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细胞与分子生物学实验 细胞与分子生物学教学实验室 776533分机
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实验的目地 The goal of the lab course is to give you the opportunity to develop basic experimental skills through project based learning. Each laboratory experiment is designed to solve a problem and to allow you time to understand the material in greater depth. You will read scientific literature, design and modify procedures, analyze data and present conclusions.
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实验课安全注意事项 做好个人防护（穿戴），禁止室内饮食； 实验过程中正确操作，仪器使用、试剂拿取等注意安全；
做好实验垃圾的分类、分置（有毒有害）； 别太在意结果，自己不一定做得出好的结果。 有自己的分析、思考必有加分。
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实验课的要求 做好实验前的预习； 每个步骤知道怎么做，两人合作，规范操作。 实验结果分析和思考题巩固实验原理、试剂用途。
保持安静，禁止喧哗，不得做与实验无关的事情； 保持实验室的整洁，保持工作面的整洁； 禁止虐待小动物； 按时、认真完成实验报告； 独立思考、独立分析、独立完成实验报告；
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课 程 安 排 9次实验操作（3次细胞+6次生化） 最后课程考试（实验操作考+实验理论考） 总分=平时操作、实验报告+课程考试成绩
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实验成绩 总分=平时成绩（50%）+课程考试成绩（50%） 课程考试成绩：实验操作考+实验理论考 平时成绩： 9×（实验操作+实验报告）
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细胞生物学实验 生物化学四大基本技术 分子生物学实验 1，2，3、（p80、实验25、实验27 ） 4、电泳技术（实验1） 5、蛋白质提取
6、层析技术（实验5、6） 7、分光光度法（p133） 离心法（实验9、10） 分子生物学实验 8，9、（ p111DNA提取、实验15）
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显微镜的使用 细胞形态观察 《细胞培养技术》录像
实 验 一 显微镜的使用 细胞形态观察 《细胞培养技术》录像
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光学显微镜基本结构 接口 目镜 物镜 推进器 载物台切片夹 聚光器 粗细调节 照明灯
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物 镜 的 符 号 放大倍率指示色带： 红色—4X 黄色—10X 绿色—20X 浅蓝色—40X 蓝色—60X 白色—100X 生产厂家
色差矫正 （复消色差） 平场矫正 数值孔径 1.40 放大倍率 观察的介质 油镜 特殊观察方式 筒长 （无限远系统） 工作距离 0.21mm 放大倍率指示色带 蓝色—60倍 盖玻片厚度 (0.17mm) 弹簧物镜 保护装置
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显微镜的使用及注意事项 用右手握住镜臂，左手托镜座--------双手拿 左眼看，右眼看纸绘图---------两眼都要用
物镜选用：低----高----油，必须在卡口上 目镜调节：由最低向上调，先粗后细 聚光镜光度调节，光圈的大小调节 放置玻片标本时,应注意标本的正反，把要观察的部分对准通光孔的正中央。 粗、细调节器都不能做单方向的旋转，如一直下降会压碎玻片标本。 显微镜用后，应转动粗调节器使载物台下降,取下玻片,并转动旋转盘,使物镜离开聚光镜,然后上升载物台使物镜接近镜台；目镜、物镜、反光镜等用擦镜纸擦拭干净。
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作图要求 2~3个细胞即可 只用点和线表示深浅与明暗 线条光滑均匀，点圆而均匀 标注部分用直尺引出平行细线 注字一般置于右侧
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植物细胞有丝分裂：洋葱根尖切片 前期：染色质→染色丝→染色体 中期：形成赤道板。 后期：着丝粒纵裂为二。
末期：出现细胞板、染色体解旋成染色质。
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前期(prophase) 前期开始的第一个特征是染色质开始浓缩(condensation)形成染色体(chromosome）
第二个特征细胞骨架解聚，有丝分裂纺锤体(mitotic spindle)开始装配,高尔基体、内质网等细胞器解体，形成小的膜泡 形态最复杂，变化最丰富
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中期(metaphase) 所有染色体排列到赤道板(Metaphase Plate)上,标志着细胞分裂已进入中期。
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后期(anaphase) 排列在赤道面上的染色体的姐妹染色单体分离产生向极运动，着丝粒分散
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末期(telophase) 染色单体到达两极，即进入了末期,到达两极的染色单体开始去浓缩。 核膜开始重新组装。
核仁也开始重新组装，RNA合成功能逐渐恢复。
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荧光显微镜的使用 荧光显微镜的原理、构造 荧光显微镜与普通光学显微镜不同，它不是通过普通光源的照明观察标本，而是利用一定波长的光(通常是紫外光、蓝紫光)激发显微镜下标本内的荧光物质，使之发射荧光，所以，荧光显微镜的光源所起的作用不是直接照明，而是作为一种激发标本的内荧光物质的能源。我们之所以能观察标本，是由于在光源的照明下， 标本内荧光物质吸收激发的光能后所呈现的荧光现象。 由此可知，荧光显微镜的特点，主要是它的光源能供给大量特定波长范围的激发光，使受检标本内的荧光物质能获得必要强度的激发光。同时，荧光显微镜必须具备相应的滤光镜系统。 它是由超高压光源、滤片系统、光学系统和摄影系统等主要部件组成。
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徕卡DMI3000B倒置荧光显微镜 （1）－投射电源开关 （2）－聚光器 （3）－载物台 （4）－物镜 （5）－调焦操纵轮
10 11 4 6 （1）－投射电源开关 （2）－聚光器 （3）－载物台 （4）－物镜 （5）－调焦操纵轮 （6）－透射光档片 （10）－载物台操纵轮 （11）－ CCD光路 活动杆
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徕卡DMI3000B倒置荧光显微镜 （2）－聚光器 （3）－载物台 （4）－物镜 （5）－调焦操纵轮 （7）－荧光独立电源
8 9 （9）－荧光转盘 （7）－荧光独立电源 （8）－荧光光栅拉杆 （2）－聚光器 （3）－载物台 （4）－物镜 （5）－调焦操纵轮
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徕卡DMI3000B倒置显微镜操作步骤 明 场： 1．打开右下方显微镜透射光电源（1）。
明 场： 1．打开右下方显微镜透射光电源（1）。 2．设置聚光器（2），若只需要普通的明场观察，将聚光器设置为“BF”。 若需进行相差观察，按所选择的物镜放大倍数将聚光器设置为“PH1” (10×、20×)或“PH2” (40×)。 3．将所需观察的标本置于载物台上（3）。 4．选择你要用的物镜（4） (4×、10×、20×、40×)。 5．利用调焦操纵轮（5）聚焦和观察图像。 6．若尚需采集图像，见操作步骤13“图像采集操作”。
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徕卡DMI3000B倒置显微镜操作步骤 荧 光： 7．在明场观察之后，若还需进行荧光观察，可关闭显微镜透射光电源或上拨上方“Stop”档片（6），挡住透射光，并同时打开荧光独立电源（7） 。 8．打开左侧荧光光栅拉杆（8），使荧光光路打开。 9．转动荧光转盘（9），选择合适的荧光激发滤块(1、2: 空白 3:A蓝色 4:I3绿色 5:N2.1红色)。 10．选择你要用的物镜(4×、10×、20×、40×)。 11．利用调焦操纵轮，聚焦和观察图像。 12．若尚需采集图像，见操作“图像采集操作”。
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采集图像：（用徕卡 LAS(Leica Application Suite)采集图象）
13．打开电脑，启动WindowsXP系统，双击LAS图标。 14．在聚焦清晰的状态下打开右侧活动杆（11），使光路通过CCD至电脑。此时可从电脑屏幕上看到图像。 15．点击“获取”→“摄像头”，调整各项参数(如曝光时间等)。 16．点击“获取图像”，命名文件并将文件保存至硬盘。 17．如果要采集同一个视野下的明场和荧光图像，需保证显微镜透射光电源和荧光独立电源均处于开的状态，通过调节Stop”档片，可在聚焦清晰的状态下先关闭左侧荧光光栅拉杆（8），采集明场的图像，保存。然后上拨“Stop”档片，挡住透射光，拉出左侧荧光光栅拉杆（8），使荧光光路开通，采集荧光图像，保存。
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注意事项 • 不要频繁开关荧光电源，打开后至少使用半小时才能关闭；关闭后至少半小时才能重新打开(确保汞灯冷却，汞灯寿命约200小时)。
• 保持显微镜各部件(如载物台)的整洁，目镜、物镜、聚光镜等光学部件表面有灰尘时，应先用洗耳球吹掉，再用擦镜纸蘸乙醚:乙醇(7:3)混合液由内向外螺旋形轻轻擦拭干净。 • 用后关闭显微镜电源、电脑，登记使用情况。 • 每次使用后，应待仪器（电源、灯等）冷却，再用防尘罩盖上显微镜和附件。
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实验结果观察及分析 荧光蛋白转染效率观察 10X
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实验结果观察及分析 明场观察 10X
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实验结果观察及分析 荧光下观察 10X
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实验结果观察及分析 荧光蛋白显微观察 20X
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《细胞培养技术》 规范操作 设备与器材 培养液的除菌与无菌试验9’48” 无菌操作12’34” 细胞的原代培养14’32” 细胞的传代培养26’08” 细胞的冻存30’52” 细胞的复苏41’28”
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细胞培养和虚拟实验操作 先看视频，再进行虚拟实验的操作。贴壁和悬浮细胞的传代培养。
先看视频，再进行虚拟实验的操作。贴壁和悬浮细胞的传代培养。
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