛋白 MBP是個非常水溶性的蛋白 不會聚集 所以讓opuCA在水溶液中比較穩定 作者透過DRaCALA做出一個 作者也做了其他含有核苷酸的ligand是否會結合我們的opuCA 來看opuCA是否會結合其他核苷酸的ligand 發現只有c-di-AMP所測到的輻射量明憲降低 代表只有c-di-AMP會專一性binding opuCA 算是double check (Inner-background)/total=Fb pApA=c-di-AMP切一刀 是個ATPase卻結合不上ATP 可能是c-di-AMP結合到蛋白上 影響到ＡＴＰ binding ATP bunding site 跟 c-di-AMP的位置是不一樣

10 Domain of OpuCA interacts with c-di-AMP
There are three domains in OpuCA , ATPase domain,CBS1 and CBS2. CBS：cystathionine-β-synthase 透過虛列分為三個dimain 胱硫醚β合酶 作者不知道CDA那個domain會結合 所以作者分別純化出4個蛋白分別為 MBP opuCA ATPase CBS 需要證明 His-MBP不會結合ＣＤＡ 因為ＭＢＰ是個蛋白質 發現說ＣＢＳ會結合ＣＤＡ

11 C-di-AMP binds to OpuCA-CBS specifically
His-CBS interacted with c-di-AMP with a Kd of 2.86 ± 0.14 uM . This interaction was specific because only an excess of unlabeled c-di- AMP could compete for binding. 作者單獨純化出ＣＢＳ 透過DRaCALA 測ＫＤ 跟 剛剛全長的opuCA的KD值跟ＣＢＳ KD值接近 代表OpuCA的ＫＤ值就是CBS domain 的ＫＤ值 也驗證其他合核苷酸ligand部會結合 證明ＣＤＡ專一性結合到ＣＢＳ

12 C-di-AMP only binds to OpuCA-CBS protein
C-di-AMP interacts specifically with the CBS domains of OpuCA but does not interact with other S. aureus proteins that contain CBS domains . 作者想說是不是有ＣＢＳ domain的蛋白 都能結合ＣＤＡ 將library中找出含有ＣＢＳdomain的蛋白質 進行旭列對比 去尋找是否有高度保留的序列 含有ＣＢＳdomain的蛋白質序列只有23%的相似度 沒有高度保留的序列 作者不知道個幾個蛋白質會不會結合ＣＤＡ 所以作者過表現出各個蛋白 做DRaCALA 發先只有ＯpuCA才會結合ＣＤＡ 這裡的sample沒純化 發現只有opuca有結合ＣＤＡ 之前已經證明opuCA是ＣＢＳ傑和ＣＤＡ 不需要進一步純化

13 Crystal structure of OpuCA CBS domain
The CBS1 (residues 250 to 306) and CBS2 (residues 320 to 369) modules have a highly similar β⍺ββ⍺ fold. 作者經由X-ray解出CBＳdomain的結構 ＣＢＳ1 CBS2 非常相似β⍺ββ⍺ fold 去計算ＣＢＳ12 RMSD 0.7A 作者有加ＣＤＡ去結晶 晶體卻沒有發現ＣＤＡ的電子密度 只得到ＣＢＳdomain 的結構 R.M.S.D= 0.7Å

14 OpuCA-CBS aligns with MJ0100
Structural homologs of the OpuCA CBS domain, MJ0100. The CBS domain protein MJ0100 from Methanocaldococcus jannaschii. S-adenosylmethionine (SAM) R.M.S.D= 1.4Å 作者想知道ＣＤＡ binding 的位置 所以拿所以解出來的結構與BCS相似的結構 來比對 找到嗜熱甲碗箘 有結合腺苷甲硫氨酸（ＳＡＭ） RMSD1.4A SAM的鹼基會與ＭＪ0100的Ｉ434有疏水性作用 ＳＡＭ的五炭糖會與Ｄ439形成氫鍵 所以作者懷疑ＣＤＡ也是節盒在這兩個domain之間

15 Electrostatic surface analysis
The OpuCA CBS domains also have a positively charged cleft at the location corresponding to the SAM-binding site in protein MJ0100. 作者比較了opuCA和MJ0100的蛋白質表面帶電性 ＳＡＭ結合的區域是帶正電 ＯＰＵＣＡ的ＣＢＳ domain 之間也是帶正電的 由於ＣＤＡ上是有林酸根 有可能跟帶正電氨基酸有interaction 所以作者更加認為ＣＤＡ可能結合在兩個domain之間 在這張圖看不到結合位 可能是不帶電

16 OpuCA-CBS mutation site
In previous structure, aromatic amino acids including tyrosine (Tyr, Y) or phenylalanine (Phe, F) residues provided key base-stacking interactions with the nucleotide ligand. 之前研究顯示分香族的Ｐhe Tyr 會與核甘酸的ligand 行程 苯環與苯環堆疊的作用力 作者從domain之間選出 都是分香族的氨基酸 加以突變成ala 來破壞本環堆疊的作用力 除了過表現突變的蛋白 還有從 之後的氨基酸才檢調的蛋白 鐔贏DRaCALA實驗

17 DRaCALA of Variants Mutants showed drastically reduced binding with c-di–AMP. 發先 F283A F294A 365 是不會結合ＣＤＡ 打星號的是有顯著差異的 這說明了F283 F294會與ＣＤＡ有interaction 365沒有結合ＣＤＡ 作者說明 可能是少了後續的氨基酸導致ＣＢＳ protein 摺疊不正確 造成不會結合ＣＤＡ 純化出這三的蛋白測與ＣＤＡ的ＫＤ值 365純畫不出來 從ＫＤ值可發現突變組語ＣＤＡ的親盒力根ＷＴ比 有明顯的下降 這證明F283 F294與ＣＤＡbinding有很大的關係

18 C-di-AMP binding site in OpuCA-CBS
從晶體結構找出F283 F294的電子密度 就是這兩個地方 作者認為ＣＤＡ可能ＣＢＳ 的兩個Phe 有interaction

19 Functional characterization of OpuC
A previous study suggested that the S. aureus OpuC system is a choline transporter. Using the wild-type S. aureus strain LAC*, LAC* cells lacking opuCA (△opuCA) and a complementation strain △ opuCA cells (opuCA complementation). 接下來作者想知道opuC作用機制是什麼 運送什麼osmolyte？ 在先前研究指出 ＯpuC system is a choline transporter 作者利用三株菌株 ＬＡＣ 來進行實驗 ＣＰＭ＝美分中有多少劑量 從data發現三株菌株都會運送choline 即使缺乏opuCA choline還是有被運輸 作者猜測可是Ｍ9培養基讓細菌生長得不夠快 所以換乘ＣＤＭ 代表說ＯＰＵＣ不是服則運書choline 先前文獻有錯誤 等位基因交換 M9 CDM 菌株生長速度不同 可能認為Ｍ9陪癢機 表現蛋白不夠多導致節驗結果無法區別差異

20 Functional characterization of OpuC
Study shows OpuC systems involved in the uptake of the compatible solutes glycine betaine or carnitine. 之前文獻說明opuC system還可以transport glycine betaine or carnitine 所以作者了uptake glycine betaine or carnitine 的實驗 在uptake glycine betaine 實驗發現三株菌株uptake glycine betaine 能力差不多 所以opuC也不是負責運輸glycine betaine 但在carnitine 發現 只有缺少opuCA菌株 uptake carnitine 能力有明憲下降 代表說opuC system負責運輸carnitine

21 C-di-AMP influences the activity of the OpuC transporter
△gdpP: wild-type without phosphodiesterase ,GdpP. C-di-AMP negatively affects the activity of the S. aureus OpuC transporter. 接下作者想知道ＣＤＡ濃度是否會影想Uptake carnitine 能力 ＷＴ以及缺少phosphodiesterase 缺少phosphodiesterase的菌株細胞內ＣＤＡ會上升 發現缺少phosphodiesterase的菌株uptake carnitione 能力下降 證明說ＣＤＡ濃度上升會去抑制opuC system 的能力

22 Conclusion F283 and F294 in CBS domain of OpuCA are likely to compose the c-di-AMP binding site. OpuC, which is an ABC transporter, might involve in carnitine uptake in S. aureus. OpuC-carnitine uptake system is inhibited by binding c-di-AMP to CBS domain and thus influences the ATPase activity. F283 and F294 在opuCA CBS domain 很有可能是c-di-AMP binding site 本篇定義了金黃色葡萄球菌OpuC 是個ＡＢＣtranspoter 可能涉及carnitine的uptake ＣＢＳ domain 結合ＣＤＡ 影響到OpuC 的ATPase 的活性 進一步抑制 uptake carnitine的能力倍

23 Thanks for listening