实验四 感受态细胞的制备与质粒DNA的转化

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1 实验四 感受态细胞的制备与质粒DNA的转化
一、实验原理 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Competent cells)。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。

2 1、感受态细胞的制备 所谓感受态， 就是细菌吸收转化因子的生理状态。
关于感受态的本质与存在，说法很多， 目前主要有两种假说： １．局部原生质体化假说－－感受态细胞的表面形成一种能接受ＤＮＡ的酶位点， 使ＤＮＡ分子能进入细胞。

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4 CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本原理是：细胞处于 0 ～ 4 ℃， CaCl2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（ Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。

5 （一）CaCl2 转化法 核心：目标细胞在 CaCl2·H2O 溶液中浸泡一段时间， 转化效率 107-109 cell/gD 。 NE
（一）CaCl2 转化法 核心：目标细胞在 CaCl2·H2O 溶液中浸泡一段时间， 转化效率 cell/gD 。       NE.coli: DH5, TG1, XL-1Blue, JM105    （1）冰上 30min    （2）热激 42℃ 90“    （3）恢复 1～2min    （4）复苏 37℃ min （二）原生质体转化法（protoplast） 适用于 G+ 细菌，特别是芽胞杆菌、酶母。 过程：    （1）等渗环境下，脱细胞壁（Lysozyme）     （2）细胞壁再生 （三）电转化法（electroporation） 缓冲液：10% 甘油或蔗糖，含（或不含） Mg2+ 离子。 转化条件：2.5 KV/0.2cm 25F 。

6 2.转化 ＤＮＡ分子转化分以下几步: １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面；
２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解； ３． 自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成双链； ４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。

7 3.重组子的筛选 抗生素筛选法 这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关， 原则上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株；
２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法： 抗生素筛选法 互补法

8 １．抗生素筛选法 菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。
本实验利用抗生筛选转化子。

9 ２、互补法 现在使用的许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。 受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。当外源基因插入时，二者溶为一体后，有β－半乳糖苷酶表达， 在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 通过颜色不同而区分重组子和非重组子。

10 二、材料、设备及试剂 菌种 ：E. coli DH5a（空）、 E. coli K12（空）
设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机， 涡旋振荡器 试剂：LB液体培养基 、 0.1mol/L CaCl2 、 Amp

11 一、感受态细胞的制备 （一）、受体菌的培养 （二）、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 1、将1.5ml（每人）培养液转入离心管中, 于4℃下3000g离心10分钟。 2、弃去上清,用预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液1ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。 3、弃去上清,加入200μl预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。 4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。

12 实验结果：下次实验观察并分析筛选结果 二、 转化 1、取200μl感受态细胞悬液置冰上。
2、加入1-10ulDNA,轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。 3、42℃水浴中热击2min，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。 4、向管中加入1ml LB液体培养基,混匀后37℃振荡培养45min-1小时。 5、将上述菌液摇匀后取200μl 涂布于含Amp的筛选平板上,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。 对照： 另取未转化感受态细胞分别涂布筛选平板（Amp终浓度50ug/ml）和空白平板 实验结果：下次实验观察并分析筛选结果

13 四、注意事项 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 　　1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。

14 四、注意事项 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。 　　

15 四、注意事项 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。

16 五、质粒DNA转化常见问题 问题一：转化后无克隆产生 对 策 原因 使用高效率的感受态细胞（106以上） 感受态细胞低效
复查质粒抗性，使用正确的抗生素 转化后温浴45min左右，让抗性基因得以表达。 感受态细胞低效 抗生素使用错误 转化后立即涂板忘记温浴 对 策

17 问题二：实验组只有白色菌落（没有蓝色菌落）
五、质粒DNA转化常见问题 问题二：实验组只有白色菌落（没有蓝色菌落） 原因 检查平板是否含有IPTG/X-Gal 以及是否新鲜,如平板有问题，重新制备新鲜平板 复查抗生素的抗性 用于制备感受态的菌株，传代次数不能太多（20代以内为佳） 未加IPTG/X-Gal或其失效 抗生素失活，敏感菌亦能生长 用于制备感受态的菌株退化，丢失了某些重要因子 对 策

18 六、问题与讨论 1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？ 2.如阴性对照中长出菌，原因？
3.还有哪些方法可以将外源基因导入受体细胞？各有什么优缺点？

19 图2 图1 如果转化成功，由于质粒DNA上带有Amp抗性基因导致本来Amp敏感的菌株也可以在含有Amp的LB固体培养基上生长，如图1。如转化不成功则Amp敏感的菌株和阴性对照不会在含有Amp的LB固体培养基上生长，如图2。