分子克隆工具酶及其应用.

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1 分子克隆工具酶及其应用

2 分子克隆工具酶及其应用 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化
核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。

3 第一节 限制性内切核酸酶

4 一    . 限制性内切酶的发现 1. 细菌限制修饰系统的发现 Werner Arber于 年发现，1968年分离到I型限制酶。 2. 限制酶HindII的发现 H．O．Smith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。 3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制 D. Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。

5 二  . 限制修饰系统的种类 1. I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。 2. II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ. coli中这两种基因位于质粒上。 3. III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。 上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。

6 三. 限制性内切酶的定义、命名 2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制酶。 2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 　例如：HindⅢ　　前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)

7 四．限制酶的特点 １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC ２）富含ＧＣ
1. 识别顺序和酶切位点 １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突起 ２）富含ＧＣ

8 2. 末端种类 EcoRI 5’-G A A T T C-3’ ４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外
３）对称性—双对称 EcoRI 5’-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’ ４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外 ５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ 2.  末端种类 １）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸 Pst I 5’-CTGCAG-3’ ’-CTGCA G-3’ 3’-GACGTC-5’ ’-G ACGTC-5’ ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸 EcoRI 5’-GAATTC-3’ ’-GOH PAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ ’-CTTAAP HOG-5’

9 SmaI 5’-CCCGGG-3’ 5’-CCC GGG-3’
３） 平齐末端 SmaI 5’-CCCGGG-3’ ’-CCC GGG-3’ 3’-GGGCCC-5’ ’-GGG CCC-5’ ４）非互补的粘性末端 ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’ ’-GGATG(N)9 3’-CCTAC(Ｎ)13-5’ ’-CCTAC(N)13 ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI AvaI 5’-CPyCGPuG-3’ CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG

10 ５）相容性末端 如：BamHI G GATCC BglII A GATCT MboI, Sau3AI N GATCN 上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识别机率只有1/16。 BamHI + MboI A/C/G/T GATCT/C/G/A BamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。 BamHI + BglII A/G GATCT/C 不同末端的连接特性: 除第4种末端不能进行不同DNA分子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余4种末端可以相互连接。

11 五. 异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）
1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制 酶 2. 特点：1）识别相同顺序 2）切割位点的异同 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG 限制酶的星反应（star activity） 1. 特点: 限制酶识别序列特异性降低 2. 发生星反应的限制酶和条件（见下页） 3. 星反应的利用和避免

12 表1 具有星反应的限制性内切酶与条件 限制酶 诱发星活性的条件a 识别序列 AvaI 1, 2, 4
BamHI , G GATCN, G PuATCC BstI , 4 BsuI , 4, 6 EcoRI , 2, N AATTN HaeⅢ , 4 HhaI , 4, 7 HindⅢ HpaI , 2, 4 PstI , 2, 4, 7 PvuⅡ , 4 SalI , 2, 4, 7 ScaI , 8 SstⅡ , 4 XbaI , 4, 7 a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μg)； 5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5; 7:二甲基亚砜(8%); 8:无NaCl。

13 七. 其它特异性的内切酶及其用途 由内含子编码，用于rRNA的剪切，出现的频率约418 = 6.9 X 1010 bp，其识别顺序为
1. λ末端酶（λ terminase）： 5’-GGGCGGCGACCTN--3’ N--5’，出现的频率约412 分子量为 117,000 = 1 A（74,000）+ 2 Nul（21,000） 2. Omega核酸酶（I-SceI）： 由内含子编码，用于rRNA的剪切，出现的频率约418 = 6.9 X 1010 bp，其识别顺序为 5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’ TATT 3. I-PpoI：来自于Physarum polycephalum 识别序列： CTCTCTTAA GGTAGC AATT 4. 用途 遗传标记， 构建载体

14 八. 限制酶的用途 附：IIS型限制酶的特点 2. 限制酶（物理）图谱绘制 3. 突变分析（RFLP分析） 4. 限制酶的部分酶切与完全酶切
1.     DNA重组 2.     限制酶（物理）图谱绘制 3.     突变分析（RFLP分析） 限制酶的部分酶切与完全酶切 附：IIS型限制酶的特点 1.     具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构。 2.     酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，1-- 20nt。 3.     酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。 4.     产生粘性末端可以是1--5个核苷酸。 5.     均为单体，分子量为47—108 kD。

15 第二节 DNA 甲 基 化 酶

16 一. 甲基化酶的种类与识别顺序 1. 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶
三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤： 在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。 如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同 M．HpaI C mCGG HpaI C CGG 相同

17 2. E．coli 的dam、dcm甲基化酶 3. 哺乳动物的甲基化酶 dam G mATC， dcm C mCA/TGG
这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。 dam G mATC， dcm C mCA/TGG 3. 哺乳动物的甲基化酶 该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与DNA复制、基因转录等过程有关。 4. E．coli中依赖于甲基化的限制修饰系统mrr（mA/A）、mcr(Am5CG)、merB（Pum5C）

18 二. 甲基化酶活性对限制酶活性的影响 1. dcm 和dam甲基化酶对限制酶的影响
1）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全重叠还是边界重叠 如：完全重叠 BclI—dam(GATC)；ScrFI—dcm(CCA/TGG) 边界重叠 ClaI--dam； Sau96I--dcm 2）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠 如：dam--BamHI，Sau3AI，BglII，PvuI； dcm--BstNI

19 表2 对甲基化敏感的限制性内切酶 限制酶 识别序列* 甲基化酶 AvaⅡ GG(A/T)CC(A/T)GG dcm
表2 对甲基化敏感的限制性内切酶 限制酶 　　　识别序列* 　　 甲基化酶 AvaⅡ GG(A/T)CC(A/T)GG dcm BclⅠ TGATCA dam ClaⅠ GATCGAT dam EcoRⅡ CC(A/T)GG dcm HphⅠ GGTGATC dam MboⅠ GATC dam NruⅠ GATCGCGA dam Sau96Ⅰ GGNCC(A/T)GG dcm SauFⅠ CC(A/T)GG dcm StuⅠ AGGCCTGG dcm TagⅠ GATCGA dam XbaⅠ TCTAGATC dam *下横线字母表示限制酶识别序列, 绿色字母表示dam甲基化酶识别序列,红色字母表示dcm甲基化酶识别序列

20 2. II型甲基化酶对限制酶活性的影响 3. 甲基化酶的用途 １） 抑制同种限制酶的活性
M.BamHI GGATmCC—BamHI(GGATCC) M.EcoRI GAmATTC—EcoRI(GAATTC) ２） 抑制不同种限制酶的活性 a. 顺序完全重叠 如：M. ClaI（ATCGmAT）----TaqI（TCGmA） b. 顺序边界重叠 如：M. BamHI（GGATmCC）----MepI（mCCGG） ３） 抑制不同种限制酶的部分活性 M．TaqI（TCGmA）---HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC 3.     甲基化酶的用途 １） 改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成 ２） 在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切

21 表3 甲基化酶与识别序列 甲基化酶 识别序列a 受甲基化影响的限制酶b M.AluⅠ AGmCT AluⅠ, BamHⅡ, Bsp1286
表3 甲基化酶与识别序列 甲基化酶 　　识别序列a　　 受甲基化影响的限制酶b M.AluⅠ AGmCT AluⅠ, BamHⅡ, Bsp1286 DdeⅠ,HgiAⅠ, NheⅠ, PstⅠ M.BamHⅠ GGATmCC BamHⅠ, MspⅠ M.ClaⅠ ATCGmAT ClaⅠ, MboⅠ, TaqⅠ dam GmATC c dcm CCA/TGG c M.EcoRⅠ GAmATTC EcoRⅠ M.HId GCNGC GGmCC MstⅠ, PstⅠ, PvuⅡ M.HaeⅢ GGmCC BanⅡ,BglⅠ,Bsp1286,BstXⅠ,HaeⅢ, MspⅠ,NaeⅠ,NcoⅠ,SacⅡ, Sau96Ⅰ M.HhaⅠ GmCGC AhaⅡ, FnuDⅡ, HhaⅠ M.HpaⅡ CmCGG AhaⅡ,AvaⅠ,AvaⅡ,HpaⅡ,ScrFⅠ M.HphⅠ TmCACC HinfⅠ, HphⅠ, Sau3AⅠ M.MspⅠ mCCGG BamHⅠ, MspⅠ M.PstⅠ CTGCmAG AluⅠ, PstⅠ M.TaqⅠ TCGmA AluI, AvaⅠ, EcoRV, HinCⅡ, HinfⅠ, MboⅠ, TaqⅠ, XmnⅠ a.标在碱基的左上角的m表示该碱基被甲基化; b.所列出的限制酶均已商品化; c.参见表2; d.M.HI分离自噬菌体污染的细菌细胞，它可识别两个序列，GCNGC的甲基化位点尚未确定。

22 M.RE CH3 RE 与载体相连 甲基 化酶 人工 接头 用于基因组文库的建立 用于cDNA的连接

23 第三节 核 酸 酶

24 ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口 缺口(gap) 切口(nick) 断口(cut) 3'HO P5'

25 一. 外切酶III（ExoIII） 2) 核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子，pH 7.6-8.5
1. 一般特点： 来自于E.coli，分子量28,000 kD 2. 催化反应类型 1) 外切酶活性：3’ 5’，产生5’-单磷酸核苷酸和具各种结构的 ds-DNA，pH 2) 核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子，pH 3) 3’-磷酸酶活性：除去3’-磷酸基后形成3’-OH端，有利于DNA聚合酶反应，pH 4) 内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，pH

26 2) 碱基释放速度：C>>A-T>>G
3.  外切酶活性特点 1) 反应底物：互补ds-DNA 2) 碱基释放速度：C>>A-T>>G 3) 反应产物：5’-单磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的ds-DNA，过度反应将导致DNA降解 4.  用途 1)    核酸（DNA）标记 2)    基因突变----缺失 3)    DNA序列测定时作顺序缺失 5.  使用注意事项 1)    正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度 2)    在一定条件下，ExoIII不能作用GC富集区(来自于cDNA加尾)

27 ExoIII的外切酶和RNaseH的作用
5'P 3'HO OH3' P5' RNaseH

28 ExoIII用于顺序缺失 用于 DNA 标记 5'P P5' 3'HO OH3' 1 2 3 4 a b c 2 3 4 a b c
dCTP 5'P P5' 3'HO OH3' 用于 DNA 标记 a b c a b c 3 4 a b c 4 a b c a b c ExoIII用于顺序缺失

29 二. λ外切酶 2) 作用方向与产物：5’ 3’; 产生5’-P核苷和3’-突起的ds-DNA 1. 反应特点
1) 作用底物: 要求5’-PO4基; 不作用含切口的DNA分子 2) 作用方向与产物：5’ 3’; 产生5’-P核苷和3’-突起的ds-DNA 2. 用途：DNA定序测定; 除去5’-端突起，产生3’-端突起，便于加尾 3’ HO OH 3’ 5’ P P 5’ AAAAAA TdT+dATP

30 三. 核酸酶Bal31 2) 作用方向与产物：5’ 3’和3’ 5’同时进行，但反应速度不同； 产生5’-单磷酸核苷和缩短的ds-DNA
1.  一般特点：胞外酶；具DNase和 RNase 活性；由“快”和“慢”两种成分构成 2.  催化反应特点 1) 底物：ss-DNA，ds-DNA，RNA(外切与内切活性) 2) 作用方向与产物：5’ 3’和3’ 5’同时进行，但反应速度不同； 产生5’-单磷酸核苷和缩短的ds-DNA 3.  用途： 基因突变--缺失; 绘制限制酶谱; DNA定序(与ExoIII相同)，其优点是Bal31酶活依赖于Ca++和Mg++，Ca++在反应完毕后可用EGTA（乙二醇四乙酸）灭活而不影响Mg++浓度，后者是限制酶活性必需的 4. 使用注意事项： 1) 应作预备实验，因每批酶制品的“快”“慢”酶含量不同 2) DNA两条链碱基组成不同，终止反应时存在单链突起，需要补平

31 核酸酶Bal31的活性 5'P P5' 3'HO OH3'

32 四. 核酸酶S1 1) 避免长时间反应，因最适酸性pH将导致DNA断裂或降解 2) DNA定序分析 3) S1作图法 4) 基因结构分析
2. 催化反应类型: ss-DNA; ss-RNA; 双螺旋变性区 3. 用途 1) 基因突变--缺失，常与外切酶，如ExoIII、λ外切酶、Bal31连用 2) DNA定序分析 3) S1作图法 4) 基因结构分析 5) tRNA结构分析 4. 使用注意事项 1) 避免长时间反应，因最适酸性pH将导致DNA断裂或降解 2) 避免使用高浓度酶量，以免DNA被降解(因产生切口)

33 ExoIII S1 Poly(A) 5' 核酸酶S1活性

34 五. 绿豆核酸酶 六. 外切酶Ⅶ 除去单链DNA形成平整末端 用于短链RNA和 DNA的定序分析
1.  与S1酶相同点：作用于ss-DNA和RNA，对5’-端的突起核苷酸作用速度为GC>>AT 2.  与S1酶的不同点 最适pH接近中性，不会产生切口; 不使具切口的ds-DNA断裂 3. 用途：与S1酶相同 六. 外切酶Ⅶ 作用于ss-DNA的3’- 与5’-端，产物为低聚核苷酸 除去单链DNA形成平整末端 七. 牛脾磷酸二酯酶 作用含5’-羟基端的ss-DNA和RNA，产生3’-单磷酸核苷 用于短链RNA和 DNA的定序分析

35 表4 几种常用外切酶的特点 外切酶 作用方向 作用底物 反应产物 用于RNA和DNA的定序分析
八. 蛇毒磷酸二酯酶 作用3’-羟基单、双链DNA和RNA，产生5’-单磷酸核苷 用于RNA和DNA的定序分析 表4 几种常用外切酶的特点 外切酶 作用方向 作用底物 反应产物 ExoIII ’→5’ dsDNA 单核苷酸 λ外切酶 ’→3’ ss和dsDNA 同上 Bal ’→5’和5’→3’ ss和dsDNA, RNA 同上 S ’→5’和5’→3’ ssRNA和ss DNA 低、核苷酸 绿豆核酸酶 3’→5’和5’→3’ ssRNA和ss DNA 同上 Exo VII ’→5’和5’→3’ ssDNA 低聚核苷酸 牛脾磷酸二酯酶 5’→3’ ssRNA，ss DNA 同上 蛇毒磷酸二酯酶 3’→5’ ss，ds RNA和DNA 同上

36 九. RNase 大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。RNase的识别序列和特点见表5。 1. RNase A分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100℃加热15min仍具活性）, 用于除去DNA样品中的RNA分子 2. 核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源mRNA 十. RNase H 作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去DNA链以便第二条链cDNA链的合成。

37 表5 核糖核酸酶反应特点 核酸酶 特异性反应 核酸酶 特异性反应 A Pyp/N PhyM Ap/N或 Up/N
表5 核糖核酸酶反应特点 核酸酶 特异性反应 核酸酶 特异性反应 A Pyp/N PhyM Ap/N或 Up/N CL3 Cp/N, Ap/N和Cp/N B.cereus Cp/N, Up/N T Gp/N P 无特异性反应 T 无特异性反应 S Np/A和 Np/U U Pup/N或Ap/N Phy Ap/N,Gp/N和Up/N

38 十一. DNase I 1. 特点：具内切酶活性，作用于ds -DNA，但无核苷酸序列特异型，产生5’-P低聚核苷酸; Ca2+ , Mg 2+ 或Ca2+ , Mn2+可使酶活达最大值 当酶浓度很低时，ds -DNA分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg 2+存在时，两条链上的切口独立无关Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置 2. 用途 1) 切口移位，制备DNA探针 2) 制备RNA样品时除去DNA分子 3) 基因突变时产生切口

39 DNaseI 作用特点 DNaseI与 Pol I 的 切口移位
Mn++存在时 Mg++存在时 DNaseI 作用特点 DNaseI HO P 5’ 3’ DNaseI与 Pol I 的 切口移位 Pol I

40 第四节 DNA 聚 合 酶

41 pol III 参与DNA复制, 具3’→5’和5’→3’外切酶活性
一  . E.coli DNA聚合酶I（polI） 1. E.coli 的DNA聚合酶系统 Pol I 参与DNA修复, 具3’→5’和5’→3’外切酶活性 pol II 同上 具3’→5’外切酶活性 pol III 参与DNA复制, 具3’→5’和5’→3’外切酶活性 2. E.coli polI的特点 1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段, polIK) 2） 聚合酶活性，5’→3’, 要求3’-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响（表6） 3） 外切酶活性

42 表6 E.coli DNA PolI 的延续性 2） 补齐5’-突起端 3） 合成第二条cDNA
3. 用途 1） 除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时） 2） 补齐5’-突起端 3） 合成第二条cDNA 4） 切口移位制备探针 其中用途2) 和3)常用大片段 表6 E.coli DNA PolI 的延续性 DNA模板-引物类型 反应条件 延续性(碱基数) 切口 ColE °C, 低盐 缺口 ColE °C, 低盐 切口/缺口胸腺DNA °C, 低盐 poly d(AT) °C, 低盐 poly d(AT) °C, 低盐 poly d(AT) °C, 高盐

43 二. T4 DNA聚合酶 1. 特点： 5’→3’聚合酶活性，1500 nt/min, 为pol I的两倍 3’→5’外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA, 其切除速度分别为40和 4000nt/min 2. 用途： 制备高比活性探针(1010 cpm/μgDNA); DNA末端修饰---缺失 外切酶活性 聚合酶活性 无dNTP dNTP 5’CAGCAACGT ’ dATP CAGCAACGT ’ S1 T ’ 3’GTCGTTGCA ’T4聚合酶 A ’ A ’

44 三. 反转录酶 2）聚合酶活性 a. RNA，DNA引物（大于8 nt）→cDNA链 b．DNA-RNA引物→互补DNA链
1. AMV反转录酶 1） 结构与酶活性 反转录酶以α，αβ，ββ形式存在，其中β（无活性）→P32（内切酶活性）+α→聚合酶 + P24（RNase H活性），各步反应由蛋白酶催化 2）聚合酶活性 a. RNA，DNA引物（大于8 nt）→cDNA链 b．DNA-RNA引物→互补DNA链 c．(rA)1100→(dT)12-18→(dT)n or (rc)n..dG n→(dG) n

45 反转录酶的结构和活性 5’ AAAAA3’ 引物 5’ AAAAA 3’ 反转录反应 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’
ββ αβ α P24 190 kD kD kD kD P32 RNaseH 聚合酶 5’ AAAAA3’ 引物 5’ AAAAA 3’ TTTTT 5’ 反转录反应 5’ ’ ’ ’ 3’ ’ ’ ’ 全长cDNA 提前终止反应

46 2. M-MLV反转录酶 不具内切酶活性; RNase H活性低; 稳定性差
1) 特点： 不具内切酶活性; RNase H活性低; 稳定性差 2) 与AMV反转录酶比较 a．合成短链cDNA(0.6 kb)时，两者相同，但M- MLV反转录酶需要量大，可能与其稳定性差有关 b．合成长链cDNA( kb)时，它比AMV反转录酶有效得多，这与它无内切酶活性有关。 3) 用途 a. cDNA合成用于文库建立; b. 制备cDNA探针; c. DNA序列分析; d. 填补5’-突起末端以获平端

47 四. Taq DNA聚合酶 1. 特点： 分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75℃， 对95℃高温具良好稳定性，该酶不存在3’→5’外切酶活性 2. 用途： 主要用于DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA 分子因而可被扩增4×106倍 DNA扩增技术又称为聚合酶链式反应，它包括以下三个步骤： DNA模板变性(95℃) → 与DNA引物退火(45℃) → 引物延伸(75℃)

48 Taq Pol 和PCR 5’ 3’ 引物 5’ 3’ 变性 3’ 5’ 3’ 5’ 复性 5’ 3’ 5’ 3’
5’ ’ 变性 3’ ’ 5’ ’ 引物 3’ ’ 复性 5’ ’ ’ ’ 3’ ’ 引物 3’ ’ 5’ ’ 延伸 5’ ’ 3’ ’

49 五. DNA定序酶 用基因工程方法去除3’→5’外切酶活性的Taq DNA聚合酶 六. Tth DNA聚合酶 93kD，75℃，含有二级结构DNA分子的定序 七. Tli DNA聚合酶 100℃仍具酶活，3’→5’外切酶活性，85 kD DNA的切平反应和补平反应 DNA聚合酶和核酸酶S1或绿豆核酸酶连用, 可用于 DNA末端结构的修饰

50 切平反应和补平反应 5’—AAGCTT—3’ HindIII 5’—A AGCTT—3’
3’—TTCGAA—5’ ’—TTCGA A—5’ S dNTP+ klenow frag 5’—A T—3’ ’—AAGCT AGCTT—3’ 3’—T A—5’ ’—TTCGA TCGAA—5’ T4 DNA连接酶 T4 DNA连接酶 5’—AT—3’ ’—AAGCTAGCTT—3’ 3’—TA—5’ ’—TTCGATCGAA—5’

51 四种不同补平反应 5’-GGATCC-3’ BamHI 5’-G GATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’ 3’-CCTAG G-5’
dNTP dGTP dGTP/dATP dGTP/dATP/dTTP 5’-GGATC ’-GG ’-GGA ’-GGAT 3’-CCTAG ’-CCTAG ’-CCTAG ’-CCTAG GATCC-3’ GATCC-3’ GATCC-3’ GATCC-3’ CTAGG-5’ GG-5’ AGG-5’ TAGG-5’ I S S S1 5’-GG CC-3’ ’-GGA TCC-3’ ’-GGAT ATCC-3’ 3’-CC GG-5’ ’-CCT AGG-5’ ’-CCTA TAGG-5’ II III Ⅳ

52 第 五 节 RNA 聚 合 酶

53 依赖于DNA的RNA聚合酶，具SP6启动子特异型 主要用于RNA分子的体外合成，RNA分子可用于：
1、特点： 依赖于DNA的RNA聚合酶，具SP6启动子特异型 2、用途： 主要用于RNA分子的体外合成，RNA分子可用于： 1） RNA分子的拼接研究 2） 标记的RNA常用于杂交，RNA-DNA比DNA-DNA分子更稳定，两条链均可标记，产生的RNA具高放射比活性 3） DNA的定序分析 4） 基因结构的研究，其中包括内含子数目，长度和位置 5） 还可以用于蛋白质的合成研究

54 RNA 聚 合 酶 活 性

55 二. T7 RNA聚合酶 三. T3 RNA聚合酶 四. E.coli RNA聚合酶 五. 多聚核苷酸磷酸化酶
基因启动子识别的特异性比较：SP6>T7>T3 四. E.coli RNA聚合酶 五. 多聚核苷酸磷酸化酶

56 第 六 节 连 接 酶

57 一. T4 DNA连接酶 只连接ds -DNA分子，要求3’-羟基和5’-磷酸基 1) 相同或相容粘性末端的连接 3. 抑制剂：
1. 特点： 只连接ds -DNA分子，要求3’-羟基和5’-磷酸基 2. 用途： 1) 相同或相容粘性末端的连接 2) 平整末端的相连 DNA平端来源：限制酶作用结果; 限制酶与其它酶共同作用结果 。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多 3. 抑制剂： PO43->5mM , NaCl>25mM, Ca++>0.1mM

58 T4 DNA连接酶的连接反应(两种插入方向)
5’-AAGCTT-3’ ’-AOH PAGCTT-3’ PAGCTT AOH 3’-TTCGAA-5’ ’-TTCGAP HOA-5’ HOA TTCGAP 退火 5’-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3’ 3’-T TCGAPOHA T TCGAPOHA-5’ 或 T4 DNA连接酶 　　　　　　 5’-AAGCTT AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA TTCGAA-5’ 　　 ’-AAGCTT AAGCTT-3’ +

59 二. E.coli DNA连接酶 三. T4 RNA连接酶 RNA连接酶活性
只能连接具粘性末端DNA分子，以NAD作辅助因子 三. T4 RNA连接酶 参与单链RNA分子的连接。主要用于提高T4 DNA连接酶在连接反应中的连接效率（20倍） RNA连接酶活性 HO P HO P HO P 5’ ’ 5’ ’ 5’ ’

60 第七节 核 酸 末 端 修 饰 酶

61 一. 细菌碱性磷酸酶（BAP） 二. 牛小肠碱性磷酸酶（CIP） 1. 特点 2. 用途 2) 对热稳定 2) 核酸末端标记
1.  特点 1) 除去ss-DNA，ds-DNA 和RNA分子两端的3’-和5’-磷酸基 2) 对热稳定 2.  用途 1) 载体DNA的去磷酸化，防止自我连接，以增加重组频率 2) 核酸末端标记 二. 牛小肠碱性磷酸酶（CIP） 与BAP相同，只是CIP对热敏感

62 磷酸酶(I)与磷酸激酶(II)活性 磷酸激酶的交换反应 I II [γ-32P]ATP ATP
5’ P OH3’ ’HO OH3’ ’ P OH 3’ 3’HO P 5’ ’HO OH5’ ’HO P 5’ 磷酸激酶的交换反应 [γ-32P]ATP ATP 5’ P OH 3’ ’ 32P OH 3’ 3’HO P 5’ ’ HO P 5’

63 三. T4 多聚核苷酸激酶 1. 催化反应类型 2. 用途 ⅰ.转移反应； ⅱ.交换反应 2) 3’-磷酸酶活性（pH 5-6）
1.  催化反应类型 1)   激酶活性（5’-磷酸化酶）：可将ATP中的γ位的磷酸基转移到ss-DNA，ds-DNA和RNA分子的5’-羟基端，在这反应过程中可有两种方式进行（pH7.5-8） ⅰ.转移反应； ⅱ.交换反应 2) 3’-磷酸酶活性（pH 5-6） 2.  用途 1) 5’-端末端标记 2) 分子克隆过程中以获得5’-磷酸基末端，便于连接酶反应

64 四. 末端转移酶（TdT） 二甲基砷酸盐缓冲液和Mg2+可提高嘌呤核苷酸的掺入速度，而Ca2+可提高嘧啶掺入速度 3’-末端标记
1. 反应特点 底物：dNTP及衍生物，>3个核苷酸，要求3’-OH端，需要ss-DNA作为引物，以3’-突起端的ds-DNA 为最高，亦可用于ds-DNA加尾 2. 核苷酸掺入速度 二甲基砷酸盐缓冲液和Mg2+可提高嘌呤核苷酸的掺入速度，而Ca2+可提高嘧啶掺入速度 3. 用途 3’-加尾，便于两DNA分子重组; 3’-末端标记

65 五. 多聚腺嘌呤聚合酶 六. 烟草酸性焦磷酸酶 七. 鸟苷酸转移酶 m7Gp-p-p-Xp-Yp-mRNA p-Xp-Yp-mRNA
该酶是在RNA分子的3’-端（OH）加上一个多聚A的尾巴，其用途可标记RNA和 加尾的RNA，可用于cDNA的合成 六. 烟草酸性焦磷酸酶 可除去mRNA帽子结构中的焦磷酸: m7Gp-p-p-Xp-Yp-mRNA p-Xp-Yp-mRNA 七. 鸟苷酸转移酶 1. 催化类型 RNA三磷酸酶: pppN(pN)n ppN(pN)n + Pi 鸟苷酸转移酶: [α-32P]GTP + ppN(pN)n G32pppN(pN)n + PPi RNA甲基转移酶: AdoMet + G(5’)pppN(pN)n m7G(5’)pppN(pN)n + AdoHCy           2. 用途：标记DNA

66 第八节 其 它 酶 类

67 1. 原生质体的制备酶类 2. 蛋白质降解酶类 3. 检测酶类 制备原生质体目的：外源DNA导入；核酸和蛋白质的提取
1. 原生质体的制备酶类 制备原生质体目的：外源DNA导入；核酸和蛋白质的提取 溶菌酶， zymolyase，glusulase，NovoZyme，溶壁酶，纤维素酶 2. 蛋白质降解酶类 蛋白酶K 3. 检测酶类 抗生蛋白链素β-半乳糖苷酶, 碱性磷酸酶, 辣根过氧化物酶

68 练 习 题

69 1. 一种DNA分子经三种限制酶完全酶切后得如下结果：
EcoRI 5kb EcoRI/HindIII 1、2、3、4kb HindIII 3kb 、7kb EcoRI/PstI 、3、5kb PstI kb HindIII/PstI 、3、6kb 将各限制酶位点绘制在DNA分子上。 2. 另一DNA分子经相同处理后得如下结果，将各限制酶位点标在DNA分子上。 EcoRI 1、3、6kb EcoRI/HindIII 1、3kb HindIII 4、6kb EcoRI/PstI 、3、5kb PstI 2、8kb HindIII/PstI 、6kb 3.下图中的一段DNA分子上有两个限制酶PstI和EcoRI识别位点，两位点相距10bp，现有一研究生要分析EcoRI右侧500bp区域内的功能，他需要在这一区域内获得各种缺失突变体以确定某功能区，他应如何设计此实验？假定EcoRI—PstI间的10bp除去后并不影响任何结果分析，但PstI位点左侧的DNA不能除去

70 4. 假如PstI位点为另一限制酶HindIII，实验又该如何设计？
10bp 500bp PstI EcoRI 4. 假如PstI位点为另一限制酶HindIII，实验又该如何设计？ 5. 现有一研究者打算将一EcoRI DNA片段克隆到另一个DNA分子的BamHI位点以便DNA扩增，但扩增后的DNA分子又可用BamHI限制酶将插入的片段回收，如何设计此实验。 6. 一研究生要将一质粒（pI）上的BamHI-HindIII片段取代另一质粒（pII）上的BamHI-XbaI片段，所获重组质粒（pIII）上的插入片段要求能用BamHI-HindIII进行回收，问如何设计此实验？ 10bp 500bp HindIII EcoRI

71 7. 现有一重组质粒的限制酶谱和克隆到的基因转录方向入图所示：
H Xb H 5kb pI 1kb 6kb pII .5kb 6kb pIII 1kb B B B 7. 现有一重组质粒的限制酶谱和克隆到的基因转录方向入图所示： 已知HindIII克隆片段中的BamHI（3kb）片段含有一完整的基因编码区，现要将此3kb的BamHI片段克隆到另一表达载体pB的BamHI位点，如何才能使插入片段与表达载体中的基因处于相同的阅读框架？如何证明插入基因的转录方向是相同的？ HindIII PstI BamHI PstI BamHI HindIII pA kb pB 0.5 2.5

72 Tcr（当有外源DNA插入， 该基因失活） XbaI片段
8. 为了检测绿豆核酸酶对5’-端突起的单链DNA切割是否准确有效，即该酶只除去单链而不损伤双链区。有一研究者设计了一套非常精巧的实验，其中一个实验是将一XbaI片段插入pBR322的Apr基因内的ScaI位点使该基因失活，然后再经一系列实验证明绿豆核酸酶的作用确实与预期的结果一致，你能否设计出这一套实验？(pBR322除含有Apr基因外，还含有Tcr基因)。 ScaI Tcr（当有外源DNA插入， 该基因失活） Apr Tcr XbaI片段 pBR322 9. 某研究者计划将具有限制酶BamHI粘性末端结构的一段低聚核苷酸分子插入到一载体的克隆位点区。现假设他已获得具有低聚核苷酸插入的重组质粒，他应做什么实验来检查插入片段的方向

73 Apr H SI B Xb S K E N Sp SI Sf GATCC G G CCTAG pA 图中字母代表的意义：N-NotI；Sp-SpeI；SI-SacI；Sf-SflI；H-HindIII；B-BamHI； Xb-XbaI；S-SalI；K-KpnI；E-EcoRI 10. 一DNA分子中有一个SmaI识别位点(CCCGGG), 现有一研究生想要将这识别位点顺序完全除去,现已知该位点及两侧的序列为ACCCGGGT,他应该如何设计实验? 11. 一研究者想在下列三种限制酶位点的BamHI中插入另外一段低聚核苷酸,该段低聚核苷酸中的限制酶位点如下所示, 要求获得的重组DNA分子的各种限制酶位点按一种方式排列, 他应如何设计实验分离到所需的DNA分子?

74 EcoRI BamHI HindIII BamHI SmaI SacI EcoRI PstI BamHI +
E B P E SI Sm B H  12. 如何使下列的限制酶识别位点由一种序列变为第二种, 或由第一种变为第三种? GATC GATATC GATCGATC； TCGA TCGCGA TCGCGCGCGA； Sau3AI EcoRV ClaI TaqI REII BssHI AAGCTT AAGCGCTT HindIII ThaI，HaeII 13.下图的质粒载体中的四环素抗性基因内有一BamHI位点, 一研究者想用体外缺失或插入的办法使BamHI位点消除, 并获得如图所示的重组质粒，他应如何设计此实验? 假定密码子的增减对基因的抗性无任何影响。 HindIII EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 位点消除 总长为9kb 0.5kb Tcr