基因工程 Gene Engineering 授课课时: 32学时， 考试方式: 笔试 上课地点: S1406（3-19周 第3周开始)

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1 基因工程 Gene Engineering 授课课时: 32学时， 考试方式: 笔试 上课地点: S1406（3-19周 第3周开始)
2018年11月17日星期六2时54分15秒 基因工程 Gene Engineering 授课课时: 32学时， 考试方式: 笔试 上课地点: S1406（3-19周 第3周开始) 任课教师:李晓玲博士，办公室，M1621 联系电话: , 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

2 通过本课程的学习，掌握基因工程的一些基本原理和基本操作技术等。 总成绩＝平时（20％）＋测验（30％）＋考试（50％）
2018年11月17日星期六2时54分15秒 课程要求 通过本课程的学习，掌握基因工程的一些基本原理和基本操作技术等。 总成绩＝平时（20％）＋测验（30％）＋考试（50％） 平时成绩(考查迟到、早退，课堂提问、讨论、遵守课堂纪律等方面) 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

3 教材和参考文献 楼士林等，基因工程，科学出版社，2002 吴乃虎，基因工程原理（第二版上、下册），科学出版社，1998
2018年11月17日星期六2时54分15秒 教材和参考文献 楼士林等，基因工程，科学出版社，2002 吴乃虎，基因工程原理（第二版上、下册），科学出版社，1998 张惠展编著，1999年出版，《基因工程概论》，华东理工大学出版社。 Watson, J .D et al. Recombinant DNA, W. H. Freeman and Company, New York, 2ed, 1992 Robert F. Weaver, Molecular Biology, 科学出版社, 2000（影印版） 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

4 本课程内容 第一章 绪论 第二章 基因克隆的工具酶 第三章 基因工程的载体 第四章 目的基因的制备 第五章 目的基因导入和重组子的筛选
2018年11月17日星期六2时54分15秒 第一章 绪论 第二章 基因克隆的工具酶 第三章 基因工程的载体 第四章 目的基因的制备 第五章 目的基因导入和重组子的筛选 第六章 外源基因的表达 第七章 基因操作的基本技术 第八章 植物基因工程及应用 第九章 动物基因工程及应用 第十章 医学基因工程及应用 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

5 第二章 基因工程的工具酶 2.1 核酸酶 2.3 连接酶 2.4 聚合酶 2.5 修饰酶 2.2 甲基化酶
2018年11月17日星期六2时54分15秒 第二章 基因工程的工具酶 2.1 核酸酶 2.2 甲基化酶 2.3 连接酶 2.4 聚合酶 2.5 修饰酶 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

6 2.1 核酸酶 限制性核酸内切酶 2.1.1 限制性核酸内切酶的类型 2.1.2 限制性核酸内切酶的命名法
2018年11月17日星期六2时54分15秒 2.1 核酸酶 限制性核酸内切酶 2.1.1 限制性核酸内切酶的类型 2.1.2 限制性核酸内切酶的命名法 2.1.3 限制性内切酶的识别序列 2.1.4 限制性内切酶的切割位点 2.1.5 限制性内切酶的切割方式 2.1.6 限制性核酸内切酶的反应体系 2.1.7 限制性核酸内切酶的星活性 2.1.8 限制性核酸内切酶对DNA的消化作用 2.1.9 限制性核酸内切酶酶切注意事项 单链核酸内切酶; DNA酶I; RNA酶A; 核酸外切酶 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

7 几乎所有的生物都能合成自身所需要的酶，包括许多病毒。
2018年11月17日星期六2时54分15秒 几乎所有的生物都能合成自身所需要的酶，包括许多病毒。 酶参与所有生命活动过程，其在细胞内的分布、含量、活性等随生物生长、发育及外界条件的改变而改变。 Ribozyme：具有催化能力的RNA。酶不都是蛋白质。 定义：由活细胞产生，能在体外和体内起同样催化的一类具有特殊空间结构的生物大分子，包括蛋白质和核酸等。 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

8 限制性内切酶（Endonucleosase）的发现
2018年11月17日星期六2时54分15秒 限制性内切酶（Endonucleosase）的发现 50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制－修饰，它们由三个基因位点所控制：hsd R, hsd M, hsd S, 十年后，人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理： 　　hsd R---限制性内切酶 　　hsd M---限制性甲基化酶 　　hsd S---控制两个系统的表达 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

9 2018年11月17日星期六2时54分15秒 1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶，Hind II和Hind III，为基因工程技术的诞生奠定了基础。 截止到目前为止，已经分离出400余种II类酶，搞清识别位点的有300种，商品化的约有100种，而实验室常用的有20种 。 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

10 限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease)概念：
2018年11月17日星期六2时54分15秒 限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease)概念： 是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。 是生物细胞内限制性修饰系统的一部分，防 止外源DNA的入侵。 限制酶是一种必不可少的工具酶，是进行DNA分子切割的特殊工具。因此它有“分子剪刀”或“分子手术刀”之称。不是在所有的生物的细胞中都发现有限制性核酸内切酶，目前发现有限制性核酸内切酶的生物主要是细菌，在少数霉菌和蓝藻中也发现有限制性核酸内切酶。 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

11 2.1.1 限制性核酸内切酶的类型 Hsd S－识别特定DNA序列 Hsd M－甲基化 Hsd R－限制性内切酶功能
2018年11月17日星期六2时54分15秒 三类：I型、II型、III型。 I类：最早发现，能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近切割双链，但切割序列没有专一性。3个亚基： Hsd S－识别特定DNA序列 Hsd M－甲基化 Hsd R－限制性内切酶功能 三个亚基组成复合体，全酶才有活性。 biochemistry：need ATP, Mg++ , long sequences ( nt) , at random unspecial, can’t be used in genetic engineering 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

12 Hsd M－甲基化 Hsd R－限制性内切酶功能 III类：识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。
2018年11月17日星期六2时54分15秒 III类：识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。 2个亚基组成： Hsd M－甲基化 Hsd R－限制性内切酶功能 需要ATP、Mg2+，类似于 I 应用同样受限制。 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

13 2018年11月17日星期六2时54分15秒 II类：识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断。因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶。 应用最广，酶最简单(Mg2+)，不需要特殊条件 具有两个亚基： Hsd M－甲基化 Hsd R－限制性内切酶功能 切割特异 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

14 2018年11月17日星期六2时54分15秒 2.1.2 限制性核酸内切酶的命名法 用属名第一个字母和种名的头两个字母组成的3个字母斜体的略语表示寄主菌的物种名以及菌株（型）的代号命名。该菌株（种）中发现的不同的酶按照顺序以罗马字母编号I, II, III等。如：Escherichia coli 用Eco表示。第四个字母代表菌株或株型、变种名，若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。例：Hind III 从流感嗜血菌株（Haemophilus Influenzue）d 株中分离的第三个酶。EcoR I 表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上。 H.O.Smith and D.Nathans(1973)年提议的命名系统 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

15 first letter(genus), next two letters(species)
2018年11月17日星期六2时54分15秒 derivation： first three names from the latin names of the microorganism that produces them. first letter(genus), next two letters(species) writing：前三个字母用斜体，其他用正体表示。 如果酶存在于一种特殊菌株中，三个字母后加上菌株名称符号,名称最后部分往往包含罗马数字,表示在该特殊菌株中发现这种酶的先后次序。 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

16 指限制性内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列 专一 通常4～6个特定的核苷酸对组成
2.1.3 限制性内切酶的识别序列 2018年11月17日星期六2时54分15秒 识别序列 指限制性内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列 专一 通常4～6个特定的核苷酸对组成 迴文结构(palindromic sequence) 或旋转对称或二重互补对称 粘末端(cohesive end)：DNA分子末端的单链片段能与其他DNA单链片段互补配对形成双链者，这两个DNA分子末端单链片段即为粘末端 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

17 * ↑ recognition sequence:
2018年11月17日星期六2时54分15秒 recognition sequence: cleave DNA symmetrically in both strands at short palindromic (symmetrical) recognition sequences to leave a 5’-phosphate and a 3’-OH. They leave blunt ends, or protruding 5’- or 3’-termini. EcoRⅠ: ↓ * 5＇G A A T T C 3＇ 3＇C T T A A G 5＇ * ↑ 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

18 5＇ GTT AAC 3＇ HpaⅠ blunt end 3＇ CAA↓TTG 5＇
2018年11月17日星期六2时54分15秒 recognition sequence enzymes 5＇ GTT AAC 3＇ HpaⅠ blunt end 3＇ CAA↓TTG 5＇ 5＇ G↓AATTC 3＇ EcoRⅠ 5’protruding end 3＇ CTTAA↑G 5＇ 5＇ A↓AGCTT 3＇ Hind Ⅲ 5’protruding end 3＇ TTCGA↑A 5＇ 5＇ G↓GATCC 3＇ BamHⅠ 5’protruding end 3＇ CCTAG↑G 5＇ 5＇ CTGCA↓G 3＇ PstⅠ 3’protruding end 3＇ G↑ACGTC 5＇ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

19 2018年11月17日星期六2时54分15秒 识别序列在DNA上出现的概率 1/4n（n＝识别序列核苷酸组成的数目） Sau3A 4 碱基酶, 则每隔256(44) bp会出现一个识别位点。 EcoR I、Pst I 6碱基酶，则每隔4096 (46) bp会出现一个识别位点。 Not I (8bp)= 1/ ，稀切酶 （rar cutters）: 指识别序列长和识别序列富含GC或富含AT的限制性核酸内切酶。 仅是理论推测 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

20 同裂酶(isoschizomer)或异源同工酶:不同来源的限制酶可切割同一靶序列BamH I 和Bst I具有相同的识别序列GGATGC
2018年11月17日星期六2时54分15秒 同裂酶(isoschizomer)或异源同工酶:不同来源的限制酶可切割同一靶序列BamH I 和Bst I具有相同的识别序列GGATGC 同尾酶(isocaudiners)：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。两个同尾酶形成的黏性末端连接之后，一般情况下连接处不能够再被其任何一种同尾酶识别。如： BamH I 识别序列：GGATCC Bgl II 识别序列： AGATCT 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

21 远距离裂解酶(distant cleavage)：识别位点与切割位置不一致。如： Faq I GGGAC (10/14)
2018年11月17日星期六2时54分15秒 远距离裂解酶(distant cleavage)：识别位点与切割位置不一致。如： Faq I GGGAC (10/14) 5'-GGGACNNNNNNNNNNNNNNNN-3' 3'-CCCTGNNNNNNNNNNNNNNNN-3' 可变酶：识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的。如：BseJ I GATNNNNATC Subset酶：一种酶的识别序列包含于另一些酶的识别序列之中。如：Ehe I GGCGCC Hin6I GC GC 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

22 切割位点：DNA在限制性核酸内切酶的作用下，两条链断开的位置。
2018年11月17日星期六2时54分15秒 2.1.4 限制性内切酶的切割位点 切割位点：DNA在限制性核酸内切酶的作用下，两条链断开的位置。 一般在识别序列的内部或两侧附近。 以或  表示。 环状DNA分子上某个限制性内切酶有n识别位点，完全切割得到n个DNA片段。 线性DNA分子，则会得到n+1个DNA片段。 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

23 2018年11月17日星期六2时54分15秒 Restriction digests digestion of plasmid or genomic DNA,for analytical or preparative purposes, using commercial enzymes and buffer solutions. All RE require Mg2+,usually at a concentration of up to 10mM,but different enzymes require different pHs,NaCl concentrations or other solution constituents for optimum activity. 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

24 2.1.5 限制性内切酶的切割方式 交错切割（staggered cut）:
2018年11月17日星期六2时54分15秒 交错切割（staggered cut）: DNA双链断开的位置对称地分布在识别序列中心位置的两侧，使切割后的DNA末端为单链突出的黏性末端。如：BamH I -GGATG C- -C CTACG- 平切割： DNA双链断开的位置处在识别序列的对称中心，使切割后的DNA末端为平齐的平末端。 如：Nsb I TGC  GCA 识别序列核苷酸为奇数，切割总是产生黏性末端 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

25 粘性末端 和平末端 粘性末端 (cohesive terminus/sticky ends)：
2018年11月17日星期六2时54分15秒 粘性末端 和平末端 粘性末端 (cohesive terminus/sticky ends)： DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。 3’粘性末端： 3’ 突出的黏性末端（DNA末端的3’端比5 ’长） 5 ’粘性末端： 5’ 突出的黏性末端（DNA末端的5’端比3 ’长） 平末端（blunt ends）： DNA片段的末端是平齐的。 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

26 同尾酶（isocaudamer） 指来源不同，识别序列不同，但可以产生相同黏性末端的限制性内切酶。
2018年11月17日星期六2时54分15秒 同尾酶（isocaudamer） 指来源不同，识别序列不同，但可以产生相同黏性末端的限制性内切酶。 两个同尾酶形成的黏性末端连接之后，一般情况下连接处不能够再被其任何一种同尾酶识别。如： BamH I 识别序列：GGATCC Bgl II 识别序列： AGATCT 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

27 2.1.6 限制性核酸内切酶的反应体系 2.1.6.1 底物DNA 2.1.6.2 酶量 2.1.6.3 反应缓冲液
2018年11月17日星期六2时54分15秒 2.1.6 限制性核酸内切酶的反应体系 底物DNA 酶量 反应缓冲液 反应温度 影响限制性核酸内切酶活性的因素：a. DNA的纯度，b.DNA的甲基化程度，c.反应温度，d. DNA的分子结构，e.核酸内切限制酶的缓冲液 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

28 2018年11月17日星期六2时54分15秒 底物DNA 进行大量酶切时，先要确定 RE 的浓度。一般 1U RE 于 37 ℃条件下作用底物 DNA 1h 以上可切割 1 μ g DNA 。一般来说，要用 2 ～ 3 倍才能保证完全消化，对基因组 DNA 尤其如此。 酶切基因组 DNA 是否完全可通过紫外观察结果来判断，如看到 DNA 片段呈均一递减的一条区带，则表示酶切完全。 进行大量酶切时，先要确定 RE 的浓度。一般 1U RE 于 37 ℃条件下作用底物 DNA 1h 以上可切割 1 μ g DNA 。一般来说，要用 2 ～ 3 倍才能保证完全消化，对基因组 DNA 尤其如此。 酶切基因组 DNA 是否完全可通过紫外观察结果来判断，如看到 DNA 片段呈均一递减的一条区带，则表示酶切完全。 DNA上识别序列的侧面序列：PCR引物设计时，所加酶切位点的末端要加几个保护碱基；有例外：Sal I and Spe I等识别序列两侧不加保护碱基，同样可以被识别和切割。 DNA浓度常为50ul内含1ug DNA 水稻基因组的EcoR I酶切 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

29 在酶的最适反应条件下，在50μl容积中，60分钟内完全切割1g DNA所需的酶量为1个酶活性单位（unit 或U）
2018年11月17日星期六2时54分15秒 酶量 根据酶的活性和DNA底物的量而定。 限制性核酸内切酶活性单位定义： 在酶的最适反应条件下，在50μl容积中，60分钟内完全切割1g DNA所需的酶量为1个酶活性单位（unit 或U） 与DNA分子上识别位点的密度有关： 密度大用酶量多；密度小用酶量少。 实际的实验中所用的植物等DNA分子比DNA分子要大，且复杂的多，所以实际使用的酶量往往大于理论估算值。 常用酶量：酶和底物比例为2~10u/ugDNA 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

30 2.1.6.3 反应缓冲液 Tris-HCl or Tris-HAc MgCl2 or MgAc2 KAc or NaCl
2018年11月17日星期六2时54分15秒 反应缓冲液 Tris-HCl or Tris-HAc MgCl2 or MgAc2 KAc or NaCl 二硫基苏糖醇(DTT) or -巯基乙醇(ME) 牛血清白蛋白(BSA) pH 7.5~8.0 at 37C 有些需加BSA。对于那些在不同的反应缓冲液中有较高活性的内切酶，较利于进行双酶切。 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

31 2.1.6.4 反应温度和时间 大多数限制酶的反应温度为370C。
反应温度和时间 2018年11月17日星期六2时54分15秒 大多数限制酶的反应温度为370C。 个别特殊的内切酶则需要在300C 、500C、600C或650C的温度下进行切割。 反应时间：一般在适宜的缓冲液和温度条件下，每微克DNA用1~5单位的酶，保温1~2小时。 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

32 指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的DNA片段的现象。
2018年11月17日星期六2时54分15秒 2.1.7 限制性核酸内切酶的星活性 星活性（star activity）： 指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的DNA片段的现象。 易产生星活性的内切酶用*标记。如：EcoR I* 商品限制性内切酶保存在50％甘油中 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

33 2018年11月17日星期六2时54分15秒 引起星活性的原因：若使用buffer不當, 會有star activity，而star activity是指限制酶對所作用的DNA及序列失去專一性, 當酶辨認切割位置的能力降低，導致相似的序列或是錯誤的辨認序列長度也會作用，而產生錯誤的結果。所以當DNA同時以兩種限制酶處理時，選擇可使兩種酶之活性反應均可達75﹪以上的restriction buffer，若找不到適當的buffer則先加低盐的buffer使其中一酶作用後，在加入高盐buffer使另一酶作用，若無法以鹽的高低分別加入不同的buffer，則先加入一種buffer作用後，加3M NaOAc/95﹪alcohol沉澱DNA，再加另一種buffer作用。 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

34 底物位点优势效应: 酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同
2018年11月17日星期六2时54分15秒 2.1.8 限制性核酸内切酶对DNA的消化作用 单酶切: 加单一酶 双酶切:加两种酶 部分酶切: 一般通过控制酶切时间, 使DNA部分酶切 底物位点优势效应: 酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

35 2.1.9 酶切注意事项 选择正确的酶 DNA的纯度和浓度
2018年11月17日星期六2时54分15秒 2.1.9 酶切注意事项 选择正确的酶 DNA的纯度和浓度 反应体系甘油的量<5%（酶保存在50％甘油中，故所加酶液体积最多为酶切反应总体积的1/10）。 酶保存在－200C；使用时在冰浴上操作。 反应体系各成分都加完后，再加酶。 每次取酶液用新的枪头，防止交叉污染。 酶切样品多时，可先取一定量的酶液，稀释后再分装。 防止任何可能引起酶蛋白变性的因素，如：气泡、去污剂等。 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

36 2.2 甲基化酶 在专一位点上甲基化，与限制性内切酶相对应。
2018年11月17日星期六2时54分15秒 2.2 甲基化酶 在专一位点上甲基化，与限制性内切酶相对应。 （一）大肠杆菌中的甲基化酶 　　dam甲基化酶: 可在5'GATC3'序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，这样可使一些识别顺序中含有5'GATC3'的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA如Bcl I（TGATCA），但BamH I（GGATAA）则不会因为N6A的甲基化而失去活性，因为这两种酶对底物的特异性不同。 　　dcm甲基化酶 此酶在序列5'CCAGG3'或5'CCTGG3'中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响的限制性内切酶是EcoR II。 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

37 2018年11月17日星期六2时54分15秒 （二） 甲基化酶在基因工程中用途 　　许多II类限制性内切酶，都存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，封闭酶切位点，从而使其免受切割。如：M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的甲基转移到EcoR I识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使DNA免受EcoR I的切割。 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

38 2.3 DNA连接酶 (DNA ligase) 2.3.1 E. coli 和T4 DNA连接酶 2.3.2 DNA片段之间的连接
2018年11月17日星期六2时54分15秒 2.3 DNA连接酶 (DNA ligase) 2.3.1 E. coli 和T4 DNA连接酶 2.3.2 DNA片段之间的连接 具黏性末端的DNA片段之间的连接 具平末端DNA片段之间的连接 DNA片段末端修饰后进行连接 DNA片段加连杆（linker）后的连接 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

39 用途：具有修复单链或双链的能力,在DNA重组、复制和损伤后的修复中都起关键作用。
2018年11月17日星期六2时54分15秒 DNA连接酶（DNA ligase） 来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，催化双链DNA片段紧靠在一起的3‘羟基末端和5 ’磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键。 用途：具有修复单链或双链的能力,在DNA重组、复制和损伤后的修复中都起关键作用。 提取：许多原核和真核生物及病毒中。 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

40 E. coli DNA ligase和T4 DNA连接酶
2018年11月17日星期六2时54分15秒 E. coli DNA ligase和T4 DNA连接酶 E.coli DNA ligase: Mr=74000, 作用于5'端带磷酸基团的DNA底物 NAD+可促进该催化反应 分子克隆使用不多，亦不能连接RNA。 用途: cDNA第二链合成。 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

41 一条多肽链(Mr=68000)，还可作用于 RNA,但效率低得多,需ATP作辅因子。日常用的最多。
2018年11月17日星期六2时54分15秒 T4 DNA ligase: 一条多肽链(Mr=68000)，还可作用于 RNA,但效率低得多,需ATP作辅因子。日常用的最多。 T4 RNA ligase: 由噬菌体编码 催化单链DNA或RNA连接。 主要用途是对RNA进行3＇末端标记 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

42 一般较好连接，直接加入缓冲液和T4 DNA连接酶就可以完成。
2018年11月17日星期六2时54分15秒 具黏性末端的DNA片段之间的连接 一般较好连接，直接加入缓冲液和T4 DNA连接酶就可以完成。 教材p77 图示 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

43 连接效率较粘性末端低，尽量避免采用。加入缓冲液和T4 DNA连接酶就可以完成。
2018年11月17日星期六2时54分15秒 具平末端DNA片段之间的连接 连接效率较粘性末端低，尽量避免采用。加入缓冲液和T4 DNA连接酶就可以完成。 教材p78图示 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

44 2018年11月17日星期六2时54分15秒 affecting factors T：多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15℃以下,然而保持连接酶活性的最适温度却是37℃, 因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷。经常采用12.5℃（4-15℃）。 DNA concentrations：外源片段浓度比载体DNA浓度高10-20倍 防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体 time：O/N better 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

45 DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，也称人工接尾法：在末端核苷酸转移酶的催化下，在连接处的末端分别加上AAA，另一端加上TTT。
2018年11月17日星期六2时54分15秒 DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，也称人工接尾法：在末端核苷酸转移酶的催化下，在连接处的末端分别加上AAA，另一端加上TTT。 粘性末端修饰成平末端后进行连接：一端是粘端，另一端是平端。 DNA片段5’端脱磷酸化作用后连接：防止自身连接环化。 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

46 2.3.2.4 DNA片段加连杆（linker）后的连接
2018年11月17日星期六2时54分15秒 DNA片段加连杆（linker）后的连接 连杆/衔接物（linker）：化学合成的8～12个核苷酸组成的寡核苷酸片段。以中线为轴两边对称，其上有一种或几种限制性核酸内切酶的识别序列，酶切后可产生一定的粘性末端，便于与具有相同粘性末端的另一DNA片段连接。 衔接头/接头（adaptor）：化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制性核酸内切酶识别序列。其一端或两端具有一种或两种内切酶切割产生的黏性末端。 都具平末端的两种DNA片段的加连杆的连接 分别具平末端和粘性末端的两种DNA片段的加连杆的连接 分别具非互补粘性末端的两种DNA片段加连杆的连接 教材p66；吴乃虎p144,146 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

47 2.4 聚合酶 2.4.1 DNA聚合酶 2.4.2 反转录酶 2.4.3 RNA 聚合酶 11/17/2018 2:54:15 PM
2018年11月17日星期六2时54分15秒 2.4.1 DNA聚合酶 2.4.2 反转录酶 2.4.3 RNA 聚合酶 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

48 2.4.1 DNA聚合酶 (DNA polymerase)
2018年11月17日星期六2时54分15秒 E.coli （全酶） DNA聚合酶I Klenow片段 T7 DNA聚合酶 Taq DNA 聚合酶 性质 53聚合酶 35外切酶 53外切酶 无小亚基活性 聚合速度和持续合成能力强 耐高温 持续合成能力高 用途 缺口翻译法合成放射性标记的探针 使粘性末端转换为平末端 随机引物法合成放射性标记探针 修补3隐蔽的粘性末端为平末端 DNA 3末端标记 cDNA第二链的合成 测序酶 PCR DNA酶I 产生单链缺口 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

49 2.4.2 反转录酶 (reverse transcriptase)
2018年11月17日星期六2时54分15秒 依赖RNA的DNA聚合酶（RNA-dependent DNA polymerase） 最常见的商用反转录酶：来源于禽类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）。 AMV反转录酶具有反转录酶活性和RNaseH活性 反转录酶活性可以单链RNA或DNA为模板，以寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷[olig(dT)]或随机寡聚脱氧核苷酸为引物合成同模板序列互补的互补链。但DNA指导的DNA聚合酶特性，不具有35外切酶活性，聚合时无校正功能。 RNaseH具有核酸外切酶活性，能以53或35方向特异地降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链。 最主要的用途：以mRNA为模板合成cDNA。 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

50 2.4.3 RNA 聚合酶 (RNA polymerase)
2018年11月17日星期六2时54分15秒 2.4.3 RNA 聚合酶 (RNA polymerase) 以DNA为模板合成mRNA，不需引物，但必须有启动子。 常用的RNA聚合酶来源与SP3、T3和T7噬菌体。 用途：RNA探针的合成。 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

51 2.5 修饰酶 2018年11月17日星期六2时54分15秒 末端转移酶(terminal deoxynucleotidyl trasnferase/terminal transferase)：不依赖于DNA的DNA聚合酶，来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3端增加一个或多个脱氧核苷酸。 T4多核苷酸激酶(bacteriophage T4 polynucleotide kinase) (next page) 碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase):(next page) Topoisomerase改变共价闭合双链DNA分子的结构 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

52 T4多核苷酸激酶(bacteriophage T4 polynucleotide kinase)：
2018年11月17日星期六2时54分15秒 激酶:对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。 用途： 放射性标记DNA链的5'末端，探针标记 Maxam-Gilbert化学法的DNA序列分析；使缺少5＇磷酸的DNA片段和合成接头磷酸化。 该酶很难纯化,酶制品经常不纯。 铵离子是该酶的强烈抑制剂,处理前,DNA不能溶解于含铵盐的缓冲液中。 低浓度的磷酸也可抑制该酶活性。 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

53 碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase):
2018年11月17日星期六2时54分15秒 磷酸酶：去除核酸末端磷酸基团的酶。 细菌碱性磷酸酶(BAP)：E.coli中分离 牛小肠碱性磷酸酶(CIP)： 牛肠道分离，切除DNA、RNA和dNTP上的5＇磷酸基团, 从DNA片段上除去5＇磷酸以防自身连接。 BAP活性更高, 对热和去污剂抗性更强,因此脱磷酸化后很难完全抑制BAP活性。 除去CIP可用蛋白酶K降解 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

54 nuclease 以核酸为底物的水解酶 按底物专一性分：RNase、DNase、非专一性核酸酶 按作用位点分：内切或外切酶
2018年11月17日星期六2时54分15秒 nuclease 以核酸为底物的水解酶 按底物专一性分：RNase、DNase、非专一性核酸酶 按作用位点分：内切或外切酶 5‘-核酸酶或3’-核酸酶 常用:BAL31核酸酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、RNaseA RNaseT1、DNaseⅠ、外切核酸酶Ⅲ、λ噬菌体 外切核酸酶等。 许多核酸酶兼有内切和外切活性 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

55 核酸酶的分类 内切酶 外切酶 ─3＇-核酸酶 核酸酶─ 内切酶─ ─5＇-核酸酶 ──RNA─ ─专一性─ 非限制性 ── 内切酶─ 限制性
2018年11月17日星期六2时54分15秒 核酸酶的分类 内切酶 ──非专一性── 外切酶 ─3＇-核酸酶 核酸酶─ 内切酶─ ─5＇-核酸酶 ──RNA─ ─专一性─ 非限制性 ── 内切酶─ 限制性 ──DNA─ ──外切酶 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！

56 2018年11月17日星期六2时54分15秒 复习思考题 1.名词解释： 限制性核酸内切酶；回纹结构；同尾酶；同裂酶；黏性末端；平末端；限制性核酸内切酶的酶活性单位（U）；限制性核酸内切酶的星活性；连杆（linker）；衔接头（adaptor） 2. 限制性核酸内切酶反应体系的组成是什么？ 3. 引起限制性核酸内切酶星活性的可能因素有哪些？ 4. DNA片段之间的连接方式有哪些？ 5. DNA聚合酶、RNA聚合酶、反转录酶、末端转移酶、多核苷酸激酶和碱性磷酸酯酶有哪些主要特性？它们在基因工程中的主要用途分别是什么？ 11/17/2018 2:54:15 PM 欢迎2011级生物科学班同学们听课！ 欢迎02级农业生物技术班同学们听课！